人工雌核生殖技術及其在魚類育種中的應用

符文，彭亮躍，肖亞梅*

（1.湖南師范大學生命科學學院，省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室，長沙 410081；2.湖南師范大學化學生物學及中藥分析教育部重點實驗室，長沙 410081）

雌核生殖（gynogenesis）是指卵子只依靠雌性原核進行發(fā)育的一種特殊的生殖方式［1］。20世紀初，Hertwig［2］最先在蛙胚胎中發(fā)現了雌核生殖的現象。魚類中一些自然群體幾乎由雌性組成，如亞馬遜花鳉（Poeciliaformosa）［3］、墨西哥莫氏鳉（Poeciliamexicana）［4］、銀 鯽（Carassiusauratus gibelio）［5-6］、彭澤鯽（Carassiusauratus）［7］等，研究證實這些天然全雌群體以天然雌核生殖的方式繁殖。天然雌核生殖魚類的配子形成機制相當復雜，天然雌核生殖魚類卵子發(fā)育基本上不發(fā)生第1次成熟分裂或者成熟分裂后不排出第2極體，并且胚胎第1次卵裂為核內有絲分裂等來維持其倍性［5，8］。此外，天然雌核生殖魚類卵子在近緣種甚至遠緣種精子的激活下啟動發(fā)育，但并未發(fā)生雌、雄原核的融合，精子只起激活作用，后代均為母系遺傳，形成單性的雌性群體［9-11］。

在天然雌核生殖研究基礎上，人們探索魚類人工誘導雌核生殖技術。目前，人工雌核生殖已經發(fā)展成為魚類遺傳改良的有效途徑，在魚類種質提純復壯、良種選育等方面發(fā)揮重要作用［12-14］。本文結合魚類育種發(fā)展實踐，系統(tǒng)地對魚類人工雌核生殖的技術途徑、研究現狀和應用進行總結，并提出了魚類人工雌核生殖存在的問題及展望，以期為魚類人工雌核生殖技術未來的發(fā)展提供參考。

1 人工雌核生殖中精子的選擇及其遺傳滅活

對于兩性生殖動物而言，新個體的生命始于精卵融合，即受精過程。受精不僅將雙親遺傳物質傳遞給子代，而且通過精子激活卵子并啟動新個體發(fā)育。因此，人工誘導雌核生殖仍然需要“受精”過程。

1.1 精子的選擇

在人工誘導雌核生殖過程中，可以選用同源或者異源精子來激活卵子發(fā)育。同源精子激活主要應用于海水魚，有研究使用同源精子誘導雌核生殖半舌滑鰨（Cynoglossussemilaevis）［15］；Peruzzi等［16］也使用同源精子誘導雌核生殖歐洲鱸（Dicentrarchuslabrax）。但在精子遺傳滅活過程中，部分同源精子遺傳滅活不徹底，導致正常受精發(fā)育而來的自交個體隱藏于雌核生殖群體中，后續(xù)難以鑒定雌核發(fā)育二倍體與普通二倍體，因此研究者們尋求親緣關系較遠的異種精子誘導雌核發(fā)育，特別是遠緣雜交難以產生存活后代的異源精子，這樣可確保存活的后代為雌核生殖［13］。異源精子誘導雌核生殖的方法在魚類人工雌核生殖研究中已被廣泛應用。Chen等［17］使用遺傳滅活的巖鯛精子誘導雌核生殖黃鼓魚（Nibeaalbiflora，Sciaenidae）；Saber等［18］使用遺傳滅活的西伯利亞鱘精子誘導雌核生殖裸腹鱘（Acipenser nudiventris）；另外，在淡水魚中使用異源精子成功獲得了雌核生殖草魚（Ctenopharyngodonidella）、翹嘴鲌（Culteralburnus）、團頭魴（Megalobrama amblycephala）等［19-22］。

研究表明，在異源精子誘導雌核生殖過程中，會出現少量父本遺傳物質整合到雌核生殖后代的現象。Chen等［23］在異育銀鯽的基因組中發(fā)現了穩(wěn)定插入的父系DNA片段；有學者在雌核生殖草魚中發(fā)現了父本錦鯉來源的DNA片段［24-25］；Gong等［22］在2種異源精子誘導的雌核生殖團頭魴中，均檢測到父本的DNA片段。這些父源DNA片段不僅可作為鑒別雌核生殖二倍體和普通二倍體有效的分子標記［22，24］，而且這種異源的遺傳效應可使得雌核生殖后代獲得生長更快、抗逆性更強等優(yōu)良性狀［26-28］。

1.2 精子的遺傳滅活

精子的遺傳滅活是人工誘導雌核生殖的關鍵，目前主要采用化學方法和物理方法。

化學方法是指使用化學藥物處理使精子遺傳物質失活。常用的化學藥物有乙烯脲（ethyleneurea）、吖啶黃（trypalflavine）、甲苯胺藍（toloniumchloride）、二甲基硫酸鹽（dimethylsulfate）和甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate）等，但化學藥物處理后，精子的生理活性很弱，誘導效果不理想［29］。

目前魚類人工誘導雌核生殖中廣泛采用物理方法使精子遺傳滅活，如X射線、γ射線和紫外線照射。在輻射育種發(fā)展早期，多用X射線和γ射線處理精子。Yousefian等［30］用X射線和γ射線處理精子誘導鯉魚雌核生殖；Onozato［31］用γ射線處理精子誘導大馬哈魚（Oncorhynchusketa）雌核生殖；Ijiri［32］用 γ 射線處理精子誘導青鳉（Oryzias latipes）雌核生殖。X射線和γ射線的作用主要是誘發(fā)染色體斷裂，它們具有較強的穿透力，便于大量精子處理，但對設備要求嚴格、操作復雜且具有一定的危險性［1］。紫外線照射是目前使用最為廣泛的精子遺傳滅活方法。紫外線的主要作用是破壞精子頭部的DNA結構，經紫外線照射后的DNA氫鍵斷裂，同一鏈上相鄰的或雙螺旋相對應的兩條鏈上的胸腺嘧啶之間形成胸腺嘧啶二聚體（thymine dimers），導致DNA結構變形，影響DNA復制和轉錄［33］。相比于X射線和γ射線，紫外線照射設備簡單、操作方便而且安全性更高［1］。雖然紫外線的穿透力不強，但只需在處理過程中調整精液稀釋倍數、照射距離和照射時間就可達到理想的遺傳滅活效果［34-35］。

2 人工雌核生殖中染色體加倍方法

魚類的成熟卵子具備全部的個體發(fā)育潛能，但由于單倍體綜合癥（hapolid syndrom），單倍體胚胎在孵化期或者孵化后陸續(xù)死亡。因此，用遺傳滅活精子授精后獲得的“受精卵”還需通過人工處理使得單倍體（haploid）胚胎的染色體加倍并發(fā)育成二倍體（diploid）。

2.1 化學方法誘導染色體加倍

化學方法是指通過化學藥劑處理誘導染色體加倍的方法。常用的化學藥物如秋水仙素（colchicine）、細胞松弛素（cytochalasin）、6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine，6-DMAP）等。吳清江等［36］研究顯示，在人工誘導鯉魚雌核生殖過程中，在受精后發(fā)育至2細胞期時，以25×10-6～100×10-6g·L-1的秋水仙素溶液浸泡30 min，可獲得31.6%二倍體雌核生殖個體。Refstie［37］用質量濃度為1 μg·mL-1的細胞松弛素B溶液處理虹鱒（Oncorhynchusmykiss）30 h左右，成功獲得了部分多倍體以及多倍體嵌合體。雖然化學藥物在魚類染色體加倍誘導中具有顯著效果，但是具有較大的毒性，操作要求較為嚴格，會對子代個體的活性造成負面影響，而且在魚類中往往會產生較多的嵌合體。因此，在魚類雌核生殖誘導中化學方法使用較少。

2.2 物理方法誘導染色體加倍

紡錘體微管對溫度和靜水壓敏感，通過破壞紡錘體的結構，導致正常的細胞分裂無法進行，可以實現染色體加倍［38-39］。在人工誘導魚類雌核生殖二倍體中主要采用溫度休克和靜水壓休克2種物理方法。

溫度休克是在高于（熱休克）或低于（冷休克）最適發(fā)育溫度的環(huán)境下，抑制受精卵第2極體的釋放或第1次有絲分裂導致染色體加倍后。該方法設備簡單、操作方便、可大批量處理，目前應用較為廣泛。例如，Bencsik等［40］利用熱休克誘導雌核生殖虹鱒，于27.5℃熱休克受精卵10 min后，可獲得73.33%的雌核生殖后代；Zhang等［20］利用冷休克誘導雌核生殖二倍體草魚，通過設置梯度起始休克時間，在4～6℃下處理10～12 min，誘導獲得了雌核生殖草魚。目前溫度休克方法在虹鱒、草魚、團頭魴、牙鲆（Paralichthysolivaceus）等幾十種經濟魚類中成功誘導獲得了雌核生殖二倍體［20，22，40-41］。溫度休克誘導實踐表明，一般冷水性魚類更適合使用熱休克誘導，溫水性魚類熱、冷休克都可以誘導染色體加倍，而熱水性魚類則更適合使用冷休克誘導。

靜水壓法是一種對受精卵損傷小、孵化率較高的染色體加倍的物理誘導方法。Lou等［42］用靜水壓法誘導雌核生殖二倍體虹鱒；Ghigliotti等［43］用靜水壓法處理大西洋鱈魚（Gadusmorhua）“受精卵”，最終獲得了88.89%的雌核生殖二倍體。但靜水壓法需要專業(yè)的設備、操作復雜、處理量較小，成本相對較高。

2.3 減數分裂雌核生殖和有絲分裂雌核生殖

減數分裂雌核生殖（meiotic gynogenesis）指通過抑制第2次減數分裂誘導雌核生殖；而有絲分裂雌核生殖（mitotic gynogenesis）則指通過抑制第1次有絲分裂誘導雌核生殖。Morgan等［41］在牙鲆人工誘導雌核生殖研究中，對受精后1～3 min的受精卵靜水壓休克6 min，誘導獲得了減數分裂雌核生殖牙鲆；Zhang等［20］在受精1～30 min內，每隔1～2 min取1次胚胎進行4～6°C冷休克，誘導獲得了減數分裂雌核生殖和有絲分裂雌核生殖兩種類型的雌核生殖二倍體草魚；有學者在人工誘導雌核生殖黃鱔（Monopterusalbus）的研究中發(fā)現，胚胎在受精后70 min開始進入第1次卵裂前期，在受精后125 min完成第1次卵裂，在受精后100 min進行熱休克處理時可獲得100%的有絲分裂雌核生殖二倍體［44-45］。有絲分裂雌核生殖獲得的后代各基因座（locus）均處于純合狀態(tài)，有害隱性基因控制的性狀就會表達出來，因此有絲分裂雌核生殖的誘導率和存活率相對較低［46］。

3 遠緣雜交獲得雌核生殖后代

遠緣雜交（distant hybridization）是指不同物種或更高分類的親本之間的雜交，具有更大的產生新種質甚至新物種的潛力。有研究團隊通過長期魚類遠緣雜交實踐結果證實，遠緣雜交是獲得雌核生殖后代的一種有效途徑：在紅鯽（♀）與團頭魴（♂）的遠緣雜交F1后代中出現了雌核生殖二倍體鯽［47］；鯉（♀）與團頭魴（♂）的雜交F1代中分別形成了76.50%的雌核生殖二倍體鯉和17.50%的雌核生殖二倍體鏡鯉［48］；草魚（♀）與翹嘴鲌（♂）的雜交F1后代中出現了雌核生殖二倍體草魚和三倍體草鲌［49］。

4 人工雌核生殖技術在魚類中的應用

早在1976年，通過人工雌核生殖的方法成功獲得了生長速度快、抗病能力強的雌核生殖草魚［24］。隨后，研究者們陸續(xù)在大馬哈魚、舌齒鱸、鯽和團頭魴等重要經濟魚類中通過人工雌核生殖獲得了性狀優(yōu)良新品系［16，22，31，50］。

4.1 快速建立純系

在傳統(tǒng)的魚類育種中，建立遺傳純系一般要經過8～10代的連續(xù)選育才能獲得純系。雌核生殖后代的遺傳物質完全來源于母本，有絲分裂雌核生殖獲得的后代各基因座處于純合狀態(tài)，通過該方法只需1～2代就可獲得純系。如利用人工雌核生殖技術，在F1代快速獲得了純合轉基因斑馬魚［51］；李志等［52］利用基因編輯結合人工雌核生殖技術，建立了一種高效創(chuàng)制黃河鯰基因突變體的方法，在F0代即可獲得純合基因編輯個體，大大縮短了純系篩選周期。

4.2 獲得魚類新種質

雖然精子被遺傳滅活處理，但異精誘導的雌核生殖后代中仍被證明有父本遺傳物質的插入。Yi等［27］和Zhao等［28］的研究表明，人工誘導雌核生殖后代往往表現出一些明顯來自異源精子供體的表型，這些父本遺傳物質的存在可使雌核生殖后代獲得優(yōu)良性狀；Zhang等［20］使用遺傳滅活的異源四倍體鯽鯉精子誘導獲得了生長快速、抗病能力強的雌核生殖草魚，并以雌核生殖草魚為母本，普通草魚為父本，大批量制備了生長速度快、抗病能力強的優(yōu)良苗種；Gong等［22］使用遺傳滅活的錦鯉精子誘導獲得了耐低氧能力更強的雌核生殖團頭魴。

4.3 全雌育種

在魚類中，常常存在性別二態(tài)性，即一種性別比另一種性別生長快、個體大、成熟早等。在雌性為優(yōu)勢性別的魚中，通過培育全雌的苗種進行養(yǎng)殖，可以大大提高生產效率，增加經濟效益。全雌魚可以通過雌核生殖技術直接制備，如雌核生殖草魚、團頭魴、虹鱒等［20，22，42］，但是受操作限制，人工雌核生殖后代數量有限。結合人工雌核生殖和性逆轉技術，將性逆轉的偽雄魚與雌核生殖后代交配，可大規(guī)模制備全雌苗種。如Luo等［50］使用性激素誘導雌魚性逆轉為偽雄魚，再與雌核生殖鯽魚交配，大規(guī)模制備了全雌鯽魚苗種；中國水產科學研究院通過對人工誘導雌核生殖牙鲆進行性逆轉，再與雌核生殖牙鲆交配，選育出了全雌牙鲆“北鲆1號”，該新品種比普通牙鲆生長快約20%，規(guī)格整齊，具有較好的經濟效益［46］。

4.4 性別決定機制的鑒定

性染色體決定性別的方式主要有ZW型和XY型。ZW型中，雌性（ZW）屬于異配性別、雄性（ZZ）屬于同配性別；XY型中，雌性（XX）屬于同配性別、雄性（XY）屬于同配性別。雌核生殖后代中，其性別決定完全由卵子的遺傳物質控制，對雌性配子異型（ZW）的魚來說，若WW型后代存活，那么雌核生殖后代的雌雄比為1∶1，若WW型后代不能存活，那么雌核生殖后代的為全雄。如大副泥鰍（Paramisgurnusdabryanus）［53］和半舌滑鰨［54］等的性別決定方式被證明為ZW型，它們雌核生殖后代中雄性比例較高；而對雌性配子同型（XX）的魚來說，雌核生殖后代全部為雌性，如草魚［20］、團頭魴［22］等的性別決定方式被證明為 XY型，它們的雌核生殖后代全部為雌性。

4.5 瀕危魚類保護

目前，自然環(huán)境破壞和人為過度開發(fā)，造成魚類資源退化和物種瀕危。雌核生殖技術是種質改良和遺傳復壯的有效途徑之一。對于瀕危魚類來說，可使用近緣物種的精子誘導人工雌核發(fā)育，實現瀕危物種保護。如裸腹鱘沒有發(fā)現野生個體自然繁殖，2011年已經被世界自然保護聯盟（IUCN）列為極度瀕危物種。2014年 Saber等［18］報道，使用遺傳滅活的西伯利亞鱘精子啟動裸腹鱘卵子發(fā)育，并在受精后10 min、2.5℃冷休克30 min，誘導獲得了人工雌核生殖裸腹鱘。該方法為人工恢復瀕危魚類種群提供了參考。

5 魚類人工雌核生殖存在的問題及展望

目前，盡管人工雌核生殖已經在魚類育種實踐中取得成功，但雌核生殖后代的成活率依然低下。溫度休克對卵子損傷程度較大，處理參數設置不當容易導致胚胎成活率低［55］。溫度休克和靜水壓休克也會引起細胞器不穩(wěn)定或解體，如中心體。中心體解體，不能形成紡錘，從而導致細胞分裂無法正常進行［38-39］。劉少軍等［56］發(fā)明了一種雌、雄核發(fā)育新型實驗設備，該設備操作方便、對精子紫外照射均勻，可減少外界環(huán)境對實驗效果的影響，為精子遺傳滅活參數優(yōu)化提供了便利，同時也為高效規(guī)?；拈_展人工雌核生殖操作提供了儀器設施的支持。

異源精子誘導的人工雌核生殖后代中異源遺傳物質直接影響雌核生殖后代性狀［22-28］，但父本遺傳物質與母本基因組整合的遺傳機制尚不清楚，有待進一步深入研究。同時人工異源誘導雌核生殖后代商品化生產和大規(guī)模環(huán)境釋放，其整合的異源遺傳物質通過有性交配基因漂移逃逸到野生種及其野生近緣種中，容易造成野生種質污染［57］。人工異源誘導雌核生殖魚存在潛在的生態(tài)風險，可結合誘導三倍體不育系來防止逃逸到自然水體中污染野生種質資源［58］。