魚(yú)類(lèi)干細(xì)胞育種技術(shù)回顧與展望

張彎彎，易梅生

（中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 珠海 519082）

魚(yú)類(lèi)作為人類(lèi)優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白的重要來(lái)源，在滿足不斷增長(zhǎng)的食物和營(yíng)養(yǎng)需求方面占重要地位，其中海水魚(yú)類(lèi)因富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸、維生素和微量元素，對(duì)人類(lèi)健康尤為重要［1］。然而，目前能進(jìn)行規(guī)?；B(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)品種非常有限，并且在長(zhǎng)期的養(yǎng)殖中面臨著種質(zhì)退化等問(wèn)題。因此，運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)創(chuàng)制新種質(zhì)、培育優(yōu)質(zhì)品種是魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求。

品種改良是促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要手段之一。傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)品種改良的方法主要為選擇育種、雜交育種、染色體組操作及性控育種等。近年來(lái)，分子標(biāo)記、全基因組選擇、轉(zhuǎn)基因及基因編輯和細(xì)胞工程等現(xiàn)代生物育種技術(shù)發(fā)展迅速［2］。選擇育種是指對(duì)具有優(yōu)良性狀的個(gè)體進(jìn)行選擇和培育，并輔以功能基因相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行選擇［3］，但經(jīng)多代選擇后近交衰退現(xiàn)象明顯，嚴(yán)重影響育種效率。雜交育種是育種的另一重要方法，20世紀(jì)50年代開(kāi)始在魚(yú)類(lèi)中廣泛應(yīng)用，通過(guò)種間雜交培育了眾多養(yǎng)殖新品系［4-5］，但魚(yú)類(lèi)雜交育種仍存在工作量大、周期長(zhǎng)等局限［6］?；蚓庉嫾夹g(shù)為魚(yú)類(lèi)育種提供了新的技術(shù)手段，已應(yīng)用于多種魚(yú)類(lèi)品系的培育，包括虹鱒、草魚(yú)、鯉魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)和金頭鯛等［7］，具有廣闊的發(fā)展前景。

細(xì)胞工程育種是在細(xì)胞或染色體組水平上進(jìn)行遺傳改良的育種技術(shù)［8］，主要包括多倍體育種、細(xì)胞核移植、干細(xì)胞和單性生殖等。其中，多倍體育種和單性生殖在魚(yú)類(lèi)育種中取得了令人矚目的成就［3-4，9］。近年來(lái)，干細(xì)胞技術(shù)快速發(fā)展，本文主要對(duì)魚(yú)類(lèi)干細(xì)胞誘導(dǎo)和移植技術(shù)的研究進(jìn)展及其在育種中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，總結(jié)魚(yú)類(lèi)干細(xì)胞育種技術(shù)面臨的問(wèn)題，并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望，旨在為魚(yú)類(lèi)育種技術(shù)研究提供參考。

1 魚(yú)類(lèi)干細(xì)胞

干細(xì)胞是在一定條件下具有無(wú)限自我更新和發(fā)育潛能的一類(lèi)細(xì)胞，根據(jù)其來(lái)源可分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細(xì)胞（adult stem cell，ASC）。自小鼠ESC培養(yǎng)成功以來(lái)［10-11］，哺乳動(dòng)物干細(xì)胞在基礎(chǔ)和應(yīng)用研究方面都取得了一系列重大成就。比較而言，低等脊椎動(dòng)物干細(xì)胞研究起步較晚，始于模式動(dòng)物斑馬魚(yú)和日本青鳉 ESC 的培養(yǎng)［12-13］。自 Hong等［14］在青鳉中建立無(wú)滋養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)體系后，干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在多種魚(yú)類(lèi)中獲得成功［15-16］，這些工作為魚(yú)類(lèi)干細(xì)胞的深入研究奠定了基礎(chǔ)。先后建立的半克?。╯emi-cloning）、移植及誘導(dǎo)等干細(xì)胞操作技術(shù)［16-17］顯示出干細(xì)胞在魚(yú)類(lèi)克隆和良種培育等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2 魚(yú)類(lèi)干細(xì)胞移植及應(yīng)用

2.1 胚胎干細(xì)胞移植

胚胎干細(xì)胞具有發(fā)育多能性，一定條件下，在體內(nèi)、體外均可分化為包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類(lèi)型。細(xì)胞移植是誘導(dǎo)干細(xì)胞體內(nèi)分化研究的常用方法。在魚(yú)類(lèi)中，Wakamatsu等［18］使用青鳉囊胚細(xì)胞建立了魚(yú)類(lèi)細(xì)胞移植形成嵌合體的方法。隨后Hong等［19］將長(zhǎng)期培養(yǎng)的青鳉ESC移植到囊胚，發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞能參與受體胚胎多種組織器官的分化，但未能像小鼠ESC那樣實(shí)現(xiàn)供體細(xì)胞的生殖系傳遞。盡管Ma等［20］使用短期培養(yǎng)的斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞成功獲得生殖系嵌合體，但魚(yú)類(lèi)長(zhǎng)期培養(yǎng)ESC的有效生殖系傳遞仍然存在技術(shù)瓶頸。

細(xì)胞核移植是獲得供體細(xì)胞來(lái)源后代個(gè)體的另一方法，即將供體細(xì)胞核通過(guò)顯微操作方法移植到同種或異種動(dòng)物的成熟卵子中以獲得后代個(gè)體。早在20世紀(jì)60年代，童第周等［21］開(kāi)創(chuàng)了魚(yú)類(lèi)核移植研究先河，在金魚(yú)和鳑魚(yú)中證明了魚(yú)類(lèi)細(xì)胞核移植的可行性。1980年，中國(guó)科學(xué)家以鯉魚(yú)細(xì)胞核和鯽魚(yú)細(xì)胞質(zhì)配合培育出核質(zhì)雜種魚(yú)，成為世界上第1條克隆魚(yú)，也是第1例可發(fā)育成熟的異種間胚胎細(xì)胞克隆動(dòng)物［22］。1986年，我國(guó)首次報(bào)道體細(xì)胞克隆動(dòng)物的形成，證實(shí)成年鯽魚(yú)的體細(xì)胞可以去分化和再程序化，具有發(fā)育成個(gè)體的全能性［23］。此后，核移植技術(shù)廣泛應(yīng)用于核質(zhì)雜種克隆魚(yú)研究，為魚(yú)類(lèi)核質(zhì)關(guān)系研究和魚(yú)類(lèi)品種改良的發(fā)展作出了重要貢獻(xiàn)［24］。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞核移植技術(shù)多用于未培養(yǎng)細(xì)胞或短期培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞的核移植尚有局限性，特別是隨著魚(yú)類(lèi)基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞的核移植研究更有意義。Lee等［25］將培養(yǎng)12～26周的斑馬魚(yú)細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中，得到可成活的二倍體后代。Yi等［17］在青鳉中成功培養(yǎng)了單倍體ESC，并將穩(wěn)定表達(dá)熒光標(biāo)記的細(xì)胞核植入成熟卵母細(xì)胞中，獲得首例可育半克隆（semicloned）魚(yú)Holly，其二倍基因組來(lái)源于2個(gè)不同個(gè)體，類(lèi)似于有性生殖產(chǎn)生的后代。因此，ESC培養(yǎng)，特別是單倍體ESC培養(yǎng)，結(jié)合核移植及基因組編輯等技術(shù)是魚(yú)類(lèi)優(yōu)良種質(zhì)創(chuàng)制的重要途徑。

2.2 原始生殖細(xì)胞移植

魚(yú)類(lèi)原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell，PGC）是雌雄配子的前體細(xì)胞。脊椎動(dòng)物PGC移植產(chǎn)生供體細(xì)胞來(lái)源后代的實(shí)驗(yàn)最初在雞中獲得成功［26］。在魚(yú)類(lèi)中，Lin等［27］將斑馬魚(yú)中囊胚卵裂球植入同一發(fā)育階段的受體胚胎中，獲得供體細(xì)胞來(lái)源的后代，表明供體細(xì)胞（含PGC和體細(xì)胞）成功嵌入受體生殖系并分化為功能配子。Takeuchi等［28］用從養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)虹鱒早期性腺中分離的PGC進(jìn)行移植得到了類(lèi)似結(jié)果。種內(nèi)PGC移植在泥鰍中也有嘗試，其PGC移植后產(chǎn)生生殖系嵌合體，嵌合率達(dá)25%，且能夠產(chǎn)生移植后代個(gè)體［29］。在種間移植中，Yamaha等［30］將二倍體金魚(yú)PGC和體細(xì)胞的混合細(xì)胞移植到三倍體鯽魚(yú)中，成功從嵌合體中獲得了金魚(yú)配子。在種間單個(gè)PGC移植中，不同屬（金魚(yú)移植到斑馬魚(yú)）和不同科（泥鰍移植到斑馬魚(yú)）間形成的嵌合體也可以產(chǎn)生供體細(xì)胞來(lái)源的配子［31］。但在不同目或親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的物種間，如日本鰻（Anguillajaponica）到斑馬魚(yú)［32］、鱘（genusAcipenser）到金魚(yú)［33］之間，雖能以較低成功率形成生殖嵌合體，卻不能產(chǎn)生供體細(xì)胞配子。因此，在魚(yú)類(lèi)中，無(wú)論是種內(nèi)還是種間，通過(guò)PGC移植獲得供體細(xì)胞物種來(lái)源的配子切實(shí)可行，但由于魚(yú)類(lèi)胚胎中PGC數(shù)量有限，該方法的廣泛使用，特別是在養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)中的使用存在一定局限。

2.3 生殖干細(xì)胞移植

原始生殖細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂形成精原細(xì)胞（spermatogonia）或卵原細(xì)胞（oogonia）。作為生殖干細(xì)胞，精原細(xì)胞也可以作為細(xì)胞移植技術(shù)的供體細(xì)胞。將小鼠供體精原細(xì)胞移植到不育小鼠的性腺中，可產(chǎn)生具有供體遺傳特征的可育精子［34］。精原細(xì)胞由于數(shù)量多，且易于分離和純化，已成為生殖干細(xì)胞移植的主要細(xì)胞類(lèi)型。在魚(yú)類(lèi)中，將包含精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cell，SSC）的虹鱒精巢細(xì)胞分別移植到剛孵化的雌性和雄性胚胎中，雌雄嵌合體可分別形成源于供體細(xì)胞的成熟精子和卵細(xì)胞，表明SSC在受體胚胎中具有類(lèi)似PGC的分化能力，并且其分化的配子類(lèi)型取決于受體胚胎的性別表型［35］。在種間移植中，Okutsu等［36］將虹鱒的精巢細(xì)胞移植入馬蘇鮭魚(yú)（Oncorhynchusmasou）中，性成熟嵌合體成功產(chǎn)生虹鱒功能配子。這些研究表明，無(wú)論種間還是種內(nèi)，移植的精原細(xì)胞均可產(chǎn)生可育配子。隨后，精原細(xì)胞移植研究在多種淡水和海水魚(yú)類(lèi)中展開(kāi)，在種內(nèi)和種間移植的嵌合體中均得到成熟精子或卵子，包括鯉［37］、青鳉［38］和紅鰭東方鲀（Takifugurubripes）［39］等模式和經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。在種間移植中，隨著供體與受體種類(lèi)間的系統(tǒng)發(fā)育距離增大，特別是不同科或目間，生殖細(xì)胞的移植成功率大大降低。但在淡水魚(yú)中，精原細(xì)胞移植技術(shù)仍然可以在不同種和不同目間移植，例如泥鰍和斑馬魚(yú)（科間）［37］、克林雷氏鯰（Rhamdiaquelen）和尼羅羅非魚(yú)（Oreochromisniloticus）（目間）［40］等。海水魚(yú)類(lèi)由于繁殖周期長(zhǎng)、生長(zhǎng)環(huán)境復(fù)雜，精原細(xì)胞的移植僅局限于科間，且移植的生殖細(xì)胞往往在受體內(nèi)難以分化為成熟的功能性配子［41］。最近，鲆類(lèi)科間的精原細(xì)胞移植取得重要進(jìn)展，中國(guó)科學(xué)院海洋研究所劉清華等將牙鲆、夏牙鲆和大菱鲆的冷凍精原細(xì)胞移植到三倍體牙鲆幼魚(yú)體內(nèi)，分別獲得了100%、75%～95%和33%～50%的供體細(xì)胞嵌合率，并能夠產(chǎn)生源于供體細(xì)胞的精子，成功繁育后代（未發(fā)表資料）。除精原細(xì)胞外，魚(yú)類(lèi)卵原細(xì)胞也可用于移植，Yoshizaki等［42］報(bào)道，分離自6～9月齡虹鱒幼魚(yú)的卵原細(xì)胞在2種性別的受體中都表現(xiàn)出良好的分化可塑性，在雌雄受體中分別分化為成熟卵子和精子，產(chǎn)生正常后代個(gè)體。

綜上，生殖干細(xì)胞移植在魚(yú)類(lèi)育種中表現(xiàn)出育種時(shí)間短、效率高的顯著優(yōu)勢(shì)，但該技術(shù)操作難度大、技術(shù)體系尚未完全成熟以及在不同魚(yú)類(lèi)中應(yīng)用的共性問(wèn)題等需要進(jìn)一步完善。

2.4 生殖干細(xì)胞移植操作過(guò)程及影響因素

生殖干細(xì)胞移植是近年發(fā)展起來(lái)并逐步完善的一項(xiàng)魚(yú)類(lèi)生殖操作新技術(shù)，其過(guò)程大致可歸納為3個(gè)主要步驟：①供體細(xì)胞分離、純化和鑒定；②受體準(zhǔn)備；③細(xì)胞移植。提高細(xì)胞移植成功率的關(guān)鍵在于供體細(xì)胞時(shí)期的選擇和移植受體的制備。

生殖干細(xì)胞可從幼魚(yú)或成魚(yú)性腺中通過(guò)機(jī)械和酶解等方法分離。常用的細(xì)胞純化方法包括密度梯度離心和流式分選等，密度梯度離心的介質(zhì)包括Percoll、Ficoll和BSA等［43］；流式分選法多用于模式魚(yú)類(lèi)，通過(guò)表達(dá)熒光標(biāo)記的生殖細(xì)胞標(biāo)記基因（如vasa）啟動(dòng)子，借助流式細(xì)胞技術(shù)可有效分選熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，從而達(dá)到純化精原細(xì)胞的目的［44］。在經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中，可用生殖細(xì)胞表面蛋白，如虹鱒Ly75蛋白［45］和羅非魚(yú)Gfra1受體［46］等作為精原細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記。

生殖干細(xì)胞移植受體可以是胚胎、幼魚(yú)或成魚(yú)。除受體與供體親緣關(guān)系和繁殖周期等對(duì)生殖干細(xì)胞移植的成功率有顯著影響外，受體育性也是影響生殖系嵌合體形成的重要因素。移植操作中，合適發(fā)育時(shí)期的胚胎受體可以直接用于移植，若在移植前去除或減少受體胚胎生殖細(xì)胞，則可顯著提高移植成功率。目前，生殖細(xì)胞去除方法有化學(xué)處理、物理處理、遺傳操作或組合處理。白消安（busulfan）可通過(guò)影響旺盛分裂的細(xì)胞去除性腺中的生殖細(xì)胞。Lacerda等［47］使用白消安結(jié)合熱處理羅非魚(yú)成魚(yú)約12周，成功去除精巢中的生殖細(xì)胞。染色體組操作是另一種產(chǎn)生不育移植受體的方法，通過(guò)二倍體和四倍體個(gè)體雜交，或者在受精后對(duì)卵子用靜水壓和熱休克等方法處理可產(chǎn)生三倍體不育個(gè)體［2］。使用三倍體作為生殖干細(xì)胞移植受體在種內(nèi)和種間移植都有成功的報(bào)道［39］。另外，通過(guò)基因編輯技術(shù)敲除或敲降生殖細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵基因（如deadend）抑制生殖細(xì)胞形成也是消除移植受體生殖細(xì)胞的有效方法［48］。

3 魚(yú)類(lèi)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)和分化

3.1 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)

ESC具有分化多能性，在體內(nèi)和體外可分化為各種細(xì)胞類(lèi)型。小鼠ESC可在體外誘導(dǎo)成PGC，并分化為具有功能的精子和卵子［49］。在魚(yú)類(lèi)中盡管也建立了多種海、淡水魚(yú)的ESC細(xì)胞系，但尚沒(méi)有ESC體外分化成生殖細(xì)胞的報(bào)道，因此，這是魚(yú)類(lèi)ESC研究中亟需突破的技術(shù)瓶頸。

3.2 生殖干細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

存在于性腺中的生殖干細(xì)胞維持著生物體生命周期中配子的發(fā)生和世代間遺傳信息的傳遞。同ESC一樣，生殖干細(xì)胞在合適的條件下可以進(jìn)行增殖和分化。但相較于ESC，SSC培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展較慢，主要由于SSC在體外培養(yǎng)中難以成為長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞系。Hong等［16］首次使用青鳉成魚(yú)精巢建立精原干細(xì)胞系SG3，SG3細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)中長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)，在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下可進(jìn)入減數(shù)分裂并產(chǎn)生活動(dòng)精子。

雖然魚(yú)類(lèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)的SSC細(xì)胞系數(shù)量有限，且缺乏分化為功能配子的能力，但通過(guò)誘導(dǎo)短期培養(yǎng)SSC體外分化是配子形成的另一可行途徑。Miura等［50］將日本鰻的精原細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，在精巢培養(yǎng)體系中用11-酮基睪酮誘導(dǎo)成熟精巢中的A型和早期B型精原細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂，形成精子。采用類(lèi)似的誘導(dǎo)策略，精子體外誘導(dǎo)在羅非魚(yú)［51］和青鳉［52］中也得以成功實(shí)現(xiàn)。這些體外誘導(dǎo)的精子不論是否具有受精能力都表明誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)SSC分化為精子是可行的。2002年，Sakai等［53］在以Sertoli細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中，將從斑馬魚(yú)精巢中分離的精原細(xì)胞誘導(dǎo)分化為功能精子，并通過(guò)人工受精獲得正常胚胎。隨著近年來(lái)體外誘導(dǎo)系統(tǒng)的優(yōu)化，目前已在多種經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)中實(shí)現(xiàn)了可育精子的誘導(dǎo)，如胡子鯰［54］、南亞野鯪［55］和虹鱒［56］等。魚(yú)類(lèi)體外精子誘導(dǎo)體系的建立和優(yōu)化，為縮短魚(yú)類(lèi)育種周期提供了技術(shù)支撐。

3.3 影響生殖干細(xì)胞誘導(dǎo)效率的因素

魚(yú)類(lèi)生殖干細(xì)胞體外成功誘導(dǎo)主要取決于2個(gè)關(guān)鍵因素：細(xì)胞因子和培養(yǎng)微環(huán)境。細(xì)胞因子可以顯著促進(jìn)和提高精原細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。在鰻魚(yú)精原細(xì)胞體外分化中，11-酮基睪酮的誘導(dǎo)作用至關(guān)重要［50］。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子是另一類(lèi)SSC分化促進(jìn)因子，Lif、Fgf2和Gdnf等能夠顯著提高斑馬魚(yú)生殖細(xì)胞存活率和維持生殖細(xì)胞特性［57］。研究表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子和人絨毛膜促性腺激素也有促進(jìn)精原細(xì)胞增殖的作用［51］。隨著研究的不斷開(kāi)展，將有更多更有效的細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)。

生殖干細(xì)胞的體外分化依賴于特定的微環(huán)境。在斑馬魚(yú)精原細(xì)胞分化中，源于精巢的飼養(yǎng)細(xì)胞腫瘤樣細(xì)胞ZtA6或Sertoli細(xì)胞通過(guò)表達(dá)sox9a等因子來(lái)維持細(xì)胞分化的微環(huán)境［53］。此外，培養(yǎng)誘導(dǎo)體系的空間結(jié)構(gòu)也影響細(xì)胞分化效率，在培養(yǎng)系統(tǒng)中模擬體內(nèi)精巢的囊性結(jié)構(gòu)可顯著提高精子的形成效率。Higaki等［58］研究了瀕危魚(yú)類(lèi)暗斑頜須（Gnathopogoncaerulescens）精原細(xì)胞的體外分化，發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)體系的誘導(dǎo)效率顯著高于2D體系。目前，有各種商業(yè)化3D培養(yǎng)系統(tǒng)可用于細(xì)胞培養(yǎng)。近期，本課題組以3D trans-well（BD）為基礎(chǔ)支架建立3D細(xì)胞培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)海水魚(yú)中華烏塘鱧生殖干細(xì)胞分化，取得了良好效果，誘導(dǎo)30 d后可產(chǎn)生大量可育精子，并能以較高效率授精卵母細(xì)胞。將該誘導(dǎo)系統(tǒng)用于淡水魚(yú)斑鱧和草魚(yú)，同樣成功誘導(dǎo)出有運(yùn)動(dòng)能力的精子（未發(fā)表資料）。

4 展望

魚(yú)類(lèi)主要通過(guò)有性生殖繁衍后代。受精卵經(jīng)胚胎發(fā)育形成個(gè)體，個(gè)體生長(zhǎng)到一定階段達(dá)到性成熟，產(chǎn)生生殖細(xì)胞，繁育后代。不同種類(lèi)的魚(yú)繁殖周期存在較大差異，通常從一年到幾年甚至十幾年。經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)的繁殖周期一般較長(zhǎng)，無(wú)論是通過(guò)選育法還是雜交法，新品種的培育往往需要花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間。生殖干細(xì)胞移植和誘導(dǎo)等生殖細(xì)胞操作技術(shù)能大大縮短配子形成時(shí)間，加快育種進(jìn)程，同時(shí)也便于基因操作，因此在經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)育種中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。然而，生殖細(xì)胞操作技術(shù)研究雖然在近年來(lái)取得了較大進(jìn)展，但有一些關(guān)鍵問(wèn)題亟待解決。①無(wú)論是生殖干細(xì)胞體外誘導(dǎo)還是移植嵌合體體內(nèi)分化，其效率均偏低。如何針對(duì)特定種類(lèi)，提高功能配子的產(chǎn)生效率，仍然存在技術(shù)挑戰(zhàn)。②魚(yú)類(lèi)種類(lèi)繁多，其生殖和生理特性多種多樣。在生殖細(xì)胞移植中，不同目、科、屬和種的魚(yú)類(lèi)間存在細(xì)胞排異現(xiàn)象，使供體細(xì)胞和受體魚(yú)種類(lèi)的選擇受到限制。如能突破親緣關(guān)系的局限，即可擴(kuò)大受體選擇范圍，特別是選擇繁育周期短的魚(yú)類(lèi)作為受體則可顯著提高移植成功率。③生殖細(xì)胞誘導(dǎo)和移植技術(shù)目前只在為數(shù)不多的魚(yú)類(lèi)中取得成功，尤其是在大宗養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)中的研究較少；同時(shí)，用于每種魚(yú)類(lèi)的移植和誘導(dǎo)體系各有差異，而同一體系用于不同魚(yú)類(lèi)所產(chǎn)生的效果也差別較大。如用于中華烏塘鱧的3D誘導(dǎo)體系，應(yīng)用于斑鱧時(shí)可較高效率地產(chǎn)生精子，但用于草魚(yú)時(shí)則產(chǎn)生較多形態(tài)不正常的精子。因此生殖細(xì)胞操作應(yīng)用于各種魚(yú)類(lèi)的技術(shù)共性還有待突破。這需要在更多更有代表性的魚(yú)類(lèi)中廣泛開(kāi)展研究，積累總結(jié)共性技術(shù)的基礎(chǔ)資料和經(jīng)驗(yàn)。④生殖細(xì)胞操作與其他現(xiàn)代育種技術(shù)結(jié)合不夠緊密?；蚓庉嫾夹g(shù)育種和分子標(biāo)記輔助育種等是現(xiàn)代魚(yú)類(lèi)育種的發(fā)展趨勢(shì)［2］，生殖細(xì)胞操作技術(shù)研究應(yīng)加強(qiáng)與這些育種方法的結(jié)合。同時(shí)，干細(xì)胞培養(yǎng)和體外誘導(dǎo)技術(shù)的發(fā)展也為基因編輯技術(shù)用于魚(yú)類(lèi)新種質(zhì)的快速創(chuàng)制創(chuàng)造了條件?？傊?，在魚(yú)類(lèi)干細(xì)胞育種技術(shù)研究中，應(yīng)著重解決這些問(wèn)題。隨著魚(yú)類(lèi)干細(xì)胞操作技術(shù)的發(fā)展，將其與基因和基因組操作技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)“試管配子”以培養(yǎng)魚(yú)類(lèi)新品種將成為重要育種方法，極大地促進(jìn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)種業(yè)的發(fā)展。