腸外致病性大腸桿菌研究

吳桐忠，張倩，張星星，鐘發(fā)剛，何延華，韓猛立，黃新

（新疆農墾科學院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000）

雖然大腸桿菌（Escherichia coli）數量豐富且多數是共生的，但是仍有許多菌株具有致病性。E.coli除了作為腸道感染病原體的既定作用外，部分強毒株還會引起腸外感染。腸外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenicE.coli，ExPEC）因其數量迅速增加而對抗生素的高度耐藥使其變得重要。ExPEC感染與免疫缺陷有關，主要包括年幼（新生兒）、老年、化療或削弱免疫系統的疾?。℉IV）。因此，作為一種醫(yī)源性病原體，ExPEC是獲得性感染的主要病原。在任意給定的時間內，每100名住院患者中，發(fā)達國家有7人，發(fā)展中國家至少有10人，每年治療衛(wèi)生保健相關感染的費用約為200億美元［1］。

ExPEC可以引起人和動物的感染，如APEC（禽致病性大腸桿菌）、UPEC（引起尿路感染的大腸桿菌=UTI）、NMEC（引起新生兒腦膜炎的大腸桿菌）或敗血癥［2，3］。O2血清型E.coli是引起APEC的病原，也是引起UTI的常見病原，O18血清型E.coli可以引起禽敗血癥和人類新生兒腦膜炎［4，5］，UPEC通常引起敗血癥。人和動物菌株之間的相似性也可以在基因組水平上表征［6，7］，多位點序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）表明眾多從新生兒腦膜炎中分離出的E.coliO78血清型菌株與禽類敗血癥分離株歸為一類。ExPEC引起動物和人感染之間的相似性，增加人畜共患病發(fā)生的可能性；而這種可能性很難證明，需要考慮到通過ExPEC污染的食品轉移抗藥性的可能性［8］。

在已報道的宿主特異性的病例中，似乎涉及黏附的特異性。這種特異性在人腸道E.coliO78血清型臨床分離株中得到體現，產生人特異性的黏附菌毛CFA/I，并特異性與腸上皮細胞結合；同時這種特異性黏附在動物中也有顯現，如從羔羊敗血癥中分離出P、S和F1C黏附蛋白或K99菌毛［1］，禽大腸桿菌病O78分離株編碼禽特異性菌毛（AC/I菌毛，屬于S-菌毛組）。

本研究將討論ExPEC涉及的主要感染類型、毒力因子以及抵御感染的潛在手段。

1 ExPEC涉及的相關感染

1.1 禽大腸桿菌性敗血癥

禽大腸桿菌性敗血癥是家禽的重要疾病之一，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經濟損失。其特點是禽類在應激條件下（如高溫、高濕或輕度病毒感染即使是接種疫苗）均可引起發(fā)病。該病始于上呼吸道，細菌進入血液在體內擴散并感染重要器官，且具有很高的發(fā)病率和死亡率，部分感染（約80%）是由O1、O2和O78血清型引起的，其他血清型也可引起感染［5，9-11］。

1.2 牛羊幼畜細菌性敗血癥

ExPEC是引起牛羊幼畜發(fā)病的主要細菌性病原之一，導致新生幼畜敗血癥［12］。2015—2019年，從新疆部分（特別是石河子及周邊地區(qū)）地區(qū)的發(fā)病牛羊養(yǎng)殖場感染的腸外組織（肺、腦、淋巴結、脾、肝等）分離出132株ExPEC，并進行了血清型、毒力、耐藥性研究和綜述［13，14］，表明主要血清型為O101、O154、O65；與韓和祥［15］報道的四川省規(guī)?；馀ｐB(yǎng)殖場致犢牛腹瀉大腸桿菌的血清型基本一致，與宋曉莉［16］報道的江蘇省部分地區(qū)肉羊源大腸桿菌O抗原存在較大的差異；優(yōu)勢種系群為A和B1群，MLST分型主要為ST10、ST23和ST457。耐藥性研究表明，對β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和喹諾酮類藥物耐藥率較高且呈多重耐藥，獸醫(yī)臨床較難選擇有效的抗生素進行治療和防控，有演化成超級細菌的趨勢。

1.3 新生兒腦膜炎

引起新生兒腦膜炎的大腸桿菌（NMEC）主要血清型包括O1、O18、O78［17，18］，其發(fā)病率在發(fā)展中國家是千分之一，在發(fā)達國家是萬分之一。

1.4 尿路感染（UTI）

ExPEC是最常見的尿路感染病原體［19，20］。2007年美國因ExPEC引起的尿路感染門診病例約有1 000萬人次，約有200萬人次急診入院［19］。年輕女性感染較多且易復發(fā)，老年患者在插入導管后也會引起感染，且尿路感染會產生后遺癥，如導致腎功能衰竭及引起血液感染如敗血癥等［21，22］。

1.5 血液感染、敗血病及膿毒癥

美國每年有超過100萬例的敗血癥病例，死亡率約30%，比美國因前列腺癌、乳腺癌和艾滋病死亡的總和還要高。膿毒癥是一種威脅生命的系統性炎癥，是由血液中微生物引發(fā)的［1，23，24］。

2 毒力因子

ExPEC與其他腸道菌株相比，產生外毒素并不是其主要毒力因子，ExPEC可以產生細胞毒素，但尚不清楚它們對致病性是否重要［25］。ExPEC的毒力取決于它們在宿主組織尤其是血清中的存活能力，許多與毒力相關的基因存在于大質粒上，最常見于ColV質粒［10，26］；ColV質粒是一個相關的質粒家族，編碼鐵攝取系統和增加基因在血清中的存活率。

ExPEC的毒力相關基因存在廣泛的變異性，這類基因似乎有一個很大的“基因庫”，而且它們之間有很多重疊，如鐵的獲取有多個遺傳系統，一個Ex-PEC可以攜帶其中一個或多個；對編碼菌毛或黏附因子基因也是如此。毒力因子是通過基因橫向轉移獲得編碼耶爾森菌素的基因，耶爾森菌鐵攝取系統［10］所有的ExPEC菌株至少攜帶一個黏附系統，而敗血癥菌株至少攜帶一個有效的鐵結合系統和血清存活基因（ISS增加血清存活率）［1］。

2.1 黏附

對宿主細胞的黏附是E.coli感染的第一步，對入侵和感染至關重要；黏附也影響宿主特異性，甚至組織特異性。因此，腸道病原體優(yōu)先黏附于腸上皮，而參與UTI的細菌則黏附于膀胱上皮［27］。黏附主要取決于特定細胞器-纖毛或菌毛-識別上皮細胞的特定配體。牛、羊、豬等哺乳動物的感染始于E.coli在新生幼畜的腸道定殖，通常涉及K99和K88菌毛；AC/I菌毛僅在APEC中發(fā)現，且對雞氣管上皮具有特異性。在UTI與敗血癥的菌株中，最常見是結合含有α-D-Gal-1、4-β-D-Gal糖脂的P菌毛，結合b-GalNac-1、4-bGal的F1C菌毛和S-家族的菌毛；S-家族的菌毛包括SfaI、SfaII、Foc和AC/I。Sfa菌毛黏附素由敗血癥和新生兒腦膜炎相關菌株產生，并與含唾液酸的糖蛋白相互作用。研究表明，基因水平轉移和基因重組導致S-菌毛具有不同黏附特異性，該特異性與臨床癥狀或宿主相關。sfaAII基因（NBM菌株）與AC/I菌毛（APEC）的facA基因同源，而編碼黏附的sfaIIS基因與人敗血癥菌株的sfaI基因同源。菌毛基因的重組增加菌毛多樣性，以提高對不同宿主的適應性和抵抗宿主免疫系統的能力。ExPEC菌株表達不止一種類型的菌毛，而菌毛基因的表達似乎是協調的，對增加菌毛多樣性和在不斷變化環(huán)境條件下增加存活率也很重要［1］。

2.2 三型分泌系統（TTSS）

三型分泌系統是一種針狀結構，用于向宿主細胞分泌效應蛋白。腸道致病性大腸桿菌（尤其是LEE系統）的TTSS已經被很好的描述。ExPEC菌株不具有LEE系統，但具有同源基因簇-ETT2=大腸桿菌三型分泌系統，類似于沙門氏菌的SPI1致病島。它存在于人和動物養(yǎng)殖場的大多數EXEC菌株中［28］。然而，ETT2基因簇攜帶大量突變和缺失，甚至尚不清楚有多少菌株表達ETT2基因。到目前為止，還沒有證據表明ETT2系統是一個分泌系統，因為沒有檢測到分泌蛋白［29］。然而，在大腸桿菌O157∶H7中，ETT2系統編碼影響LEE基因簇中基因表達的調控因子，在禽大腸桿菌O78中，ETT2系統影響運動［30］。大腸桿菌O78-9的ETT2系統是簡并的，因為它攜帶一個大的缺失和幾個點突變。然而，它對毒力和血清抗性至關重要［10，28］。研究表明，ETT2對細胞表面具有全局性影響，并參與鞭毛和菌毛的分泌、外膜囊泡的產生和多細胞行為［31］。

3 逃避免疫反應

ExPEC菌株對含有抗體和補體的血清具有高抗性。補體復合物通過在細胞膜上形成孔來介導直接殺傷。病原體進化出抑制補體依賴性殺傷的外表面特征，如脂多糖和莢膜，這是參與血清抗性的重要因素［32］。

3.1 脂多糖

完整的脂多糖對ExPEC的血清存活和致病性至關重要。然而，由于敗血癥涉及大量LPS血清型，因此對于特定的血清型似乎沒有優(yōu)勢。O-抗原鏈的長度也是影響血清抗性水平的重要因素之一。

3.2 莢膜

大腸桿菌產生的莢膜根據其組成和生物合成分為4類。第1、2和3組莢膜已被廣泛研究，它們是由寡糖重復單元組成的酸性多糖，其在毒力中的作用已被證實［33］。第4組（也稱為“O抗原莢膜”）的莢膜最近才被研究并證明有助于腸致病性大腸桿菌抵抗人α-防御素5［34］從而保護腸道內膜，腸致病性大腸桿菌三型分泌系統促進宋內志賀菌向周圍器官擴散［35］。敗血性大腸桿菌菌株產生莢膜多糖，對在血清中生存很重要。O78型敗血癥性大腸桿菌能產生O抗原莢膜（第4組莢膜），這種莢膜對血清存活至關重要［36］。在禽O78血清型ExPEC菌株中，莢膜多糖對毒力的重要作用是當一個移位阻止莢膜合成，從而導致毒力降低［37］。此外，參與第4組莢膜生物合成的etp基因精確缺失導致了血清敏感性［1］。因此，O抗原/第4組莢膜顯然也是血液中細菌傳播和敗血癥的關鍵毒力因子。

3.3 ISS增加血清存活率

對禽致病性大腸桿菌的研究表明ColV質粒中存在一個基因具有血清抗性，該基因稱為iss，可提高血清存活率，編碼一種小膜蛋白；該基因與源自λ噬菌體的E.coliK-12的bor基因同源；iss基因是血清存活的主要因素［10］；然而，尚不清楚其在血清存活中作用的分子基礎。此外，從ColV質粒中刪除iss基因會導致血清敏感性，并且無法與iss（bor）染色體基因互補［10］。

4 逃避營養(yǎng)免疫

細菌要在血清中存活，必須克服宿主的先天性免疫，主要是補體系統的作用。然而，另一個障礙是血清的營養(yǎng)免疫，這是由于營養(yǎng)素被束縛在儲存分子中導致細菌無法獲得，最重要的是鐵的限制，鐵在血液中與人類蛋白質（如鐵蛋白、含鐵血黃素）結合。大多數ExPEC菌株含有參與鐵吸收的基因，很明顯鐵獲取系統和受體在敗血癥病原體的毒性中發(fā)揮關鍵作用。對敗血性細菌血清反應的系統分析表明，Fur基因誘導鐵代謝相關基因和參與控制鐵體內平衡調節(jié)［38］。多種鐵獲取系統的存在是必要的，但同樣重要的是它們在暴露于血清時的精確調節(jié)。因此，非致病性大腸桿菌K-12即使在補體系統被熱滅活的血清中生長也很差，并且其鐵代謝在暴露于血清后不會被誘導［39］。此外，引入敗血癥菌株的Fur基因后，細菌在血清（滅活）的情況下生長得更好［39］。

功能基因組分析表明，血清暴露會改變大量的基因表達，其中大部分基因即使在缺乏活性補體的情況下也會被誘導表達［28］。因此，克服營養(yǎng)免疫是維持血清存活和建立血液感染的關鍵步驟。

5 小結

隨著ExPEC危害程度的增加和研究的不斷深入，必須清楚認識到ExPEC難以應對的原因。首先，腸外感染涉及大量不發(fā)生交叉反應的血清型，血清型復雜性使得包含幾種菌株的簡單疫苗是不可行的，目前國內尚未見相關疫苗的研究報道。此外，如果有疫苗，應該由誰接種，因為在大多數情況下感染是機會性的，通常在醫(yī)療干預后很難確定高危群體。其次，ExPEC攜帶多種編碼抗藥性的基因，通常位于易在整個細菌種群中傳播的結合質粒上。此外，Ex-PEC大量存在于腸道中，在那里它們會遇到克雷伯菌和不動桿菌等，通過水平轉移獲得抗性基因。再者，尋找新的抗ExPEC靶標是一個真正的挑戰(zhàn)，因為許多與發(fā)病機理有關的基因具有重疊的活性，而抑制其中之一不足以預防感染。例如，為了克服血清中鐵的缺乏，ExPEC菌株編碼了幾種有效的鐵結合系統，其中大多數是通過水平基因轉移獲得的；為防止血清抵抗ExPEC，有必要抑制所有鐵獲取系統；最后細菌進入血液，感染進程就會非常快，細菌會到達重要器官，并達到很高的數量。由于大腸桿菌脂多糖的細胞膜含有內毒素，患者即使只受到死亡細菌內毒素的威脅，也會面臨嚴重的危險。

研發(fā)早期預警系統和確定開發(fā)藥物或疫苗的新目標是當前預防ExPEC的重中之重，對預防醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染患者顯得尤為重要。