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    大黃魚分子育種相關(guān)技術(shù)研究進(jìn)展

    2022-11-19 06:41:30彭士明王亞冰高權(quán)新鄭漢豐王魯民
    海洋漁業(yè) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:大黃魚基因組圖譜

    彭士明,王亞冰,王 倩,高權(quán)新,鄭漢豐,許 建,王魯民

    (1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090;2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,浙江湖州 313000;3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院,北京 100141)

    大黃魚是我國海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的魚類,為了推進(jìn)大黃魚產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展,我國諸多學(xué)者陸續(xù)開展了大黃魚的良種選育研究,并取得了良好的進(jìn)展[1]。大黃魚優(yōu)良品種"閩優(yōu)1號"、“東海1號”和“甬岱1號”相繼問世,有力推動了我國大黃魚“育-繁-推”一體化產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)。雖然通過群體選育、家系選育可以選育出具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的品種,但是傳統(tǒng)的育種技術(shù)也存在周期長、效率低、預(yù)見性差等缺陷,極大限制了大黃魚種業(yè)發(fā)展的步伐。

    早在20世紀(jì)60年代,就有專家提出了基于分子標(biāo)記開展選育的設(shè)想,然而這種當(dāng)時(shí)超前的觀點(diǎn)卻并沒有得到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注[2]。到了20世紀(jì)90年代,DNA分子標(biāo)記的價(jià)值逐漸被重視和挖掘,并且經(jīng)過幾十年的飛速發(fā)展,分子輔助育種技術(shù)逐漸成為引導(dǎo)全球魚類育種革新的焦點(diǎn)。早期應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記主要包括限制性酶切片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、微衛(wèi)星標(biāo)記(simple sequence repeat,SSR)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)標(biāo)記等等。SSR和SNP標(biāo)記因其具有多態(tài)性高、易于檢測、遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為全球分子標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域的主體技術(shù)。進(jìn)入21世紀(jì)后,SSR和SNP標(biāo)記開始用于大黃魚的遺傳改良研究[3-6]。

    1 大黃魚分子育種相關(guān)技術(shù)概述

    隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展和低成本運(yùn)營模式的推動,大黃魚分子輔助育種發(fā)展迅速。新型的基因分型和分析技術(shù)不斷涌現(xiàn),并在大黃魚育種研究中得以廣泛應(yīng)用。采用全基因組重測序(whole genome resequencing,WGR)和簡化基因組測序(restriction-site-associated DNA sequencing,RAD-Seq)技術(shù)可以挖掘出大量的SNP信息,這為SNP分型奠定了基礎(chǔ)。然后,基于基因型數(shù)據(jù)可以構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜,并用于數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus,QTL)定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)。目前,已經(jīng)確定了一系列與大黃魚經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn),包括生長特性、抗病能力、性腺發(fā)育和抗逆性狀等?;谶@些SNP,分子標(biāo)記輔助育種(marker-assisted selection,MAS)和全基因組選擇技術(shù)(genomic selection,GS)已被用于大黃魚育種。伴隨著大黃魚基因組的破譯,得以在全基因組的水平上對目標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,提高了人工選育的效能,加速了大黃魚育種的進(jìn)程[7-9]。我國現(xiàn)已開發(fā)了大量SNP標(biāo)記,同時(shí)對重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行了QTL定位和GWAS分析,這為大黃魚品質(zhì)改良和抗病抗逆育種提供了重要的數(shù)據(jù)支撐[10-12]。

    2 大黃魚分子育種相關(guān)技術(shù)研究進(jìn)展

    2.1 RAD-Seq測序技術(shù)

    RAD-Seq技術(shù)于2007年問世,該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶將基因組進(jìn)行酶切,并利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行序列檢測。因?yàn)镽AD-Seq技術(shù)不需要全基因組,因此該方法適用于所有的水產(chǎn)動物。RAD-Seq技術(shù)成本低,因此已成為基因分型和SNP標(biāo)記選育的常見技術(shù)[13]。但該技術(shù)的主要缺陷是可能檢測不到與目標(biāo)性狀相關(guān)的等位基因,因?yàn)檫@種方法的測序范圍僅限于與限制酶位點(diǎn)相關(guān)的序列,這就導(dǎo)致基因組的很多區(qū)域不能檢測[14]。LIU等[15]采用RAD-Seq技術(shù)在5個(gè)養(yǎng)殖及野生群體的120尾大黃魚中發(fā)現(xiàn)了7 161個(gè)SNP標(biāo)記,并指出在中國沿海水域的野生種群中,大黃魚存在兩個(gè)遺傳譜系。ZHOU等[16]采用RAD-Seq技術(shù)分析了與大黃魚生長性狀相關(guān)的遺傳信息,并結(jié)合GWAS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了與體型顯著相關(guān)的SNP和候選基因(bmp7、col1a1、col11a2和col18a1),這為開展大黃魚的分子標(biāo)記輔助選育提供了較為可靠的遺傳標(biāo)記。

    2.2 遺傳連鎖圖譜與QTL定位

    遺傳圖譜是以基因連鎖、重組交換值構(gòu)建的圖譜,顯示與性狀關(guān)聯(lián)遺傳標(biāo)記的相對位置。待測物種的遺傳背景必須是已知的,這是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的前提條件。迄今為止,已經(jīng)構(gòu)建了40多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的高密度遺傳連鎖圖譜,其中大多數(shù)水產(chǎn)動物的高密度連鎖圖譜是基于SNP或SSR 標(biāo)記完成的[17]。早在2007年,NING等[18]就構(gòu)建了首個(gè)大黃魚遺傳連鎖圖譜。近十年來,我國有關(guān)大黃魚連鎖圖譜的研究逐漸增多,并為大黃魚的分子育種打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。YE等[19]基于大黃魚的兩個(gè)半同胞家系構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜,發(fā)現(xiàn)了289個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(93個(gè)EST-SSRs),共整合為24個(gè)連鎖群,并在5個(gè)連鎖群上檢測到了7個(gè)QTL位點(diǎn);AO等[20]構(gòu)建了大黃魚的遺傳連鎖圖譜,總長度為5 451.3 cM,位點(diǎn)之間的平均距離為0.54 cM;KONG等[21]對大黃魚的抗刺激隱核蟲性狀進(jìn)行了QTL定位,并發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與抗病性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)和候選基因(ifnar1、ifngr2、ikbke和CD112);ZHAO等[22]亦對大黃魚抗刺激隱核蟲性狀進(jìn)行了GWAS分析,在2個(gè)種群中發(fā)現(xiàn)了15個(gè)QTL和2個(gè)候選基因(casp8和traf6),上述研究為大黃魚的生長和抗病性狀的遺傳標(biāo)記選育提供了有效的序列信息。高密度遺傳連鎖圖譜為大黃魚精準(zhǔn)定位、基因編輯和全基因組選擇育種提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。

    經(jīng)濟(jì)性狀多為數(shù)量性狀且受多基因控制,傳統(tǒng)的育種方法難以做到準(zhǔn)確選擇,因此構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜并進(jìn)行QTL定位,可以開發(fā)出有效控制經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳標(biāo)記。一個(gè)數(shù)量性狀的表型大多受多個(gè)基因的控制,而QTL定位的目的是確定導(dǎo)致該數(shù)量性狀變異的相應(yīng)基因位點(diǎn)。迄今為止,國內(nèi)外已對近百種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物進(jìn)行了QTL定位,其中包括魚類、軟體動物、甲殼動物和棘皮動物,主要性狀涉及生長、抗病能力、脅迫響應(yīng)、形態(tài)性狀、耐溫性、肉質(zhì)和性別決定等[17,23-26]。分子標(biāo)記在構(gòu)建大黃魚遺傳圖譜方面的應(yīng)用起步較晚,這在一定程度上制約了大黃魚分子育種的發(fā)展。

    2.3 GWAS分析

    GWAS是在全基因組水平上開展大規(guī)模、多樣本、反復(fù)驗(yàn)證的基因序列與目的性狀的關(guān)聯(lián)性分析技術(shù),進(jìn)而尋找與目的性狀相關(guān)遺傳因素的研究方法,以確定與性狀相關(guān)的遺傳基因。GWAS可用于分析數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀,包括識別新的變異性狀,檢測單基因和多基因控制的性狀信息[27]。隨著全基因組測序成本的降低,目前GWAS技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用逐漸增多,已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良。涉及的主要性狀有尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的性腺分化、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的肌肉產(chǎn)量[28]、凡納濱對蝦(Litopeneaus vannamei)的生長性狀[29]、扇貝(Patinopecten yessoensis)的殼色[30]和虹鱒的抗病性狀等[31]。

    XIAO等[32]采用高通量全基因組測序技術(shù)完成了世界上首個(gè)大黃魚全基因組物理圖譜,并將大黃魚的全基因組圖譜組裝成686張圖譜,總長度為727 Mb,N50長度(126張圖譜)達(dá)到1.7 Mb,這為深入研究大黃魚生長、抗病、耐寒等性狀的遺傳機(jī)制和性狀改良育種打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外,國內(nèi)的諸多學(xué)者已經(jīng)運(yùn)用GWAS分析獲得了與大黃魚生長性狀、抗病性狀、性腺發(fā)育、肌肉品質(zhì)、性別指數(shù)性狀和耐高溫性狀等關(guān)聯(lián)的SNP多態(tài)位點(diǎn)、候選基因及QTL信息[22,33-43],這為后續(xù)開展大黃魚經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良提供了重要的分子工具。通過大黃魚經(jīng)濟(jì)性狀基因位點(diǎn)或者等位基因的聚合和選育,可以全面提高養(yǎng)殖大黃魚生產(chǎn)性能,促進(jìn)大黃魚增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

    2.4 全基因組重測序和分析

    WGR技術(shù)可以對不同個(gè)體進(jìn)行全基因組測序,全面解讀基因組上的變異信息,從而計(jì)算該變異信息與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性。隨著WGR價(jià)格不斷降低,其應(yīng)用也逐漸增多。但由于WGR的計(jì)算數(shù)據(jù)量非常大,所以對這些數(shù)據(jù)集的分析需要花費(fèi)大量的時(shí)間,而且此類分析也需要較大的計(jì)算資源和存儲空間。全基因組低深度重測序(low-coverage whole-genome sequencing,LcWGS)可以減少測序數(shù)據(jù)量并降低測序成本,通過基因型填充得到高密度SNP,并為基因組育種值(genomic estimated breeding values,GEBV)和GS提供幫助。ZHANG等[44]發(fā)現(xiàn),對大黃魚分別進(jìn)行0.5x與8x的重測序,兩者的精度相似,因此認(rèn)為LcWGS適用于大黃魚的GS。

    近年來,隨著許多水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的全基因組被陸續(xù)破解,在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域,WGR被廣泛用于檢測目的性狀的遺傳信息、環(huán)境適應(yīng)機(jī)理以及選育效果驗(yàn)證,包括瓦氏雅羅魚(Leuciscus waleckii)的適應(yīng)性遺傳分化[45]、鯉(Cyprinus carpio)的遺傳多樣性[46]、南方鲇(Silurus meridionalis)的性別連鎖分子標(biāo)記開發(fā)[47]、大西洋鮭(Salmo salar)的雄性發(fā)育、大菱鲆(Scophthalmus maximus)的抗病特性[48]以及點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus coioides)耐氨氮能力[49]等等。KON等[50]使用WGR技術(shù)對來自寧德和舟山的大黃魚進(jìn)行了遺傳種群結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)了不同水域大黃魚存在的遺傳差異基因位點(diǎn),并揭示了適應(yīng)性馴化養(yǎng)殖所造成的遺傳特征。WAN 等[38]針對大黃魚變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)引起的內(nèi)臟白點(diǎn)病開展了抗病性狀的WGR分析,基于254 110個(gè)SNPs信息在3、5和20號染色體上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與抗病相關(guān)的候選區(qū)域,并發(fā)現(xiàn)了抗病性狀的候選基因(IL10、THBS1、IGSF21、IGR、IGH、IRF8、TRAIL、CC、TNF和LINGO1)。

    2.5 SNP芯片開發(fā)與應(yīng)用

    SNP芯片技術(shù)是開展大批量SNP基因分型的有效方法。與必須進(jìn)行復(fù)雜文庫制備和密集生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)處理的高通量測序技術(shù)相比,SNP芯片技術(shù)的操作流程和統(tǒng)計(jì)分析要簡單得多。且大批量的測序無可避免的可能導(dǎo)致誤差的產(chǎn)生,但是SNP芯片技術(shù)不存在這種問題,而且其可重復(fù)性較好。然而,SNP芯片也存在較大的缺陷,比如標(biāo)記信息往往不全。由于SNP芯片標(biāo)記主要是基于已測序品種的基因組序列開發(fā)的,而在育種過程中常常會引入外地品種、野生品種甚至近緣種群的優(yōu)異基因組片段,因此現(xiàn)有育種芯片可能無法識別不同遺傳資源中的特有變異序列,這也限制了外源片段的導(dǎo)入和識別。

    SNP芯片分型技術(shù)更適用于具有完整基因組數(shù)據(jù)以及分子育種相對成功的物種,而測序技術(shù)更適用于新的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種或處于育種初始階段的品種。因此,未來進(jìn)行基因分型的技術(shù)可能是將測序技術(shù)和SNP芯片技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合,其技術(shù)成功的關(guān)鍵取決于物種遺傳標(biāo)記的有效性。ZHOU等[51]使用SNP芯片(NingXin-I)對5個(gè)種群96尾大黃魚進(jìn)行了效果評估,發(fā)現(xiàn)83.38% SNP具有多態(tài)位點(diǎn),并確定了跨種群SNP的有效性為26.68%~56.23%。

    2.6 全基因組選擇技術(shù)

    雖然在確定了主效QTL位點(diǎn)后,MAS可用于性狀的強(qiáng)化選育,然而對于復(fù)雜的數(shù)量性狀,分子標(biāo)記的效果卻十分有限,而GS可以作為一個(gè)更好的替代技術(shù)[52]。GS可以對物種全基因組位點(diǎn)的遺傳效應(yīng)進(jìn)行全面估計(jì),并使用多種分析方法生成一個(gè)方程來預(yù)測GEBV,最后將GEBV與實(shí)際表型值進(jìn)行比較,使用具有基因型和表型數(shù)據(jù)的驗(yàn)證群體來評估預(yù)測方程的準(zhǔn)確性。LIU等[53]對3 000多個(gè)群體進(jìn)行生長性狀的遺傳力分析,準(zhǔn)確率為80%。預(yù)測精度還取決于識別出的SNP的數(shù)量,也就是SNP密度越高越好,QTLs位點(diǎn)至少有一個(gè)SNP,這樣SNP效應(yīng)的估計(jì)就可以捕捉更多的遺傳變異信息。QIU等[54]基于SNP標(biāo)記的方法估計(jì)了9個(gè)數(shù)量性狀的遺傳參數(shù),發(fā)現(xiàn)SNP數(shù)量降低時(shí)遺傳力的估計(jì)值通常也會降低,體長、體高、體寬和內(nèi)臟重之間存在較高的表型和遺傳相關(guān)性。DONG等[55]評估了大黃魚體質(zhì)量、體長和肉質(zhì)(n-3HUFA)的遺傳力值,比較了不同計(jì)算模型的預(yù)測準(zhǔn)確度,評估GS所需要的SNP的有效性,并著重指出將GS用于生長和肉質(zhì)性狀選育是完全可行的。董林松等[56]開發(fā)了基因組預(yù)測方法的兩種新的計(jì)算策略和一種新的FBayesC預(yù)測方法,并將這些基因組預(yù)測方法用于大黃魚經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良研究,同時(shí)使用單標(biāo)記分析和貝葉斯模型對大黃魚的經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行GWAS比較研究,研究成果不僅提供了節(jié)省基因組育種費(fèi)用的方法,而且有助于推動大黃魚基因組選擇育種的進(jìn)程。

    2.7 基因編輯技術(shù)

    如果可以確定控制性狀的種內(nèi)或種間變異的等位基因,那么運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯對性狀不利或有利的等位基因,可以達(dá)到優(yōu)化性狀的目的。CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)在很多魚類中獲得了成功,包括鮭科魚類(大西洋鮭和虹鱒)、鯉科魚類(Labeo rohita,Ctenopharyngodon idella和Cyprinus carpio)、鯰科魚類(Ictalurus punctatus等)、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)、尼羅羅非魚和金頭鯛(Sparus aurata)等[57-62]。

    迄今為止,水產(chǎn)養(yǎng)殖動物基因編輯的主要目標(biāo)性狀包括不育化、生長性狀和抗病能力等?;蚓庉嬙谒a(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛,主要原因是魚類易于獲得成千上萬的體外受精胚胎,并且這些胚胎足夠大,便于手動顯微注射。使用大規(guī)模家系選育可以在一定程度上控制背景遺傳效應(yīng),并且可以獲得足夠的樣本量,以便將基因編輯與非編輯個(gè)體進(jìn)行比較。目前尚未有CRISPR/Cas9技術(shù)在大黃魚分子育種方面的相關(guān)報(bào)道,但是隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展,CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于大黃魚的良種選育也是可以期待的。另外,多基因性狀對于基因編輯技術(shù)而言是一個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn),因?yàn)樾枰瑫r(shí)編輯關(guān)聯(lián)同一性狀的多個(gè)等位基因才能達(dá)到優(yōu)化性狀的目的,因此需要開發(fā)和改進(jìn)多重基因組編輯方法。

    3 展望

    當(dāng)今世界,高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速,測序成本也急劇下降,基因組組裝技術(shù)也更加精準(zhǔn),大黃魚大量候選基因和遺傳位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道,為開展大黃魚分子育種提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。一些分子育種技術(shù)已經(jīng)用于大黃魚的良種選育,并取得了顯著成效[63-64]?,F(xiàn)代基因測序技術(shù)的發(fā)展推動了育種技術(shù)的革新,大黃魚育種技術(shù)必然隨著遺傳學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展而不斷進(jìn)步。我國大黃魚分子育種起步較晚,研究基礎(chǔ)較為薄弱,但是我國大黃魚種質(zhì)資源豐富,市場需求量巨大,得天獨(dú)厚的產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)是推動大黃魚分子育種發(fā)展的有利條件,具有廣闊的發(fā)展前景。徐鵬等[65]先后開發(fā)了大黃魚育種芯片“寧芯1號”和"寧芯2號"。大黃魚分子育種技術(shù)的不斷成熟和突破,將引發(fā)傳統(tǒng)育種方式的重大變革。

    種業(yè)是水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的命脈和根基,是國家“十四五”乃至今后相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的核心攻關(guān)任務(wù)。當(dāng)前,大黃魚種業(yè)創(chuàng)新研發(fā)面臨前所未有的大好形勢。盡管目前我國在大黃魚遺傳育種領(lǐng)域已取得了一些重要進(jìn)展,但在前沿育種技術(shù)領(lǐng)域仍存局限性,很多熱點(diǎn)領(lǐng)域與技術(shù)有待發(fā)展和突破。首先,大黃魚的基因編輯制種仍處于探索起步階段?,F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的主效基因,后續(xù)可以利用基因編輯技術(shù)對目的基因進(jìn)行精準(zhǔn)功能解析,并開展種質(zhì)創(chuàng)制,從而達(dá)到優(yōu)化性狀的目的。第二,全基因組選擇技術(shù)是一種基于全基因組范圍的分子標(biāo)記進(jìn)行育種值計(jì)算和選擇的高效育種方法,可大幅推廣應(yīng)用,并結(jié)合當(dāng)今熱點(diǎn)組學(xué)技術(shù)、人工智能設(shè)計(jì)育種方案,構(gòu)建復(fù)雜性狀的精準(zhǔn)控制理論體系,驅(qū)動大黃魚育種加速向精準(zhǔn)化、高效化和智能化發(fā)展,從而為大黃魚種業(yè)科技創(chuàng)新帶來新的生機(jī)與活力。第三,腸道菌群作為新興研究領(lǐng)域,對于大黃魚的健康發(fā)育至關(guān)重要,并且與宿主基因和經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān),今后可以構(gòu)建“經(jīng)濟(jì)性狀-腸道菌群-遺傳基因”的一體化模型,為大黃魚的種業(yè)創(chuàng)新提供新的理論視角與技術(shù)支持。

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