胃腸道間質(zhì)腫瘤：微環(huán)境特點及免疫治療思路

劉芳岑，王琴，李茹恬（南京大學醫(yī)學院 附屬鼓樓醫(yī)院.病理科；.腫瘤中心，江蘇 南京 210008）

胃腸道間質(zhì)腫瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的軟組織腫瘤[1]。最常見發(fā)生部位是胃及小腸[2]，常見轉移部位是肝臟和腹腔[3]。GIST 中約75%～80%的患者在KIT 基因的第9、11、13、14、17 外顯子突變[4]，5%～10%的患者在血小板衍生生長因子受體α（PDGFRA）基因的第12、14、18 外顯子中有突變[4]。GIST對于放化療的敏感性均較差，甲磺酸伊馬替尼（imatinib）是一種KIT 酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），是經(jīng)過FDA 批準的GIST 一線治療藥物，可顯著延長大約80%患者的中位OS和PFS[5]。盡管有良好的治療效果，但約有14%的GIST 患者對伊馬替尼具有繼發(fā)或原發(fā)耐藥性[6]。發(fā)生耐藥后，二三線治療藥物在短期有效后往往也會出現(xiàn)耐藥[7]。因此，開拓新的治療方法，是耐藥后GIST治療領域的迫切需求。

免疫治療一直是腫瘤領域重要的研究方向，在多種惡性腫瘤治療中取得了突破性進展，在GIST 領域，相關研究較少。近年來，GIST免疫治療逐漸得到廣泛關注。作為具有明確驅(qū)動基因突變的軟組織腫瘤，其生物學行為和治療模式與大多數(shù)癌癥相比均有顯著區(qū)別，了解其免疫微環(huán)境，是開展針對GIST免疫治療的基礎。在熟悉其免疫特點的同時，充分歸納免疫治療新技術在GIST領域的應用以及存在的不足，對于臨床醫(yī)生和相關研究者了解GIST 的免疫治療，把握未來的探索方向，具有重要的意義。

1 GIST的免疫微環(huán)境特征

由于免疫治療的迅速進展，腫瘤免疫微環(huán)境特征近年來引起了廣泛關注。腫瘤內(nèi)免疫細胞通過與周圍環(huán)境相互作用，增強免疫監(jiān)視作用并減緩免疫逃逸，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展并減少其轉移的發(fā)生[8]。與常見的上皮性腫瘤不同，GIST來源于間充質(zhì)的Cajal細胞，是具有明確驅(qū)動基因突變的軟組織腫瘤，其免疫微環(huán)境特點與其驅(qū)動基因突變類型密切相關。此外，GIST 的免疫微環(huán)境主要起免疫抑制作用，該特征有力地促進腫瘤轉移并影響了GIST預后。

1.1 突變基因類型影響免疫細胞構成

作為具有明確驅(qū)動基因突變的腫瘤，GIST 的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME)可能與驅(qū)動基因突變的類型密切相關。GIST 中KIT 突變頻率最高，為75%～80%，另外有5%～10%的GIST 細胞具有PDGFRA突變[9]。一項研究[9]納入75名GIST患者并進行RNA 測序發(fā)現(xiàn)，與KIT 突變的GIST 比較，PDGFRA 突變的GIST 組織中含有更多的CD8+T 細胞、NK 細胞及Treg 細胞。此外，PDGFRA 突變的GIST 組織中表達更高水平的趨化因子，如重組人趨化因子CXCL14（C-XC motif ligand 14），并表現(xiàn)出更多樣的新抗原(neoantigen)表位，使PDGFRA 突變的GIST 具有更強的免疫原性。因此，與KIT 突變的GIST 相比，PDGFRA突變的GIST 具有較低的增殖指數(shù)，提示PDGFRA 突變患者可能會有更好的免疫治療效果。不僅攜帶KIT和PDGFRA突變的GIST的免疫微環(huán)境不同，PDGFRA的不同突變類型的微環(huán)境中免疫細胞構成也同樣存在差異。在PDGFRA 突變類型中，約有一半是外顯子18的D842V 突變,PDGFRA D842V 突變與非D842V 突變患者相比，D842V突變GIST腫瘤具有更多的CD8+T細胞與Treg 細胞，而CD4+T 細胞較少，這種特點導致了IFN-γ 分泌增加及PD-L1 表達上升[10]。另外，伊馬替尼對于D842V 突變的GIST 患者的療效不理想，也可能與其免疫微環(huán)境特征有關[11]。綜上，不同突變類型GIST 免疫微環(huán)境具有不同特點，這些差異可能影響免疫治療療效，但目前相關研究尚不充分，因此各類驅(qū)動基因突變類型的GIST的不同免疫特征值得未來深入研究。

1.2 微環(huán)境的免疫抑制特征可促進其轉移

不同腫瘤類型往往各自具有獨特的免疫微環(huán)境特征，而免疫細胞種類和功能的差異可能會直接影響腫瘤發(fā)生發(fā)展模式。GIST免疫微環(huán)境主要具有以下兩種特征。

1.2.1 免疫微環(huán)境主要呈現(xiàn)抑制性 與上皮性腫瘤的免疫細胞構成不同的是，前者往往有較多的促炎免疫細胞，而GIST 組織中最主要的細胞類型是腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）。這類細胞不會產(chǎn)生促炎細胞因子，如IL-6 和TNF-α，其主要作用是清除腫瘤碎片、促進血管生成以及組織重塑[12]。GIST 組織中豐富的TAM 可能與相關化學因子的刺激有關。CAMERON 等[13]的研究證實GIST 細胞表達單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP1/CCL2），其與巨噬細胞前體細胞即單核細胞的募集、遷移和分化有關[14]。因此，在腫瘤微環(huán)境中，它可能發(fā)揮限制免疫監(jiān)視并促進腫瘤生長的作用。一般將TAM 分為經(jīng)典型1 型巨噬細胞（M1）和交替激活的2型巨噬細胞（M2）兩類。M1 巨噬細胞的功能是吞噬破壞微生物、清除腫瘤細胞、向T 細胞提呈抗原，并產(chǎn)生促炎細胞因子。與之相反的是，M2巨噬細胞通過抑制Th1細胞介導的炎癥和刺激血管生成促進腫瘤發(fā)展。PANTALEO等[15]研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)未經(jīng)治療的原發(fā)性GIST中，巨噬細胞在大多數(shù)情況下處于M2 極化狀態(tài)。在M-CSF、IL-4 或IL-10的刺激下，單核細胞也傾向于向M2巨噬細胞分化，并通過高表達PD-L1、IL-10 或TGF-β 而抑制Th1細胞介導的炎癥并刺激血管生成，導致腫瘤發(fā)生發(fā)展[16-17]。除了上述巨噬細胞分型外，Ki-M1P作為未成熟巨噬細胞相關標記，近年來得到了諸多關注。GIST 內(nèi)Ki-M1P+巨噬細胞是數(shù)量最多的巨噬細胞亞型，目前該類亞型巨噬細胞作用機制有待進一步明確。相關研究[13]提示，在上皮樣、體積較大（＞10 cm）以及增值指數(shù)較高的腫瘤中Ki-M1P+巨噬細胞浸潤更加豐富，提示該亞型可能具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

除TAM 外，GIST 中第二常見的免疫細胞類型是CD3+T 細胞。CD3+T 細胞包括多種細胞類型，包括CD8+CTL、CD4+Th1 細胞、CD4+Th2 細胞、表達Foxp3（fork head box P3 protein,Foxp3）的Treg細胞和IL-17+Th17 細胞。CD3+T 細胞在起源于小腸或結腸的GIST 中比起源于胃的GIST 中數(shù)量更多，并且在增殖指數(shù)較高（≥10%）的GIST中比在增殖指數(shù)較低（＜10%）的腫瘤中更常見[13]。CD3+T 細胞各類亞型的分布比例直接導致GIST 免疫抑制環(huán)境的產(chǎn)生。首先，具有抑制作用的免疫細胞增多，GIST內(nèi)浸潤Treg細胞較多，Treg 細胞可以直接接觸抑制靶細胞的活化或者通過分泌TGF-β 或IL-10 等細胞因子抑制免疫應答。不僅如此，GIST中的Treg細胞分布與M2巨噬細胞數(shù)量呈正相關[17]，提示M2 型巨噬細胞的抗炎作用可能也促進了Treg 細胞在GIST 中的分布，兩者共同導致GIST 免疫抑制微環(huán)境的形成。其次，GIST組織中具有細胞毒性的免疫細胞數(shù)量較少。CTL 以MHC Ⅰ類分子限制性的方式識別靶細胞表面的抗原肽-MHC Ⅱ分子復合物（peptide-MHC class Ⅱ，pMHCⅡ），發(fā)揮腫瘤抗原的識別以及免疫監(jiān)測的作用[18-19]。GIST中CTL/Treg細胞比例較低，并且GIST細胞減少了HLAⅠ類分子表達，這可能會阻礙CTL 抗腫瘤免疫作用，加劇免疫抑制微環(huán)境[20]。最后，GIST中的NK細胞功能異常。與CTL類似，NK細胞能夠有效殺傷腫瘤細胞而使正常組織免受傷害。在未經(jīng)治療的GIST中，NK 細胞數(shù)量較高患者具有較低的增殖指數(shù)以及更好的預后[21]。然而在進展期GIST 中，NK 細胞表面抑制型受體NKP30c 表達增加，造成TNF-α、CD107a 和IFN-γ分泌減少，這可能是導致患者OS縮短的原因。

1.2.2 原發(fā)與轉移性GIST具有不同的免疫微環(huán)境特征 研究[22]表明，原發(fā)性GIST 邊緣部位浸潤的CD8+和Foxp3+細胞密度高于轉移性GIST。此外，轉移性GIST 中M2 巨噬細胞的數(shù)量是原發(fā)性腫瘤的2 倍，這表明M2 巨噬細胞可能與腫瘤轉移有關[17]。此外，多項研究[10,13,15]表明B 細胞在腫瘤免疫方面起關鍵作用，腫瘤浸潤性B 細胞提供體液抗腫瘤反應，導致ADCC 和CDC。與未經(jīng)治療的GIST 中的原發(fā)腫瘤相比，B細胞在轉移性GSIT中的數(shù)量更多。

GIST 的主要轉移部位是腹膜及肝臟[23]，不同轉移病灶的免疫微環(huán)境也有區(qū)別。相較于腹膜，肝臟轉移灶內(nèi)往往具有更多的CD3+T 細胞[13]。CAMERON等[13]的研究證實GIST 腹膜轉移灶內(nèi)Ki-M1P+巨噬細胞顯著多于原發(fā)灶，并且可能導致轉移灶增殖指數(shù)升高。因此GIST的免疫微環(huán)境與腫瘤的生物學特性如浸潤、轉移等特征均密切相關，綜合分析GIST內(nèi)不同免疫細胞比例及功能差異并探究轉移灶免疫微環(huán)境特征對于GIST的免疫治療具有重要意義。

1.3 免疫微環(huán)境促進免疫逃逸

既往研究[8]顯示，一些微小GIST（最大徑＜1 cm）患者，即使具有突變基因也不會進展，因此推測GIST進展為侵襲性疾病的機制除驅(qū)動基因突變外可能與免疫逃逸有關。目前GIST的免疫逃逸機制認為主要有以下幾種原因：（1）吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）過表達。在GIST 中，c-KIT 通過激活ETS 變異轉錄因子4（ETS variant transcription factor 4，Etv4）誘導IDO的表達，作為一種色氨酸分解代謝酶，IDO 可誘導CD4+淋巴細胞分化為Treg細胞，并直接抑制CTL和NK細胞[9]。此外，在存在色氨酸代謝物的情況下，抗原提呈細胞（如TAM）更有可能極化為免疫耐受表型，并分泌TGF-β 或IL-10，導致機體對腫瘤抗原免疫耐受[24]。（2）MHC Ⅰ表達缺失。MHC Ⅰ低表達通常是由于腫瘤細胞丟失β2微球蛋白所致。MHC Ⅰ在細胞表面呈現(xiàn)抗原，導致T 細胞識別抗原，介導抗腫瘤免疫作用[25]。VAN DONGEN 等[20]研究表明，70%的GIST 細胞MHC Ⅰ表達缺失，導致CTL對腫瘤細胞的識別能力降低。（3）免疫檢查點蛋白（immune checkpoint protein，ICP）的高表達。PD-L1 大約在70%左右的GIST 中表達，這種高表達直接導致CTL 受到抑制，因此被認為與GIST 預后不良相關[26]。值得注意的是，ICP表達增加也為PD-1/PD-L1抑制藥物在GIST中的應用提供了適應證。

2 伊馬替尼改善免疫微環(huán)境機制：直接和間接機制

作為治療GIST 最常用的分子靶向藥物，伊馬替尼不僅可以通過抑制KIT 和PDGFRA 的異常激活起到抗腫瘤作用，其與GIST 免疫微環(huán)境的關系近年來越來越受到關注。研究發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼主要通過兩方面改善GIST 免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。一方面，伊馬替尼可直接改變免疫細胞構成，VAN DONGEN 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼在巨噬細胞培養(yǎng)物中誘導抗炎因子IL-10的分泌，這表明用伊馬替尼治療可能有助于改善GIST 中的免疫抑制微環(huán)境。作為GIST 最常見的驅(qū)動基因，KIT 表達的蛋白也位于DC 表面，主要功能是抑制其與NK細胞的交叉激活。伊馬替尼通過抑制KIT，誘導NK 細胞活化，進一步促進Th1 細胞反應的增加，同時增加IFN-γ的分泌[27]。一項Ⅲ期臨床試驗[21]隨訪了77名GIST患者的NK細胞功能，結果顯示，在接受伊馬替尼治療的進展期GIST患者中，治療2 個月后NK 細胞分泌IFN-γ 水平高低可被視為長期生存的獨立預測因子（2 年時高水平者PFS 為85%，而低水平者僅為50%）。此外，伊馬替尼治療還可以顯著減少 腫瘤組 織中Treg 細胞數(shù) 量[28]。在BALACHANDRAN 等[29]構建的動物模型中，伊馬替尼增加腫瘤組織內(nèi)CTL 的密度、活化和增殖及Treg 細胞的凋亡，使CD8/Treg細胞比率增加。另一方面，伊馬替尼可間接改善免疫抑制微環(huán)境。IDO 可以抑制NK細胞和CTL 而激活Treg 細胞[9]。伊馬替尼通過降低IDO 表達，導致腫瘤內(nèi)CTL 活化并誘導Treg 細胞凋亡[29-30]。此外，伊馬替尼可能通過降低腫瘤表面的PD-L1的表達來減少免疫逃逸[5]。以上伊馬替尼對于GIST 免疫微環(huán)境的影響，充分提示了免疫微環(huán)境對GIST治療的重要價值。

3 GIST免疫治療現(xiàn)狀

近5 年來，腫瘤免疫治療取得了一些突破性進展，主要包括免疫檢查點抑制劑（ICI）、工程化細胞療法和新抗原疫苗。目前僅有少數(shù)研究報道ICI 具有治療GIST 的潛在效果，而細胞療法和新抗原疫苗目前尚未有相關臨床研究報道。

3.1 GIST可能是ICI潛在的獲益病種

PD-1/PD-L1是目前基礎研究和臨床應用最多的ICI 作用靶點，然而在軟組織腫瘤中應用尚不成熟。近年來研究者們證實GIST免疫特征或提示其可能是ICI 類藥物的潛在獲益病種。有研究[31]比較了多種軟組織腫瘤（平滑肌肉瘤、血管肉瘤、滑膜肉瘤等）中PD-L1表達情況，發(fā)現(xiàn)GIST的PD-L1表達顯著高于其他軟組織腫瘤。進一步檢測發(fā)現(xiàn)高危型GIST 中PD-L1 表達顯著高于極低風險、低風險或中等風險GIST[32]。

此外，一項基于608 例軟組織腫瘤患者樣本的RNA 測序研究了TME 在軟組織腫瘤中的作用及其與抗PD-1免疫治療反應的關系。這項研究創(chuàng)建了肉瘤免疫分類（sarcoma immune classification，SIC）方法，該分類根據(jù)軟組織肉瘤（soft tissue sarcoma，STS）的TME 免疫浸潤程度對其進行分類依據(jù)是從SIC-A（免疫沙漠）到SIC-E（豐富的免疫浸潤），對ICI治療的反應率依次遞增。該研究納入的60 例GIST中約有25%屬于SIC-E 類，高于其他類型的軟組織肉瘤[33]。以上研究提示GIST 可能是ICI 類藥物潛在的獲益病種。

3.2 經(jīng)典ICI在GIST治療中的應用前景

盡管GIST 比其他軟組織腫瘤具有更高的PD-L1表達水平，但是在目前已完成的臨床研究中，PD-1/PD-L1 單抗單藥在GIST 領域并未取得顯著療效。最近發(fā)表的一項在36 例轉移性或無法手術的GIST患者中使用PD-1單抗納武利尤單抗合并或者不合并CTLA-4單抗依匹木單抗進行的隨機Ⅱ期臨床試驗[34]，結果提示，納武利尤單抗單藥治療組中19名患者中有10 名（52.6%）SD，臨床獲益率（CBR）為52.6%，中位PFS 為11.7 周；聯(lián)合依匹木單抗治療組的16 名患者中，1 名患者出現(xiàn)CR，4 名患者出現(xiàn)SD，CBR 為31.3%，中位PFS 為8.3 周。其他研究[35-36]顯示，使用納武利尤單抗單藥治療效果不佳，中位PFS 為8.57周。

一些臨床試驗還探討了TKI 與ICI 的聯(lián)合應用。一項Ⅰb 期的臨床研究[8]納入了20 名常規(guī)治療后進展的GIST 患者，采用達沙替尼70 mg/d 聯(lián)合依匹木單抗10 mg/kg 治療，患者的PFS 為2.8 個月，最常見的不良反應是貧血，發(fā)生率約94%；該研究中有一名IDO表達下降的患者病情穩(wěn)定達4.75個月，而另外2名IDO表達水平無變化患者病情迅速進展；分析其原因由于使用TKI 后，患者往往伴隨IDO 水平下降，CTLA-4單抗可與TKI協(xié)同作用，可增強這一效應。以上這些研究為ICI 在GIST 治療中的應用提供了有價值的信息。

3.3 細胞療法和新抗原疫苗尚處于研究起步階段

以CAR-T 細胞和TCR-T 細胞為代表的新型工程化T 細胞治療近年來取得了突破性進展，在白血病（CD19 CAR-T）、食管癌（NY-ESO-1 TCR-T）等治療中有顯著療效[37]。目前在GIST 治療中CAR-T 細胞的使用尚處于初級階段。值得注意的是，約75%～80%的GIST 患者具有KIT 突變，因此KIT 是CAR-T 細胞治療的潛在靶點。目前針對KIT 的CAR-T 細胞治療已有動物研究。有臨床前研究[38]報道,抗KIT CAR-T細胞能夠結合GIST細胞，產(chǎn)生IFN-γ，并在體外裂解細胞，這種抗腫瘤作用也見于伊馬替尼耐藥細胞；此外在患有GIST的小鼠中，抗KIT的CAR-T細胞輸注導致腫瘤生長被顯著抑制。目前尚無CAR-T 細胞用于治療GIST 的臨床研究?；诹己玫膭游飳嶒灮A，未來有望陸續(xù)出現(xiàn)抗KIT CAR-T 細胞或其他靶點應用于GIST治療的臨床研究。

近年來，隨著高通量基因測序和生物信息學分析逐步應用，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞突變產(chǎn)生的新抗原具有顯著優(yōu)勢，這種來源于腫瘤特異性突變且通過改變氨基酸編碼（非同義體細胞突變）而產(chǎn)生的具有免疫原性的抗原，不同于腫瘤相關抗原（tumorassociated antigen，TAA），新抗原通常不存在于人體正常組織內(nèi)，被認為是腫瘤特異性抗原，其免疫原性強，是免疫治療的理想靶點[39]。共性新抗原對于新抗原疫苗的制備具有重要意義，一方面可以通過簡便且具有針對性的方法予以鑒定（一代測序或靶基因測序等）；另一方面可以事先制備共性新抗原所對應的突變肽疫苗，從而顯著降低成本并縮短患者治療等待時間。目前雖尚未有新抗原疫苗應用于GIST 治療的相關報道，但值得注意的是GIST 是一種具有明確驅(qū)動基因突變的軟組織腫瘤，其最為顯著的特殊臨床分子病理特征在于其具有高頻率的KIT突變（突變頻率高達80%，超過幾乎所有其他類型腫瘤），該特點可能成為GIST 新抗原治療的潛在優(yōu)勢[40]。未來針對GIST共性突變靶點的新抗原疫苗的基礎研究和臨床試驗或?qū)⒅饾u開展。

4 結語

GIST作為一種具有明確驅(qū)動基因突變的軟組織腫瘤，由于既往在靶向治療領域獲得了突破性進展，其免疫治療的發(fā)展相對緩慢?，F(xiàn)有的研究表明，GIST的免疫微環(huán)境具有抑制性細胞增加而腫瘤殺傷細胞降低的特點，不僅如此，其免疫特征也與靶向治療之間具有密切聯(lián)系，因此，GIST的免疫治療具有研究和探索的重要價值。但也要認識到，GIST 作為軟組織來源的腫瘤，其基因突變特征和免疫特征均與其他類型腫瘤和非特殊類型軟組織肉瘤有顯著的區(qū)別，這也是為什么僅僅采用ICI 治療GIST 的臨床研究結果并不理想的原因。新抗原疫苗和工程化免疫細胞治療雖然在GIST 領域尚處于起步階段，但由于GIST 具有明確的高頻率致病驅(qū)動基因突變，使其成為上述治療的潛在獲益病種，值得深入研究。伴隨著測序技術的發(fā)展、免疫治療的技術革新以及針對GIST 免疫微環(huán)境特點認識的深入，未來免疫治療有望成為GIST患者的重要治療手段。