葡萄酒釀造中降解生物胺乳酸菌的篩選、鑒定及其特性

徐佳敏，周桂珍，田曉菊*

1(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川，750021) 2(寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川，750021)

生物胺是一類主要存在于發(fā)酵食品中具有生物活性的低分子堿性含氮化合物[1]。在食品或葡萄酒發(fā)酵過程中，相應(yīng)的微生物利用前體物質(zhì)氨基酸脫羧形成生物胺[2-3]。作為許多生物大分子的前體物，適量的生物胺可以提高人體免疫力，有增強(qiáng)血管活性等生理作用[4]。但過量攝入生物胺，可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性作用(頭痛、低血壓、心悸、嘔吐)，具體表現(xiàn)取決于個(gè)人的敏感性[5-6]。

葡萄酒酒精發(fā)酵過程中，存在著甲胺、乙胺、苯乙胺、異戊胺和尸胺等胺類物質(zhì)[7-8]，但在此發(fā)酵過程中，這些生物胺能夠被微生物降解；而在蘋果酸乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation，MLF)過程中，生物胺主要來源于乳酸菌對(duì)葡萄酒中游離氨基酸的脫羧作用[9]。目前，控制發(fā)酵食品中生物胺的方式主要為優(yōu)化生產(chǎn)工藝以及高壓、冷凍等物理方法[10-12]，但這些方法具有一定的局限性，無法控制發(fā)酵過程中生成的生物胺。研究發(fā)現(xiàn)，如果生物胺已經(jīng)存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，或當(dāng)生物胺的產(chǎn)生基于本地微生物群落時(shí)，胺降解菌株的應(yīng)用將有助于降低這些風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。因此，通過接種具有生物胺降解功能的乳酸菌來控制葡萄酒MLF過程中產(chǎn)生的生物胺是有效的手段。而從乳酸菌中篩選出具有生物胺降解菌株，不僅避免了生物胺積累的風(fēng)險(xiǎn)，還可作為發(fā)酵劑應(yīng)用于多種發(fā)酵食品中，以及作為益生菌可在人體中發(fā)揮益生功能，同時(shí)為探究生物胺降解機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室自釀葡萄酒、白酒酒醅，寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

氨基酸：鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸(均為分析純)，上海阿拉丁試劑有限公司。

生物胺標(biāo)準(zhǔn)品：組胺、精胺、亞精胺、尸胺，上海源葉生物科技有限公司；色胺、腐胺、酪胺(純度均≥98%)、丹磺酰氯(純度≥99%)，西格瑪奧德里奇中國公司。

試劑：K2HPO4、KH2PO4、無水乙酸鈉、NaCl(均為分析純)；乙腈、甲醇(均為色譜級(jí))；丙酮(分析純)，天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.2 培養(yǎng)基的制備

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉 4.0，葡萄糖 20.0，乙酸鈉 5.0，檸檬酸二銨 2.0，吐溫-80 1.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.04，pH 調(diào)至5.5。

生物胺顯色培養(yǎng)基[15](g/L)：MgSO40.4，MnSO40.3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04，檸檬酸三銨2，CaCO30.1，K2HPO42，5-磷酸吡哆醛2，維生素B10.01，氨基酸(組氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)1，溴甲酚紫 0.06，pH 調(diào)至5.5。

以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

W-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器、BSD-150生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；PHSJ-3F型 pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PR224ZH電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；WH-861渦旋振蕩器，太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；EX30生物顯微鏡,舜宇光學(xué)科技有限公司；5430R高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司；Agilent 1260高效液相色譜儀、C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm )，美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 降生物胺乳酸菌的篩選

1.2.1.1 初篩

分別稱取適量酒醅和葡萄酒酒樣于100 mL無菌生理鹽水中，于37 ℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)30 min。吸取懸浮液并梯度稀釋至10-6，然后吸取100 μL適宜梯度的稀釋液分別均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)32～48 h，選取乳酸菌相似形態(tài)菌株，進(jìn)行劃線分離并純化，保存。

將純化菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL，預(yù)先在96孔無菌板中加入1 mL生物胺顯色培養(yǎng)基，吸取100 μL菌液，轉(zhuǎn)接于96孔無菌培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，以不接種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。觀察培養(yǎng)基顏色的變化，顯棕紅色或紫色的為陽性(產(chǎn)胺菌)，不變色即黃色為陰性(不產(chǎn)胺菌)，設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。將陰性菌落挑出，在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上劃線分離純化3次，然后于4 ℃保藏備用。

1.2.1.2 復(fù)篩

將初篩菌株接于MRS液體培養(yǎng)基中活化2～3代，并調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL，按接種量2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種至含6種生物胺的MRS液體培養(yǎng)基中，以不接種菌株的含生物胺MRS液體培養(yǎng)基為空白組。將培養(yǎng)液37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。24 h后于10 000 r/min離心5 min取上清液，采用高效液相色譜法測定生物胺含量，并與空白組進(jìn)行對(duì)照，選取降解生物胺種類多且降解能力好的菌株作為生物胺降解菌株。生物胺降解率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：ρ0，對(duì)照中生物胺濃度，mg/L;ρ1，反應(yīng)后生物胺濃度，mg/L。

1.2.2 生物胺含量的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》，將質(zhì)量濃度為1 mg/mL生物胺(尸胺、腐胺、組胺、色胺、精胺、酪胺)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用0.1 mol/L鹽酸稀釋定容，配制為100 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。將上述使用液梯度稀釋為2.5、10、15、25、50 mg/L的生物胺系列溶液，按照衍生方法衍生后測定。

1.2.2.2 生物胺降解率的測定

衍生方法參考文獻(xiàn)[16-17]，將含生物胺的菌株培養(yǎng)液8 000 r/min離心5 min，取上清液，精確吸取1 mL待測樣液，依次加入0.2 mL的NaOH溶液(2 mol/L)使反應(yīng)液呈堿性，0.3 mL的飽和NaHCO3緩沖液，及2 mL丹磺酰氯衍生溶液(10 mg/mL)。漩渦振蕩60 s后置于40 ℃水浴鍋中，避光反應(yīng)45 min，期間每15 min取出漩渦振蕩60 s，加入100 μL氨水終止反應(yīng)，并于室溫下避光靜置25 min后用乙腈定容至5 mL，5 500 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜待測。

1.2.2.3 高效液相色譜條件

色譜分離條件參考徐潔[18]的方法，色譜柱為Agilent 5 TC C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為乙腈，B為超純水，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速0.8 mL/min，紫外檢測波長254 nm。洗脫程序如表1所示。

表1 HPLC測定生物胺的洗脫程序Table 1 Elution procedure of biogenic amines by HPLC

1.2.3 降生物胺乳酸菌的鑒定

將活化菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h；4 ℃，8 000 r/min離心10 min獲取菌泥，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取菌株DNA，采用通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)對(duì)生物胺降解菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR純化后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對(duì)，以確定菌株種屬。

1.2.4 降生物胺乳酸菌的降解特性研究

1.2.4.1 降生物胺乳酸菌的生長曲線及其產(chǎn)酸能力

將活化兩代的菌液以2%接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，每2 h測定菌株在600 nm波長下OD值及pH值，設(shè)置空白對(duì)照組，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 降生物胺乳酸菌酸耐受性及降解生物胺能力的測定

將菌株于MRS液體培養(yǎng)基中活化，以2%接種量分別接種于pH為3.5、4、4.5、5的生物胺混合培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，在600 nm波長下測定其OD值。5 500 r/min離心5 min，取上清液1 mL過0.22 μm濾膜待測。

1.2.4.3 降生物胺乳酸菌乙醇耐受性及降解生物胺能力的測定

將菌株于MRS液體培養(yǎng)基中活化，以2%接種量分別接種于乙醇含量為8%、10%、12%的生物胺混合培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，在600 nm波長下測定其OD值。5 500 r/min離心5 min，取上清液1 mL過0.22 μm濾膜待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用高效液相色譜法測定6種生物胺，從圖1可以看出，6種生物胺在37 min內(nèi)得到了很好的分離，并依此確定各生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。

1-腐胺；2-尸胺；3-組胺；4-酪胺；5-精胺；6-色胺圖1 六種生物胺混合液相色譜圖Fig.1 The mixed liquid chromatogram of six biologenic amines standard

6種生物胺通過高效液相色譜法，以生物胺濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表2所示，6種生物胺在1～50 mg/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均>0.99。

表2 六種生物胺回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations and R2 of six biogenic amines

2.2 降生物胺乳酸菌的篩選

2.2.1 降生物胺乳酸菌的初篩

通過MRS固體培養(yǎng)基從酒樣與酒醅中共篩選出74株疑似乳酸菌菌株，將其分別接種于生物胺顯色培養(yǎng)基，初步篩選得到19株不產(chǎn)生生物胺(培養(yǎng)基未變色)的菌株，顯色反應(yīng)結(jié)果如圖2所示。

圖2 生物胺顯色反應(yīng)Fig.2 Color reaction of biogenic amines

2.2.2 降生物胺乳酸菌的復(fù)篩

將初篩得到的19株乳酸菌于添加生物胺的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，測定其生物胺降解率，結(jié)果見表3。菌株NXU-Q7、NXU-Q12對(duì)5種生物胺均可降解，對(duì)腐胺的降解能力差別不明顯。NXU-Q12對(duì)組胺和酪胺的降解能力顯著高于NXU-Q7，其在發(fā)酵液中對(duì)組胺降解率為23.11%，酪胺降解率為16.85%。因此確定NXU-Q12為降生物胺乳酸菌，進(jìn)行下一步的研究。

2.3 降生物胺乳酸菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株NXU-Q12在MRS固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢結(jié)果如圖3所示。菌落呈圓形、表面光滑、邊緣整齊，顏色呈奶黃色。革蘭氏染色結(jié)果為藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

將所得到的生物胺降解菌株測序結(jié)果通過NCBI中的BLAST進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。NXU-Q12與序列號(hào)為MZ571407.1的植物乳植物桿菌距離較近。因此，結(jié)合生物學(xué)形態(tài)與分子學(xué)鑒定可初步確定NXU-Q12為植物乳植物桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)。

表3 不同菌株生物胺降解率的結(jié)果Table 3 Degradation rate of biogenic amines by the different strains

a-菌落形態(tài);b-革蘭氏染色光學(xué)顯微鏡圖圖3 菌株NXU-Q12的形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Morphological characteristics of NXU-Q12

圖4 菌株NXU-Q12基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence constructed by NXU-Q12

2.4 降生物胺乳酸菌的降解特性研究

2.4.1 降生物胺乳酸菌的生長曲線及產(chǎn)酸能力

通過測定NXU-Q12在MRS液體培養(yǎng)基中24 h OD值可得到其生長曲線，并同時(shí)測定pH值確定其產(chǎn)酸能力。由圖5可知，菌株在0～2 h生長緩慢，在4 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，16 h生長趨于穩(wěn)定狀態(tài)；菌株pH值與生長狀態(tài)一致，初始階段呈迅速下降后趨于平緩。

圖5 菌株生長曲線和產(chǎn)酸能力Fig.5 Growth curve and acid producing capacity of the strain

2.4.2 降生物胺乳酸菌的耐酸性及其降解生物胺能力

分別在3、3.5、4、4.5、5的pH值條件下對(duì)NXU-Q12進(jìn)行研究，結(jié)果如圖6所示。NXU-Q12在不同pH值條件下均能生長，說明菌株具有一定的耐酸能力；但隨著pH值的減小，菌株的生長狀態(tài)呈下降趨勢，在pH值為5時(shí)，NXU-Q12的生長能力最好。

圖6 酸度對(duì)菌株生長的影響Fig.6 Effect of acidity on the growth of strain

不同pH條件下NXU-Q12生物胺的降解能力如表4所示，NXU-Q12在不同pH值對(duì)5種生物胺均有降解作用。當(dāng)pH為4.5時(shí)，菌株的生物胺降解率最高，對(duì)腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺的降解率分別為27.67%、25.00%、29.44%、27.96%、24.48%；在pH 3和3.5時(shí)，菌株降解能力呈下降趨勢，其原因可能是在偏酸環(huán)境下菌株雖然具有一定的生長活性，但其氧化酶活性可能受到抑制，從而導(dǎo)致無法有效地降解生物胺[19]。

表4 不同pH條件下菌株生物胺降解能力Table 4 Biogenic amines degradation ability of strains under different pH conditions

2.4.3 降生物胺乳酸菌耐乙醇能力及降解生物胺能力

分別在8%、10%、12%、14%的乙醇濃度條件下對(duì)NXU-Q12菌株進(jìn)行研究，結(jié)果如圖7所示。NXU-Q12在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)生長最好，與其他濃度差異明顯；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%～14%時(shí)，菌株濃度呈下降趨勢，說明菌株活性受到乙醇的影響。其原因可能是當(dāng)乙醇達(dá)到一定濃度時(shí)，滲透于微生物細(xì)胞膜內(nèi)，使細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變；而當(dāng)濃度超過一定范圍后，會(huì)使細(xì)胞膜滲透壓發(fā)生改變，從而使菌株活性降低。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長的影響Fig.7 Effect of ethanol content on the growth of strain

不同乙醇條件下NXU-Q12生物胺的降解能力如表5所示，隨著乙醇濃度逐漸升高，菌株生物胺降解率逐漸降低。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，NXU-Q12對(duì)5種生物胺的降解率均高于20%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時(shí)，NXU-Q12對(duì)5種生物胺的降解率均低于11%。在高乙醇濃度條件下，菌株的生長能力降低，胺氧化酶活力降低甚至于失活，從而致使其降解率降低。GARCA-RUIZ等[2]研究發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇濃度的升高，乳酸菌降解生物胺的能力受到抑制，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下菌株生物胺降解能力Table 5 Biogenic amines degradation ability of strains under different ethanol conditions

3 結(jié)論

從葡萄酒酒樣和白酒酒醅中通過生物胺顯色實(shí)驗(yàn)和高效液相色譜法測定，篩選得到可降解生物胺的菌株共7株，以菌株降解生物胺的能力為指標(biāo)，從中篩選得到1株降解生物胺能力較強(qiáng)的乳酸菌(NXU-Q12)，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為植物乳植物桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)，并對(duì)其生長特性和在不同環(huán)境條件下降解生物胺的能力進(jìn)行研究。結(jié)果表明，該菌株在不同的pH和乙醇濃度條件下均可生長且具有降解生物胺的能力，但在pH為3～4.5和乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%～14%條件下，其生長活性與降解生物胺的能力同時(shí)受到抑制，這也與目前一些研究結(jié)果一致[20-21]。通過研究不同環(huán)境條件下的菌株生長特性及降解生物胺的能力，對(duì)葡萄酒MLF過程中生成的生物胺進(jìn)行控制具有一定的參考價(jià)值。