不同施氮量下黑果枸杞對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

馬興東，郭曄紅*，李梅英，于霞霞，徐英杰，朱文娟，馮潔

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，中藥材研究所，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2.國家林業(yè)和草原局甘肅瀕危動(dòng)物保護(hù)中心，甘肅 武威 733000；3.吐魯番職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 吐魯番 838000）

干旱脅迫嚴(yán)重制約著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，在我國西北干旱地區(qū)植物受干旱脅迫的影響極其明顯。干旱可使植物根、莖、葉等器官發(fā)生萎蔫，從而降低植株水分代謝、氧分代謝、生理激素含量、滲透調(diào)節(jié)能力和光合作用等［1-2］，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成減產(chǎn)甚至植株死亡［3］。因此，植物對(duì)干旱脅迫的耐受性及抗旱機(jī)理研究受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，在小麥［4-6］、玉米［7］和棉花［8］等重要作物中進(jìn)行了大量研究。植物抗旱性主要是由體內(nèi)含水量、抗氧化自由基、膜脂過氧化產(chǎn)物和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等因素共同作用的結(jié)果［9-10］。干旱脅迫下，植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脯氨酸（proline，Pro）和可溶性糖（soluble sugar，SS）含量都會(huì)發(fā)生變化。鄭世英等［11］研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下小麥中SOD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)；顧建勤等［12］研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫使豌豆葉片中POD與CAT活性升高；季楊等［13］研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)膜脂過氧化水平升高，造成MDA含量增加，使植物生長(zhǎng)受損；于霞霞等［10］研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫使肉蓯蓉寄主植物梭梭葉片中Pro含量增加；趙振寧等［14］研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫使大豆中SS含量增加。上述研究均表明，植物的抗旱性與SOD、POD、CAT、MDA、Pro和SS等生理指標(biāo)密切相關(guān)。

氮（N）作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵營養(yǎng)元素，對(duì)植株的生長(zhǎng)、光合作用和產(chǎn)量積累等都有一定的促進(jìn)作用［15］。研究表明，施氮能提高植物的抗旱性，其作用機(jī)理也是通過提高抗氧化酶活性和膜脂過氧化產(chǎn)物及滲透調(diào)節(jié)物含量，從而提高植物的抗旱性［16-17］。黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr.）為多年生、喜陽喜旱灌木，在抗旱、抗鹽堿、水土保持方面有一定的價(jià)值，其果實(shí)又叫黑枸杞，有著很高的營養(yǎng)價(jià)值［18-19］。干旱脅迫對(duì)黑果枸杞生長(zhǎng)發(fā)育有一定影響，宗莉等［20］研究表明，干旱脅迫制約著黑果枸杞種子的萌發(fā)；李永潔等［21］發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫對(duì)黑果枸杞植株的生長(zhǎng)、生物量積累和抗氧化酶活性都有一定的影響；郭有燕等［22］研究表明，干旱脅迫會(huì)抑制黑果枸杞的光合作用。由此可見，干旱脅迫對(duì)黑果枸杞的生長(zhǎng)極為不利，提高其抗旱能力是黑果枸杞種植過程中亟待解決的問題。趙晶忠等［23］研究認(rèn)為，低溫層積處理可以適當(dāng)緩解黑果枸杞受干旱脅迫的影響程度，提高出苗率；可靜等［24］研究認(rèn)為，噴施外源水楊酸可以提高黑果枸杞植株內(nèi)抗氧化酶活性，降低MDA含量，從而提高其抗旱能力。但是，關(guān)于施氮量對(duì)黑果枸杞干旱脅迫響應(yīng)的影響，目前尚未見研究報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)室歷時(shí)2年，研究不同氮肥施用量下，黑果枸杞對(duì)不同干旱脅迫的響應(yīng)，旨在探明施氮對(duì)黑果枸杞抗旱生理的影響，以期為干旱區(qū)黑果枸杞的栽培模式提供參考依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在甘肅省武威市國家林草局甘肅瀕危動(dòng)物保護(hù)中心（38°05′N，102°43′E，海拔1 632 m）進(jìn)行。該區(qū)日照強(qiáng)烈，降水稀少且蒸發(fā)量大，2018和2019年的降水量分別為155和127 mm，近10年（2009—2018）的年平均降水量140 mm，為典型的干旱區(qū)；0—20 cm土壤全氮含量0.51 g·kg-1、速效氮含量0.027 g·kg-1，耕作模式主要為旱作農(nóng)業(yè)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為青海諾木洪農(nóng)場(chǎng)購置的2年黑果枸杞，于2017年秋進(jìn)行整地、起壟，壟高30 cm，并施有機(jī)肥作基肥，2018年春移栽枸杞苗至試驗(yàn)地，栽培株行距3 m×2 m，每小區(qū)種植5株，小區(qū)面積30 m2。分別在2018和2019年設(shè)置0（CK）、50（N1）、100（N2）、150（N3）和 200 g·株-1（N4）共5個(gè)施氮量處理，氮源為尿素（含氮量46%，青海中航資源有限公司），分3次按照4∶3∶3的比例于每年的4月20日、6月10日和7月1日施入，施肥方式為穴施，穴深30 cm，距離主桿30 cm。每個(gè)處理3次重復(fù)，共15個(gè)小區(qū)，試驗(yàn)區(qū)總面積450 m2。前兩次施肥后適量灌溉以便肥料溶解，最后一次氮肥施用后進(jìn)行充分灌溉，灌水高至壟面后停止供水，試驗(yàn)期內(nèi)不再灌水。于1周后土壤水分含量至黑果枸杞正常需水時(shí)記為干旱脅迫第0天，隨后至干旱脅迫第15和30天時(shí)進(jìn)行土壤相對(duì)含水量和葉片生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定

分別于干旱持續(xù)脅迫0、15和30 d時(shí)，用多點(diǎn)取樣法采取0—30 cm的土樣，采用105℃烘干飽和稱重法測(cè)定的土壤相對(duì)含水量分別為30.8%、21.7%、11.2%（2018）和 29.3%、21.1%、9.7%（2019）。

選取大小相近、色澤相似的成熟健康全葉測(cè)定生理指標(biāo)。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑還原法；過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用鉬酸銨比色法；過氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法；脯氨酸（Pro）含量測(cè)定采用酸性茚三酮法；可溶性糖（SS）含量的測(cè)定采用蒽酮比色法。以上操作均用UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光值［25］。

1.4 抗旱性的評(píng)價(jià)

采用隸屬函數(shù)法對(duì)6個(gè)抗旱指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，計(jì)算公式如下。

式中，X為各指標(biāo)的測(cè)定值，Xmax、Xmin分別為指標(biāo)測(cè)定的最大與最小值，若該指標(biāo)與抗旱性呈正相關(guān)，則用式（1）計(jì)算，若該指標(biāo)與抗旱性呈負(fù)相關(guān)，則用式（2）計(jì)算，將所求數(shù)值取平均值，其值越大則表示抗旱性越強(qiáng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行隸屬函數(shù)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同施氮量對(duì)抗氧化酶活性的影響

不同干旱脅迫下，不同施氮量對(duì)黑果枸杞葉片中抗氧化酶活性的影響見圖1，結(jié)果表明，施氮量對(duì)黑果枸杞葉片中抗氧化物酶的活性有顯著影響。隨著施氮量的增加，3種酶活性均呈上升趨勢(shì)，其中，SOD活性在干旱脅迫0 d時(shí)N4處理最高，分別較CK顯著提高23.2%（2018）和76.8%（2019）；在干旱脅迫15 d時(shí)仍然是N4處理的SOD活性最高，分別較CK提高29.3%（2018）與54.8%（2019）；在干旱脅迫30 d時(shí)，2018年N3處理的SOD活性最高，較CK顯著提高22.9%，2019年N4處理的SOD活性最高，較CK顯著提高53.6%。POD活性在干旱脅迫0 d時(shí)N3處理最高，分別較CK顯著提高48.3%（2018）與23.8%（2019）；在干旱脅迫15和30 d時(shí)N4處理的POD活性最高，分別較CK顯著提高33.2%、50.3%（2018）和23.2%、16.4%（2019）。CAT活性在干旱脅迫0和15 d時(shí)N4處理最高，較CK顯著提高27.7%、13.3%（2018）和 27.0%、22.9%（2019）；干旱脅迫 30 d時(shí)，2018年N4處理的CAT活性最高，較CK提高40.8%，2019年N3處理的CAT活性最高，較CK顯著提高61.3%。

圖1 不同施氮量下黑果枸杞葉片中SOD、POD和CAT活性Fig.1 Activities of SOD，POD and CAT in leaf of Lycium ruthenicum Murr under different N applications

2.2 不同施氮量對(duì)MDA含量的影響

施氮量對(duì)黑果枸杞葉片中MDA含量有顯著影響，隨著施氮量的增加，其含量均呈先降后升的趨勢(shì)（圖2）。2018年在干旱脅迫0 d時(shí)，N3處理的MDA含量最低，較CK顯著降低37.5%；在干旱脅迫15和30 d時(shí)，N2處理葉片MDA含量最低，分別較CK降29.5%和28.3%。2019年在干旱脅迫0和30 d時(shí)，N2處理的MDA含量最低，分別較CK降低25.7%和8.2%；在干旱脅迫15 d時(shí)，N3處理的MDA含量最低，較CK降低51.1%。

圖2 不同施氮量下黑果枸杞葉片MDA含量Fig.2 MDA contents in leaf of Lycium ruthenicum Murr under different N applications

2.3 不同施氮量對(duì)滲透調(diào)節(jié)物的影響

施氮量對(duì)黑果枸杞葉片Pro含量無顯著影響，但對(duì)SS含量影響較大（圖3）。2018年，在干旱脅迫0和30 d時(shí)，施氮處理的Pro含量均較CK顯著增加，但不同施氮時(shí)量處理間無顯著差異；2019年，在干旱脅迫0和15 d時(shí)，施氮處理的Pro含量顯著高于CK，但不同施氮量處理間無顯著差異；各處理在2018年干旱脅迫15 d和2019年干旱脅迫30 d均無顯著差異。SS含量隨施氮量的增加呈上升趨勢(shì)。其中，N3和N4處理的SS量各個(gè)時(shí)期均顯著高于其他處理，但兩者間差異不顯著。

圖3 不同施氮量下黑果枸杞葉片Pro和SS含量Fig.3 Content of Pro and SS in leaf of Lycium ruthenicum Murr under different N applications

2.4 黑果枸杞綜合抗旱性對(duì)施氮量的響應(yīng)

對(duì)SOD、POD、CAT、MDA、Pro和SS 6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，結(jié)果表明（表1），干旱脅迫0 d，黑果枸杞在不同施氮量下的抗旱性依次為：N2＞N1＞CK＞N3＞N4 （2018） 和 N3＞N2＞N1＞N4＞CK（2019）；干旱脅迫15 d，不同施氮處理的抗旱性依次為：N2＞N1＞N3＞N4＞CK（2018）和 N3＞N2＞N4＞CK＞N1（2019）；干旱脅迫30 d，黑果枸杞在不同施氮量下的抗旱性均為：N2＞N3＞N1＞CK＞N4。綜上可知，干旱脅迫0和15 d，N2與N3處理的抗旱性最強(qiáng)；干旱脅迫30 d，N2處理的抗旱性最強(qiáng)，因此，施氮100～150 g·株-1時(shí)有利于提高黑果枸杞的抗旱性。

表1 不同施氮量下黑果枸杞綜合生理指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值Table 1 Average subordinate function values of different N application rates for Lycium ruthenicum Murr.

續(xù)表Continued

3 討論

SOD、POD和CAT等被認(rèn)為是植物中有毒物質(zhì)的清除劑［26］。SOD可以清除植物在外界脅迫環(huán)境下產(chǎn)生的超氧陰離子自由基［27］；POD作為一種重要的保護(hù)酶，被廣泛用于衡量植物在外界脅迫環(huán)境因子下受傷害嚴(yán)重程度的一個(gè)重要指標(biāo)，它和CAT有清除植物體內(nèi)活性氧自由基的作用，在遭遇環(huán)境脅迫時(shí)保護(hù)植物體自身免受或少受傷害，通過其活性的提高來增強(qiáng)植物對(duì)外界環(huán)境的耐受能力［28］。本研究中，隨著施氮量的增加，黑果枸杞葉片中SOD、POD和CAT活性均呈上升趨勢(shì)，表明施氮有利于提升植物體內(nèi)保護(hù)酶的活性，從而增強(qiáng)植物體對(duì)外界逆境脅迫的抵御能力，對(duì)自身的生長(zhǎng)發(fā)育起到保護(hù)作用，這與李建榮［29］的研究結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，過量施氮會(huì)使SOD、POD和CAT活性降低。根據(jù)Fridorich［30］提出的生物自由基傷害學(xué)說推測(cè)，過量施氮可能會(huì)對(duì)植物機(jī)體產(chǎn)生一定程度的影響，活性S氧（reactive oxygen species，ROS）清除等抵御系統(tǒng)的調(diào)控能力可能會(huì)逐漸減弱，從而影響抗氧化酶的活性。

MDA作為細(xì)胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，是衡量膜脂過氧化程度的指標(biāo)，其含量反映了植物細(xì)胞膜透性的強(qiáng)弱和質(zhì)膜受損傷的程度。MDA含量的變化也可反應(yīng)外界條件下植物受脅迫的程度，含量越高說明細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用越強(qiáng)，細(xì)胞膜受破壞程度越大［31］。本研究中，隨著施氮量的增加，黑果枸杞葉片中MDA含量逐漸減少，表明適量的施氮可抑制MDA合成，對(duì)植株正常生長(zhǎng)起一定的保護(hù)作用，這與李娜［32］的研究結(jié)果基本一致，此時(shí)膜脂通透性增強(qiáng)，對(duì)質(zhì)膜起到保護(hù)作用，進(jìn)而降低了植物受外界脅迫的損害程度；但隨著施氮量的持續(xù)增加，MDA含量又明顯升高，表明過量施氮可能會(huì)造成細(xì)胞膜脂的損傷。滲透調(diào)節(jié)是植物抵御干旱脅迫的一種適應(yīng)機(jī)制，植物通過滲透調(diào)節(jié)使細(xì)胞內(nèi)膨壓維持正常，以保證細(xì)胞內(nèi)各種生理過程的正常進(jìn)行［33-34］。Pro和SS是植物在干旱脅迫時(shí)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在生長(zhǎng)環(huán)境遭遇干旱脅迫時(shí)，通過維持滲透平衡來緩沖環(huán)境對(duì)植物的傷害以維持正常代謝［35］。本研究表明，在一定范圍內(nèi)增加施氮量，黑果枸杞葉片中Pro和SS含量有增加趨勢(shì)，表明氮肥對(duì)Pro和SS的合成有一定的促進(jìn)作用，與李永潔等［21］和Kuhns等［36］的研究結(jié)果一致。

植物的抗旱性是多種因素綜合作用的結(jié)果，因此，單一的指標(biāo)很難準(zhǔn)確地描述其抗旱性。本研究綜合多個(gè)指標(biāo)，運(yùn)用隸屬函數(shù)法對(duì)黑果枸杞的抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)表明，適量施氮可以增強(qiáng)黑果枸杞的抗旱性，施氮過量則可能會(huì)影響其抗旱能力。在不同天數(shù)的干旱脅迫下，隨著施氮量的適當(dāng)增加，黑果枸杞的抗旱性逐漸提高；當(dāng)超過一定施氮量后，其抗旱性也隨之降低。在2018—2019年，不同干旱脅迫下黑果枸杞在N2或N3處理時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性，說明施氮有利于提高黑果枸杞的抗旱能力，與王曦等［37］的研究結(jié)果相一致。但研究也發(fā)現(xiàn)，過量施氮可能會(huì)對(duì)植株造成一定的脅迫，因此過量施氮會(huì)影響黑果枸杞的生長(zhǎng)及抗旱性。