Eps同源結(jié)構(gòu)域蛋白2在惡性腫瘤中作用研究進展

管程齊 綜述；張健鋒 審閱（南通大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，江蘇 南通 226001）

Eps 同源結(jié)構(gòu)域蛋白2（Eps15 homology domaincontaining protein 2，EHD2）是動力蛋白相關(guān)的EHDATPase 家族中的一員，是新型的膜轉(zhuǎn)運蛋白。這類蛋白具有高保留的EH 結(jié)構(gòu)域，其序列相似性約50%～60%，富含約100 個氨基酸殘基的片段，最早在上皮細(xì)胞生長因子受體的激酶底物Eps15 上被發(fā)現(xiàn)[1]，并且廣泛存在于植物和哺乳類動物中[2]。EHD2含有不同的功能區(qū)域，特異性調(diào)節(jié)功能體現(xiàn)在胞膜轉(zhuǎn)運的不同過程中，有調(diào)控循環(huán)通路的功能，和一些需要重塑或維持胞膜形狀的細(xì)胞過程密切相關(guān)，如內(nèi)吞循環(huán)、纖毛發(fā)生、骨骼肌T 管形成、質(zhì)膜修復(fù)、脂滴自噬等[3]。它還可通過不同方式與肌動蛋白細(xì)胞骨架相聯(lián)系，在細(xì)胞質(zhì)膜微囊和肌動蛋白細(xì)胞骨架的聯(lián)系中起積極作用，尤其是在穩(wěn)定質(zhì)膜微囊動力方面[4]。

轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤最重要的特征之一[5]，其與胞膜轉(zhuǎn)運密不可分[6]。胞膜轉(zhuǎn)運的協(xié)調(diào)性需一系列蛋白尤其是膜轉(zhuǎn)運蛋白的共同參與。當(dāng)EHD2 表達(dá)異常時，在膜及膜蛋白的各路循環(huán)調(diào)節(jié)、胞膜的轉(zhuǎn)運等過程中均會發(fā)生信號應(yīng)答失當(dāng)，各類細(xì)胞過程（如細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、胞質(zhì)分裂）出現(xiàn)紊亂，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。既往研究表明，EHD2 與各類惡性腫瘤，如乳腺癌[8]、肝癌[9]、食管鱗癌[10]、甲狀腺乳頭癌[11]、腎透明細(xì)胞癌[12]、骨肉瘤[13]等密切相關(guān)，參與調(diào)控腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲。本文就目前已報道的EHD2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機制、在疾病診療中的意義做一綜述，旨在為尋找新的腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點提供參考依據(jù)。

1 EHD2蛋白與腫瘤相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能特征

EHD蛋白家族包括3個區(qū)域：一個C端Eps同源結(jié)構(gòu)域，該特征性結(jié)構(gòu)具有正電荷靜電表面，能夠選擇性結(jié)合包含天冬酰胺-脯氨酸-苯丙氨酸（asn pro phe，NPF）基序的酸性殘基蛋白質(zhì)[14]；一個是中央非保守的連接區(qū)和非常保守的N端結(jié)構(gòu)域；一個是可以結(jié)合ATP并催化其水解的類似動力蛋白的G結(jié)構(gòu)域[7]。EHD家族具有高度的同源性，而其中序列同源性和功能差異最大的是EHD2[15]。與EHD1、EHD3、EHD4的囊狀膜定位形成鮮明對比，EHD2定位于質(zhì)膜的內(nèi)葉上，是最保守的EHD家族成員。它通過其C末端的EH結(jié)構(gòu)域和其N端結(jié)構(gòu)域相互作用，參與細(xì)胞骨架、膜的構(gòu)建和吞噬作用[16]。小鼠EHD2晶體結(jié)構(gòu)表明，在G結(jié)構(gòu)域附近的一個非結(jié)構(gòu)柔性環(huán)中包一個含有兩個脯氨酸-苯丙氨酸基序KPFRKLNPF，該區(qū)域部分保守，通過與鄰近的EH結(jié)構(gòu)域相互作用，將EHD2二聚體連接起來[16]。PF基序?qū)τ贓HD2的定位和功能非常重要[17]，在EHD2的雙PF基序促進其穿梭至細(xì)胞核，可能作為轉(zhuǎn)錄抑制器而阻礙腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄[18]。

2 EHD2的生物學(xué)功能

對于EHD2 的早期研究主要集中在肌發(fā)生和肌肉修復(fù)中的作用。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物心臟中EHD 家族成員均高表達(dá)，在小鼠骨骼肌和腎臟免疫組化染色中顯示EHD2 特異性定位在血管組織系統(tǒng)[20]，并且在脂肪、肺、骨骼肌、脾中表達(dá)均有增加[21]。Ferlin蛋白家族成員包含多個C2結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)蛋白之間以及蛋白和膜之間的相互作用，被認(rèn)為可以在修復(fù)位點促進囊泡的運輸和（或）融合，在肌發(fā)生和肌肉修復(fù)中起重要作用。而已有研究[22-23]證明，myferlin和Fer1L5 包含可以與EHD2 結(jié)合的NPF 基序,因此EHD2 與myoferlin 和Fer1L5 共定位于離散的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，是成肌細(xì)胞融合所必須的。在另一個使用激光損傷原代肌管的研究[24]中認(rèn)為，EHD2作為肌修復(fù)的新的參與者，除了EHD2外，dysferlin和外周膜結(jié)合擔(dān)保A1也被募集到膜愈合部位。雖然dysferlin不具有典型的NPF 基序，但是它包含一個NPxF 序列，并推測其與EHD2有相互作用。另外，F(xiàn)er1L5NPF基序的突變減少后并沒有減少與EHD2 的結(jié)合，這表明EHD2與ferlin蛋白的結(jié)合可能與其他相互作用模式有關(guān)[23]。這些研究提出了新的關(guān)于EHD2 促進膜聚合機制的問題。

定位在質(zhì)膜微囊中的內(nèi)源性EHD2，在細(xì)胞中具有多種功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞信號、膽固醇穩(wěn)態(tài)、內(nèi)吞作用等[25-26]，其蛋白質(zhì)組學(xué)分析首次確立了EHD2 可作為質(zhì)膜微囊組成成分[27]。對從脂肪細(xì)胞中分離出來的微囊進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，亦發(fā)現(xiàn)EHD2是微囊的成分[28-29]。多項研究[4,17]表明，內(nèi)源性的EHD2和質(zhì)膜微囊標(biāo)志共定位，并且確認(rèn)了EHD2在抑制質(zhì)膜微囊動力方面的作用。當(dāng)EHD2缺乏時，質(zhì)膜微囊會變得更具活力，顯示出更強的動力，繁殖能力增強[4,17]。EHD2 調(diào)節(jié)內(nèi)吞作用主要是水解與脂質(zhì)相連的核苷酸，并將它們降解為小管，影響膜的重建[30]。

在各種細(xì)胞類型中，免疫染色均顯示含有EHD2的結(jié)構(gòu)和肌動蛋白骨架有關(guān)。如，在損傷的肌肉纖維中，EHD2 與絲狀肌動蛋白在膜修復(fù)部位共定位[24]；在脂肪細(xì)胞中，EDH2 被發(fā)現(xiàn)存在于質(zhì)膜下的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中，且與皮質(zhì)肌動蛋白密切相關(guān)[21]；在成纖維COS-1細(xì)胞中，EHD2存在于富含肌動蛋白的膜褶皺中[21]，在絲狀偽足和微刺中EHD2均高表達(dá)[30]；在人成纖維細(xì)胞中，含有EHD2的質(zhì)膜微囊沿著肌動蛋白排列[4]。EHD2可通過不同方式與肌動蛋白細(xì)胞骨架相聯(lián)系，如通過肌動蛋白結(jié)合蛋白1（fascin actinbundling protein 1，EHBP1）。EHBP1 含有可以和EHD2 結(jié)合的5 個近似于NPF 的基序[21]。EHD2 還可以作用于Ras 相關(guān)C3 肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）基因來調(diào)節(jié)肌動蛋白的重構(gòu)[31]。EHD2 與絲氨酸/蘇氨酸激酶（Nek3）結(jié)合，可激活Vav 蛋白家族成員[32-33]。隨后Vav 蛋白反過來激活小RhoGTP酶，其中包括了Rac1。EHD2與Vav1 相關(guān)，過表達(dá)的EHD2 會導(dǎo)致Rac 活性降低，而Rac 蛋白是細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)鍵蛋白，因此EHD2在細(xì)胞骨架蛋白中發(fā)揮著重要作用。

綜上，EHD2 定位于質(zhì)膜微囊，在血管和肌肉細(xì)胞中，尤其是參與肌細(xì)胞的膜融合和再封閉中顯著表達(dá)；同時，它與肌動蛋白骨架形成密切相關(guān)，這些均提示EHD2是內(nèi)吞運輸及循環(huán)的關(guān)鍵媒介[4]。

3 EHD2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機制

內(nèi)吞作用與肌動蛋白細(xì)胞骨架的功能關(guān)系密切。而肌動蛋白骨架在各種細(xì)胞過程中均起到重要作用，如細(xì)胞黏附、細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞遷移、胞質(zhì)分裂等。近年來人們注意到，如果干擾EHD2表達(dá)水平使其降低，那么會明顯影響細(xì)胞的內(nèi)吞作用。EHD2不僅是在正常細(xì)胞過程起作用，而且在腫瘤發(fā)生過程中也具有潛在的作用。2006年，有研究[34]發(fā)現(xiàn)與對照組人類卵巢表面上皮相比，EHD2的表達(dá)在卵巢漿液性乳頭狀癌中下調(diào)了15 倍[34]。因此，在隨后的研究中EHD2 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用也受到越來越多的關(guān)注。

3.1 EHD2與細(xì)胞增殖

繼往研究[35]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中EHD2表達(dá)發(fā)生了缺失，而其表達(dá)的降低會促進乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖。EHD2 負(fù)性調(diào)控表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）的內(nèi)吞降解，使細(xì)胞增殖生長能力全面下降[36]。在人體食管癌組織標(biāo)本中同樣發(fā)現(xiàn)EHD2 表達(dá)下降，并且在食管癌TE-1 細(xì)胞系中干擾EHD2后，細(xì)胞生長速度加快[10]。但是在甲狀腺乳頭狀癌中，EHD2的表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān)，并且通過與激活細(xì)胞增殖相關(guān)的MAPK/ERK信號通路促進腫瘤進展[11]。研究[38]還發(fā)現(xiàn)，在肝癌中，EHD2 的缺失明顯降低了巨胞飲作用，減少了缺氧細(xì)胞的增殖。巨胞飲是內(nèi)吞的一種形式，由于腫瘤細(xì)胞急劇擴張及異常的血管微環(huán)境，腫瘤組織內(nèi)部常得不到充分的營養(yǎng)，細(xì)胞通過巨胞飲攝取生物大分子，提高細(xì)胞的資源利用率，它被認(rèn)為是癌癥中普遍現(xiàn)象[37]，但背后的調(diào)控機制尚不完全明確，該研究認(rèn)為EHD2 可以通過介導(dǎo)巨胞飲作用來促進細(xì)胞的生長，并且是缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）的轉(zhuǎn)錄靶點[38]。EHD2在不同腫瘤中的表達(dá)差異被認(rèn)為與腫瘤的異質(zhì)性相關(guān)。

3.2 EHD2與促血管生成

在三陰乳腺癌細(xì)胞（triple negative breast cancer,TNBC）中，EHD2 的表達(dá)與IL-8 具有較為密切的關(guān)系。事實上，IL-8 有很強的促血管生成作用，在很多實體腫瘤中上調(diào)，如前列腺癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌等[39-41]。有數(shù)據(jù)[42]證明，IL-8可能通過促血管生成的機制介導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生和進展，同時也是癌癥干細(xì)胞活動的重要調(diào)節(jié)因子。在TNBC 中發(fā)現(xiàn)，EHD2 的缺失會導(dǎo)致促血管生成的細(xì)胞因子IL-8 的表達(dá)水平升高，被認(rèn)為是抑制IL-8途徑的潛在靶點[43]。

3.3 EHD2與細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移

EHD2 因其參與內(nèi)吞循環(huán)過程被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切。在乳腺癌中，EHD2是乳腺上皮細(xì)胞極性維持的重要調(diào)節(jié)分子，F(xiàn)AK/PI-3K/Rac1/actin信號通路與控制細(xì)胞運動相關(guān)，F(xiàn)AK是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白的酪氨酸激酶，在細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)時被激活。FAK的磷酸化激活級聯(lián)激酶能夠促進細(xì)胞的運動[44]。在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)EHD2會導(dǎo)致FAK 顯著降低，抑制Rac1 的表達(dá)，從而降低E-cadherin水平來阻遏EMT進程，影響乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[8]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中EHD2可以通過Snail 蛋白誘導(dǎo)發(fā)生EMT，低表達(dá)的EHD2 可以促進膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。食管鱗狀細(xì)胞癌是一種高度侵襲性疾病，識別功能性轉(zhuǎn)移基因及其分子機制是熱點問題。在食管癌細(xì)胞中當(dāng)EHD2表達(dá)下調(diào)后，Ecadherin 表達(dá)下降，細(xì)胞遷移能力增加[10]。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，和腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMP2 和MMP9 是家族中兩個非常重要的分子，它們的活性賦予了腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的特征[45]。在腎透明細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)當(dāng)EHD2 過表達(dá)后會上調(diào)MMP2、MMP9 的表達(dá)，從而促進細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]，提示EHD2在不同類型腫瘤中可能表現(xiàn)出不同的生物學(xué)行為。

3.4 EHD2與細(xì)胞凋亡

Bcl2和Bcl2-associated X蛋白（BAX）是用來評價細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。在腎透明細(xì)胞癌組織中，當(dāng)EHD2過表達(dá)后會促進Bcl2，而抑制BAX的表達(dá)，阻礙細(xì)胞凋亡，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。與在其他腫瘤中表達(dá)有所差異，EHD2的表達(dá)水平較正常組織高明顯升高，降低EHD2的表達(dá)促進細(xì)胞凋亡而阻礙腎透明細(xì)胞癌的進展。但是研究中僅使用40例病例，因此認(rèn)為樣還需來進一步驗證其實驗結(jié)果[12]。還有研究[10]發(fā)現(xiàn)用順鉑處理轉(zhuǎn)染siEHD2的食管鱗癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對順鉑引起的凋亡產(chǎn)生抵抗。目前EHD2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的具體機制尚不完全明確，還需進一步的研究。

3.5 EHD2與相關(guān)基因的調(diào)控

骨肉瘤是一種常見的影響骨骼生長的原發(fā)性惡性腫瘤，多發(fā)生于25 歲以下的患者[46]。雖然先進的治療方法顯著提高了患者的保肢率和長期生存率，但是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險仍舊很高[47]。有研究[13]鑒定出EHD2 是與腫瘤相關(guān)的非編碼RNAMiR-197-3p 的下游靶基因，新型的IncRNA TUSC8在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)明顯下降，增強TUSC8 的表達(dá)會抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而促進細(xì)胞的凋亡。TUSC8 和MiR-197-3p 相互作用靶向EHD2 的表達(dá)，從而抑制骨肉瘤的進展。該研究是在體外細(xì)胞實驗完成的，在未來還需進一步在體內(nèi)實驗驗證這一研究結(jié)果。在乳腺癌中，EHD2是與癌細(xì)胞增殖相關(guān)的RCN1/PIGX/RCN2復(fù)合物的一個靶基因，研究[48]發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物能夠下調(diào)EHD2 的表達(dá)，并與EMT 的重要標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)水平呈正相關(guān)。在結(jié)腸癌中，轉(zhuǎn)錄因子上皮細(xì)胞特異性Ets 蛋白3（epitheliumspecific Ets protein 3，Ese-3）通過下調(diào)EHD2 和轉(zhuǎn)導(dǎo)INPP4B促進細(xì)胞增殖[49]。

4 EHD2在腫瘤防治中的意義

在食管鱗癌中，EHD2的表達(dá)和患者病理分級呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，EHD2表達(dá)越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力越強，提示EHD2低表達(dá)是食管鱗癌高惡性度的標(biāo)志物[10]；在乳腺癌中，檢測到EHD2的表達(dá)明顯減少，其表達(dá)水平和患者病理分級呈負(fù)相關(guān)，與總體生存率降低密切相關(guān)，是預(yù)后不良的標(biāo)志物[8]；在惡性漿液性卵巢癌中，EHD2呈低表達(dá)[34]，并可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤缺失染色體1.6Mb19區(qū)一個可能的抑癌基因[50]；在結(jié)腸癌組織中，EHD2表達(dá)下調(diào)提示患者預(yù)后不佳[51]；但是，在TCGA數(shù)據(jù)庫中，EHD2 mRNA的表達(dá)與更具侵襲性的變異、甲狀腺外延、pT與pN1分期晚期、高風(fēng)險復(fù)發(fā)呈正相關(guān)[54]；在甲狀腺乳頭狀癌浸潤前出現(xiàn)的細(xì)胞極性喪失而出現(xiàn)的EMT 現(xiàn)象被認(rèn)為和EHD2的表達(dá)升高密切相關(guān)[52-53]；在腎透明細(xì)胞癌中，抑制EHD2 會阻遏細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為有可能成為臨床治療的靶點[12]。綜上，EHD2的表達(dá)情況在不同腫瘤中雖不盡相同，但有望成為診斷及預(yù)測預(yù)后的一種指標(biāo)，對腫瘤患者的臨床治療及預(yù)后評估具有重要意義。

5 結(jié)語

隨著對EHD2研究的深入，其在生物體發(fā)育及惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機制不斷明了。一方面，EHD2在不同種類腫瘤中表達(dá)不同，參與調(diào)控腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲。另一方面，EHD2與腫瘤的臨床分期分級和預(yù)后密切相關(guān)，在腫瘤的診斷和預(yù)測評估中扮演重要角色。因此，探索并闡明EHD2的作用機制，不僅有助于尋找新的腫瘤生物學(xué)特征的標(biāo)志物，也可提高腫瘤的早期診斷、聯(lián)合治療、預(yù)后評估和減少復(fù)發(fā)提供思路。但EHD2 在腫瘤中的機制缺乏多中心大樣本的研究數(shù)據(jù)，尚需進一步研究闡明EHD2的上下游基因及其作用通路，為腫瘤的靶向治療提供更有價值的依據(jù)。