蛋白質(zhì)S-亞硝基化與消化系統(tǒng)腫瘤關(guān)系的研究進展

呂 煜 ，胡義波 ，王嘉鑫 ，蘇有橦 ，代佑果

（1）浙江省人民醫(yī)院/杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院急診科，浙江 杭州 310014;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院/云南省癌癥中心胃與小腸外科，云南 昆明 650118;3）姑息醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650118）

近年來，隨著對氧化還原類蛋白質(zhì)翻譯后修飾的深入研究，蛋白質(zhì)巰基亞硝基化在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控中的作用日益受到人們關(guān)注。病理狀態(tài)下，由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達產(chǎn)生的高濃度一氧化氮（nitric oxide，NO）可引起區(qū)域相關(guān)蛋白質(zhì)S-亞硝基化修飾，影響多種疾病的病理生理過程。研究表明，蛋白質(zhì)S-亞硝基化在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要作用，本文主要就其與消化道腫瘤相關(guān)進展作一綜述。

1 NO 的S-亞硝基化作用

NO 是一種存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的信使，它可以通過介導(dǎo)靶細(xì)胞中的多種信號傳導(dǎo)途徑從而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞凋亡、增殖，神經(jīng)信號傳遞等[1]。在哺乳動物細(xì)胞中，NO 的主要來源是由三種亞型的一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）所介導(dǎo)，分別是依賴經(jīng)典cGMP 信號通路的Ⅰ型神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）和Ⅲ型內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），而Ⅱ型誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）則是將炎癥與癌癥聯(lián)系起來的關(guān)鍵作用酶。大量實驗研究和基于人群的研究表明，慢性炎癥在致癌中的作用越來越明顯，特別是在癌促發(fā)和進展階段[2-3]。例如肝、膽、胃、前列腺部癌和胰腺癌都與炎癥有因果關(guān)系。炎癥可誘導(dǎo)多種轉(zhuǎn)錄因子的異常激活，例如核因子-κB（nuclear factor-k-gene binding，NF-κB ），激活 蛋白1（activator protein-1，AP-1）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor 1，HIF-1α）等。iNOS是炎癥的主要介質(zhì)，它不依賴鈣離子信號，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下不表達或很少表達，在炎癥或免疫反應(yīng)過程中會通過巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞釋放大量NO，受炎癥因子刺激或細(xì)胞應(yīng)激后活化產(chǎn)生大量NO，NO 進而氧化形成活性氮（reactive nitrogen species，RNS），通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯后S-亞硝基化修飾作用影響炎癥和細(xì)胞凋亡[4]。細(xì)胞內(nèi)高濃度的RNS 會導(dǎo)致高濃度的S-亞硝基化蛋白，這個過程可以通過改變癌癥發(fā)展過程中重要的靶標(biāo)和途徑來驅(qū)動癌變，其速度比健康組織要快的多[5]。相等濃度的NO 和超氧化物會導(dǎo)致ONOO-的形成，而過量2 至3 倍的NO 主要會導(dǎo)致三氧化二氮（N2O3）的形成，這被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境中的主要S-亞硝基化劑[4]。在已知的相關(guān)研究中，S-亞硝基化底物的數(shù)量達到3 000 多種，包括多種轉(zhuǎn)錄因子、代謝酶、氧化還原酶、蛋白激酶、離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白等，而其對底物特異性的因素之一就是NOS 能與作為S-亞硝基化目標(biāo)的蛋白質(zhì)之間的相互作用[6]。

2 S-亞硝基化與消化系統(tǒng)腫瘤

2.1 胃癌

盡管胃癌的治療在外科和新輔助化療和單純化療方面取得了進展，但胃癌仍然是全球衛(wèi)生系統(tǒng)的主要負(fù)擔(dān)。炎癥與癌癥是相互作用的病理生理過程，胃癌發(fā)展的主要危險因素之一是幽門螺旋桿菌的感染，盡管胃黏膜會產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，但它仍能存活下來，從而有利于從慢性胃炎到腺癌等疾病。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator transcript 1，SIRT1）是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）輔酶的III 型組蛋白去乙?；?，通過使細(xì)胞凋亡，DNA 損傷修復(fù)以及代謝相關(guān)的各種蛋白質(zhì)去乙酰化，成為各種病理生理過程的重要調(diào)節(jié)劑[7]。一方面，SIRT1 可通過調(diào)節(jié)多種組蛋白去乙酰化以調(diào)節(jié)染色質(zhì)功能，如組蛋白4 賴氨酸4;另一方面，SIRT1 可通過去乙?；饔谜{(diào)節(jié)非組蛋白生成，如轉(zhuǎn)錄因子p53、NFκB、叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)OXO）等，從而調(diào)控基因的表達[8-11]。SIRT1 的過表達通常與不良預(yù)后相關(guān)[12]。胃上皮細(xì)胞暴露在幽門螺旋桿菌環(huán)境下會導(dǎo)致iNOS 的產(chǎn)生，進而可能導(dǎo)致胃癌的基因改變，實驗和臨床證據(jù)表明，在胃癌患者第一次的內(nèi)鏡檢查中顯示出會有較高的iNOS 表達[13]。SIRT1 的S-亞硝基化作用，可通過iNOS 調(diào)節(jié)合成的NO 作用實現(xiàn)。亞硝基化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶能夠被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)與SIRT1 相互作用，在一氧化氮合成酶的作用下將亞硝基傳給SIRT1，使SIRT1 的第387 和390 位半胱氨酸位點發(fā)生亞硝基化[14]。證據(jù)表明SIRT1激活劑作用的細(xì)胞表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)減輕[15]。NFκB 是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，主要由p65/p50 亞基組成，對人類炎癥和各種惡性腫瘤的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用[16]。SIRT1 的S-亞硝基化修飾可以抑制SIRT1 活性，進而激活NFκB[17]。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是具有多功能的炎癥細(xì)胞因子，通過與受體相互作用，激活NF-κB，TNF-α 誘導(dǎo)下游SIRT1 蛋白與NF-κB 的RelA/p65 亞基相互作用，并通過在賴氨酸310 處使RelA/p65 去乙酰化來抑制轉(zhuǎn)錄[18-19]。用非甾體抗炎藥治療胃潰瘍應(yīng)激模型，在體內(nèi) S-亞硝基化 NF-κB p65 蛋白，抑制胃粘膜前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2），顯著增加了促炎細(xì)胞因子TNF-α 水平。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，可以得出結(jié)論：SIRT1 抑制促炎信號傳導(dǎo)，而這種信號通常在轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞中被不適當(dāng)?shù)丶せ?。因此，可以通過抑制異常激活的促炎信號來預(yù)防炎癥相關(guān)的癌變。遺憾的是，目前缺乏相關(guān)蛋白質(zhì)S-亞硝基化與胃癌發(fā)展的相關(guān)研究，有待進一步探究。

2.2 結(jié)直腸癌

一項納入19例結(jié)直腸癌患者的臨床研究中結(jié)果顯示癌組織中的總S-亞硝基化水平顯著高于相鄰的正常組織[20]。在腸道中，iNOS 活性的增加被認(rèn)為是促炎的[21-22]。6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶（6-pyruvoyl tetrahydropterin synthase deficiency，PTPS）是參與從頭合成iNOS 的必要輔助因子，在早期結(jié)直腸癌中高表達的 PTPS 在低氧條件下被腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）在 Thr 58 磷酸化，這種磷酸化促進PTPS與轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合蛋白1（latent transforming growth factor β binding protein 1，LTBP1）的結(jié)合，并隨后通過PTPS/ iNOS/ LTBP1 復(fù)合物中近端偶聯(lián) BH4 的產(chǎn)生來促進 iNOS 介導(dǎo)的 LTBP1 S-亞硝基化，LTBP1 S-亞硝基化導(dǎo)致蛋白酶體依賴性LTBP1 蛋白降解，阻止了轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的分泌和TGF-β 誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長停滯，并促進了早期結(jié)直腸腫瘤的發(fā)展[23]。當(dāng)使用iNOS 抑制劑1 400 w 時作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29 和HCT116時，表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖和遷移，同時使用1 400 w 和5 氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）能提高抗癌的增敏性[24]。有趣的是，在結(jié)直腸癌中，并非所有蛋白質(zhì)的S-亞硝基化都能促進腫瘤的生長。微囊藻毒素-LR（microcystin-LR，MC-LR）是一種藍藻毒素，可啟動正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的凋亡，當(dāng)使用MC-LR 處理結(jié)直腸癌SW480 細(xì)胞72 h 后，NO 應(yīng)激誘導(dǎo)糖酵解酶3-磷酸甘油醛脫氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）Cys150 位點的 S-亞硝基化修飾，導(dǎo)致其與泛素連接酶 Siah1 結(jié)合后的核易位，核GAPDH可以促進核靶蛋白的降解，啟動p53 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[25]。同樣的研究結(jié)果，NO 供體或iNOS 過表達誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞質(zhì)中促凋亡刺激物死亡受體CD95 的Cys199 和Cys304 的S-亞硝基化，促使腫瘤壞死因子受體Fas 重新分布到脂筏，形成誘導(dǎo)死亡信號復(fù)合物，促進了結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡，同時也發(fā)現(xiàn)Fas 在對細(xì)胞凋亡不太敏感的結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達量通常比較低，因此Fas S-亞硝基化誘導(dǎo)劑能提高Fas 的敏感性[26]。不同研究結(jié)果表明，在結(jié)直腸癌中，不同蛋白質(zhì)的S-亞硝基化可以通過不同的通路促進或抑制癌癥的發(fā)展。

2.3 肝細(xì)胞癌

人類的肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）與iNOS 的升高表達密切相關(guān)，S-亞硝基化的應(yīng)激性增加促進了HCC 的發(fā)生和進展。過去的研究中已經(jīng)證明酒精和慢性肝炎是HCC 的危險因素，實驗研究發(fā)現(xiàn)，酒精喂養(yǎng)的小鼠蛋白質(zhì)S-亞硝基化增加進而誘導(dǎo)HCC 形成[27]。主要的脫亞硝基化酶，S-亞硝基谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GSNOR）是一種無處不在的高度保守的酶，它的下調(diào)導(dǎo)致 S-亞硝基化蛋白的積累，可以防止過度的蛋白質(zhì)S-亞硝基化，具有線粒體自噬降解能力，這與腫瘤的誘導(dǎo)和進展有關(guān)[28-31]。值得注意的是，GSNOR 在大約50%的HCC 患者中顯著減少，在GSNOR-/-的小鼠極易感染和引發(fā)HCC[32]。在缺失GSNOR 的小鼠經(jīng)iNOS 誘導(dǎo)后，可以致Parkin 蛋白S-亞硝基化增加，進而促進肝癌的發(fā)展，可以通過iNOS 抑制劑來預(yù)防由GSNOR 缺乏引起的HCC[32-33]。在用一線靶向藥索拉菲尼治療HCC 晚期患者時，檢測到凋亡誘導(dǎo)受體Fas 的S-亞硝基化降低，這也有助于減少肝癌細(xì)胞的生長[34]。同樣的結(jié)果，O6-烷基鳥嘌呤-DNA 烷基轉(zhuǎn)移酶（O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase，AGT）是參與 DNA 損傷反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在體外和體內(nèi)均檢測到AGT Cys145 處的 S-亞硝基化，促進了AGT 蛋白酶體降解以及致癌烷基鳥嘌呤的積累，從而促進HCC 的發(fā)展[35]。但是，在HCC 中，是否不同蛋白質(zhì)的S-亞硝基化都具有促癌作用仍需進一步驗證。

2.4 胰腺導(dǎo)管腺癌

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）源于胰腺外分泌細(xì)胞，是最常見的胰腺癌亞型，占胰腺惡性病例的85%以上[36]。PDAC 中iNOS、eNOS 和nNOS 的表達明顯增加，在這項研究中，通過特定部位的蛋白質(zhì)組學(xué)，在PDAC 患者癌組織和胰腺導(dǎo)管腺癌PANC-1 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的S-亞硝基化蛋白數(shù)量比相鄰的非癌組織多，還表明在相鄰的非癌組織中，S-亞硝基化蛋白主要與基本生物過程相關(guān)，如原細(xì)胞代謝、生物質(zhì)量調(diào)節(jié)、應(yīng)激和刺激反應(yīng)、催化過程、氧化和減少、繼發(fā)代謝和轉(zhuǎn)化啟動，但在PDAC組織和PANC-1 細(xì)胞中，S-亞硝基化蛋白在細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、細(xì)胞運動等癌癥的啟動、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色，這些過程都與腫瘤形成有關(guān)[37]。在進行KEGG 通路數(shù)據(jù)庫分析表明，胰腺癌通路的成分被廣泛S-亞硝基化，如細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，CDC42），轉(zhuǎn)錄激活因子1（activator of transcription 1，STAT1），Ras相 關(guān)C3 肉毒菌素物底物1（ras-related C3 botulinum toxin，Rac1），Ras 相關(guān)C3 肉毒菌素物底物2（ras-related C3 botulinum toxin，Rac2）和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（activator of transcription 3，STAT3）[37]。此外，NOS 抑制劑顯著抑制了PANC-1 細(xì)胞中的STAT3 S-硝基化，導(dǎo)致STAT3 磷酸化和PANC-1 細(xì)胞存活率顯著提高，表明蛋白質(zhì)S-亞硝基化在PDAC 發(fā)育中的重要作用[37]。在這項研究中，STAT3 被確定為胰腺癌背景下的S-亞硝基化蛋白，NOS 抑制劑STAT3 S-硝基化減少，STAT3 磷酸化和胰腺癌細(xì)胞存活率升高，進一步表明S-亞硝基化在PDAC 發(fā)病機理中的重要作用[37]。在PDAC 中，蛋白質(zhì)的S-亞硝基化可以促進癌細(xì)胞的增殖。

3 小結(jié)

綜上所述，各種證據(jù)表明，蛋白質(zhì)的S-亞硝基化廣泛參與了消化道系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與耐藥過程，不同蛋白質(zhì)在S-亞硝基化后會發(fā)生功能獲得或功能喪失的修飾，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥相關(guān)。考慮在疾病炎癥階段檢測不同癌癥蛋白質(zhì)表達，干預(yù)其S-亞硝基化狀態(tài)，會更有利于降低癌癥的發(fā)生率，對于已經(jīng)發(fā)展為腫瘤的患者對相關(guān)蛋白S-亞硝基化修飾進行干預(yù)，為腫瘤治療提供新的靶點并且可以延緩患者對腫瘤藥物的耐藥性。盡管如此，考慮到S-亞硝基化在不同癌癥類型中的眾多靶點，且目前相關(guān)研究并不多，用于操縱該過程以獲得治療效果的方法有很多種，探索蛋白質(zhì)S-亞硝基化在不同腫瘤微環(huán)境中不盡相同的作用使其具體分子機制仍待深入探討，有望為癌癥患者的臨床治療及預(yù)防開辟新路徑。