低鹽條件下擬穴青蟹幼蟹氨基酸與脂肪酸含量變化研究

王亞美，趙 明，馬凌波，馬春艷，朱之發(fā)，史方方，王雪陽(yáng)，王 偉，蔣科技，張鳳英

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

擬穴青蟹（Scylla paramamosain）屬軟甲綱，十足目，梭子蟹科，青蟹屬，常棲于比海水鹽度稍低的泥沼與溝壑中，如入?？凇⒊遍g帶和紅樹(shù)林等［1］。擬穴青蟹生長(zhǎng)迅速、成體規(guī)格大、營(yíng)養(yǎng)豐富，是我國(guó)東南沿海重要的經(jīng)濟(jì)蟹類［2］。隨著經(jīng)濟(jì)繁榮和生活質(zhì)量的提高，人們對(duì)水產(chǎn)品的需求量日益增加，水產(chǎn)品因其低脂肪和高蛋白質(zhì)而備受青睞。由于海洋漁業(yè)資源日益匱乏，水產(chǎn)養(yǎng)殖成為漁業(yè)發(fā)展的重要方向。同時(shí)，海水品種的淡化養(yǎng)殖可減輕海水養(yǎng)殖對(duì)沿岸海洋環(huán)境的污染，也可促進(jìn)內(nèi)陸水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，降低養(yǎng)殖成本，成為水產(chǎn)養(yǎng)殖重要的發(fā)展方向之一。青蟹屬于廣鹽性甲殼動(dòng)物，滲透調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)［1］，使其成為低鹽度水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)選物種。

鹽度是影響甲殼類動(dòng)物存活和生長(zhǎng)的關(guān)鍵非生物因素，也是甲殼類水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的重要因素［3-5］。水生動(dòng)物對(duì)鹽度的生理反應(yīng)涉及到各種組織（如肌肉、肝胰腺）的氨基酸和脂肪酸含量變化，甲殼動(dòng)物儲(chǔ)存的氨基酸、脂肪酸含量和組成是受外部環(huán)境和內(nèi)部系統(tǒng)綜合調(diào)節(jié)的結(jié)果，可在一定條件下反映機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)水平、攝食狀況、健康水平及環(huán)境改變時(shí)機(jī)體的生理生化調(diào)節(jié)。已有研究報(bào)道，鹽度可影響甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)［6］及氨基酸［7-10］、脂肪酸［9，11-13］的組成和含量。目前，低鹽脅迫對(duì)擬穴青蟹幼蟹氨基酸和脂肪酸含量的影響研究尚少見(jiàn)，本文通過(guò)對(duì)鹽度20、10、0下擬穴青蟹幼蟹肌肉與肝胰腺中氨基酸和脂肪酸含量及組成進(jìn)行分析，旨在探究低鹽對(duì)擬穴青蟹幼蟹肌肉與肝胰腺中氨基酸和脂肪酸含量和組成的影響，為低鹽養(yǎng)殖下青蟹營(yíng)養(yǎng)成分的變化提供基礎(chǔ)資料，并為低鹽條件下幼蟹營(yíng)養(yǎng)生理與營(yíng)養(yǎng)需求研究提供一定的參考，豐富幼蟹營(yíng)養(yǎng)學(xué)的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用蟹為擬穴青蟹Ⅱ期仔蟹，取自本實(shí)驗(yàn)室福建養(yǎng)殖基地，挑選大小相同、健康、活力強(qiáng)、無(wú)殘缺的個(gè)體共630只，平均體質(zhì)量為（19.53±0.39）mg。由于青蟹領(lǐng)地意識(shí)強(qiáng)且相互蠶食，為排除搶奪食物、相互蠶食對(duì)本實(shí)驗(yàn)的干擾，采用單體養(yǎng)殖方式，制作630個(gè)可與周?chē)w充分交換的白色柱狀塑料瓶（直徑10 cm、高20 cm、水深約15 cm），每個(gè)瓶中放一只幼蟹，將瓶放置在水循環(huán)系統(tǒng)的玻璃養(yǎng)殖缸（1.6 m×0.65 m×0.45 m）中，瓶上編號(hào)并在底部鋪設(shè)洗凈曝曬過(guò)的細(xì)沙（厚約4 cm）。實(shí)驗(yàn)設(shè)置20、10和0鹽度組，每組210只幼蟹。每個(gè)鹽度組設(shè)置3個(gè)養(yǎng)殖缸，每70只幼蟹置于一個(gè)養(yǎng)殖缸內(nèi)作為一個(gè)平行。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將擬穴青蟹Ⅱ期仔蟹置于養(yǎng)殖缸里的瓶中，暫養(yǎng)7 d適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，暫養(yǎng)水體鹽度為20，用曝氣的淡水與濃縮鹽鹵混合配制鹽水。采用曝氣的淡水將每個(gè)養(yǎng)殖缸的鹽度以每12 h降低2的速率調(diào)至實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的鹽度后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)，正式養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)時(shí)間為30 d。

1.2 養(yǎng)殖管理

在所有鹽度組降為設(shè)置鹽度后，每天觀察記錄擬穴青蟹生長(zhǎng)和蛻殼存活狀況，將新鮮縊蟶（Sinonovacula constricta）剝殼去掉腹腔內(nèi)臟、外套膜、鰓后，剪成塊，洗凈，每個(gè)瓶中均勻投喂多塊，保持每只蟹所投喂食物營(yíng)養(yǎng)成分接近，飽食投喂，次日將殘餌撈出。采用循環(huán)水系統(tǒng)將養(yǎng)殖水體進(jìn)行過(guò)濾和凈化處理，每個(gè)養(yǎng)殖缸連續(xù)24 h充氧，實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖期間水溫保持在（26±2）℃，pH 8.0～8.3，溶氧量3.1～3.5 mg·L-1。每天測(cè)量各試驗(yàn)組水體鹽度，必要時(shí)補(bǔ)充淡水以保持水體鹽度穩(wěn)定。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，禁食24 h后取樣，為排除蛻殼周期對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的影響，取處于同一蛻殼階段（蛻殼后第6天）的擬穴青蟹，將其從水循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，置冰上麻醉后解剖，分別取肌肉和肝胰腺。每個(gè)平行各取10只，每個(gè)鹽度組分別取樣30只，放置于-80℃冰箱中保存。

1.4 氨基酸和脂肪酸測(cè)定

氨基酸和脂肪酸含量測(cè)定參考國(guó)標(biāo)方法［14］，氨基酸含量采用鹽酸水解法（GB／T 5009.124-2003），經(jīng)氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。脂肪酸采用氣相色譜法（GB／T 5009.168-2003）測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan多重比較法檢驗(yàn)不同鹽度組組間差異，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸組成與含量

本實(shí)驗(yàn)在擬穴青蟹肌肉和肝胰腺中檢測(cè)出17種氨基酸，包括9種必需氨基酸（EAA）和8種非必需氨基酸（NEAA），色氨酸（Tyr）在檢測(cè)過(guò)程中的酸性水解中結(jié)構(gòu)發(fā)生改變未被檢出（表1，表2）。其中，NEAA中的Asp、Glu、Gly和Ala屬呈味氨基酸（DAA）。

2.1.1 肌肉中氨基酸含量

不同鹽度組肌肉中氨基酸含量見(jiàn)表1。肌肉中總氨基酸（TAA）、EAA、NEAA、DAA含量均隨鹽度的降低而顯著減少（P＜0.05），呈現(xiàn)鹽度20＞10＞0趨勢(shì)。Asp、Ser、Glu、Thr、Gly、Ala、Val、IIe、Leu、Lys、His、Pro和Arg氨基酸含量也呈現(xiàn)此趨勢(shì)。與鹽度20組相比，鹽度0組肌肉中氨基酸含量均降低；鹽度10組肌肉中大部分氨基酸含量降低，Met和Tyr含量增加。與鹽度20組相比，鹽度10組TAA、EAA、NEAA含量分別降低6.32%、4.07%、7.54%，鹽度0組分別降低12.92%、9.42%、14.81%。

表1 擬穴青蟹幼蟹肌肉中氨基酸含量（mg·100 g-1，濕重）Tab.1 Muscle amino acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.1.2 肝胰腺中氨基酸含量

不同鹽度組肝胰腺中氨基酸含量見(jiàn)表2。TAA、NEAA含量在鹽度10、0組中比鹽度20組顯著增加（P＜0.05），呈現(xiàn)鹽度10＞0＞20（P＜0.05）趨勢(shì)。鹽度10組EAA含量大于 鹽度0和20組，鹽度0、20組EAA含量無(wú)顯著差異。Asp、Thr、Ser、Glu、Ala、Val、IIe、His、Lys和Arg氨基酸含量也呈現(xiàn)鹽度10＞0＞20趨勢(shì)。與鹽度20組相比，鹽度10組TAA、EAA、NEAA含量分別增加20.16%、10.65%、26.67%，鹽度0組分別增加5.92%、0.66%、9.52%。

表2 擬穴青蟹幼蟹肝胰腺中氨基酸含量（mg· 100 g-1，濕重）Tab.2 Hepatopancreas amino acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.1.3 各鹽度下肌肉和肝胰腺中氨基酸的組成（%TAA）

如表3所示，從組織內(nèi)氨基酸組成來(lái)看，所有鹽度下擬穴青蟹的肌肉氨基酸組分中，NEAA比例均高于EAA。兩組織之間相比，肝胰腺中EAA比例高于肌肉，肌肉中NEAA、DAA比例高于肝胰腺。低鹽下，NEAA比例在肌肉中降低，在肝胰腺中增高。綜合兩組織來(lái)看，與正常鹽度相比，低鹽下EAA比例增高，NEAA比例降低。

表3 擬穴青蟹組織中不同氨基酸占各組織總氨基酸的比例（%TAA）Tab.3 Ratio of amino acids content to total amino acids content in tissues of Scylla paramamosain（%TAA）

2.2 脂肪酸組成與含量

2.2.1 肌肉脂肪酸含量

本實(shí)驗(yàn)在擬穴青蟹肌肉中檢測(cè)出19種脂肪酸，包括10種飽和脂肪酸（SFA），4種單不飽和脂肪酸（MUFA），5種多不飽和脂肪酸（PUFA）（表4）。肌肉中總脂肪酸（TFA）、SFA、MUFA、PUFA含量均隨鹽度的降低而顯著增多（P＜0.05），呈現(xiàn)鹽度0＞10＞20趨勢(shì)。肌肉中脂肪酸含量非常低，與鹽度20組相比，鹽度0、10組肌肉中各脂肪酸含量均增多。

表4 擬穴青蟹幼蟹肌肉中脂肪酸含量（mg·100 g-1，濕重）Tab.4 Muscle fatty acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.2.2 肝胰腺中脂肪酸含量

本實(shí)驗(yàn)在擬穴青蟹肝胰腺中檢測(cè)出18種脂肪酸，包括9種SFA、4種MUFA和5種PUFA。肝胰腺中TFA、SFA、MUFA、PUFA含量均隨鹽度的降低而顯著減少（P＜0.05），呈現(xiàn)鹽度20＞10＞0趨勢(shì)（表5）。與鹽度20組相比，鹽度10組 TFA、SFA、MUFA、PUFA 含量分別降低31.25%、32.35%、32.46%、28.18%，鹽度0組分別降低52.85%、53.44%、46.60%、56.53%。

表5 擬穴青蟹幼蟹肝胰腺中脂肪酸含量（mg· 100 g-1，濕重）Tab.5 Hepatopancreas fatty acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.2.3 各鹽度組織中脂肪酸的組成（%TFA）

如表6所示，各個(gè)鹽度下的肝胰腺和肌肉脂肪酸組分中，SFA占各組織總脂肪酸的比例最高，其次為PUFA，MUFA最低。肌肉中的SFA和PUFA比例均高于肝胰腺，而MUFA比例低于肝胰腺。低鹽下SFA比例在肌肉中增加，在肝胰腺中降低。PUFA、n-3PUFA、DHA比例：肌肉中為鹽度0 ＞10＞20，肝胰腺中為鹽度10＞20＞0，肌肉和肝胰腺兩組織總和為鹽度10＞20＞0。

表6 擬穴青蟹組織中不同脂肪酸占各組織總脂肪酸的比例（%TFA）Tab.6 Ratio of fatty acids content to total fatty acids content in tissues of Scylla paramamosain（%TFA）

如表7所示，綜合各鹽度處理組的兩組織中氨基酸／脂肪酸含量總和得出，與鹽度20組相比，鹽度10組兩組織中氨基酸總量增加0.36%，脂肪酸總量降低25.61%，鹽度0組兩組織中氨基酸總量降低8.14%，脂肪酸總量降低42.51%。

表7 不同鹽度下擬穴青蟹肌肉和肝胰腺中TAA和TFA趨勢(shì)、含量和變化率Tab.7 Trend，content and change rate of TAA and TFA in muscle and hepatopancreas of Scylla paramamosain in different salinities

3 討論

氨基酸和脂肪酸在鹽度適應(yīng)中起重要作用［15］，擬穴青蟹機(jī)體中積累的氨基酸、脂肪酸含量是吸收／合成與消耗的綜合結(jié)果，而其吸收／合成量與消耗量受食物營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境脅迫和脅迫適應(yīng)能力等影響。

3.1 低鹽脅迫對(duì)氨基酸的影響

低鹽脅迫下，蝦蟹中氨基酸含量和組成會(huì)發(fā)生變化。本研究中，擬穴青蟹肌肉中TAA、EAA、NEAA含量從大到小的順序?yàn)辂}度20＞10＞0。以往對(duì)不同鹽度下養(yǎng)殖擬穴青蟹幼蟹的研究發(fā)現(xiàn)，鹽度25組肌肉TAA含量（mg·g-1，干重）高于鹽度5組［16］；中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）成蟹不同鹽度養(yǎng)殖30 d，肌肉TAA含量為鹽度20組高于0［9］；泥蟹（Panopeus herbstii）低鹽下肌肉氨基酸也明顯減少［7］，本研究結(jié)果與其一致。原因可能是因?yàn)榈望}下氨基酸用于產(chǎn)能以應(yīng)對(duì)低鹽脅迫導(dǎo)致［17-20］，后續(xù)可進(jìn)一步開(kāi)展青蟹氨基酸相關(guān)代謝途徑研究。

甲殼動(dòng)物肝胰腺被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物肝和胰腺的同源器官，是代謝反應(yīng)的主要場(chǎng)所，其主要功能包括分泌酶、吸收和存儲(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及卵黃發(fā)生等［21］。肝胰腺對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的蓄積可反映機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）低鹽度下（鹽度3）肝胰腺中總可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于中（鹽度17）、高鹽度（鹽度32）（P＜0.05）［8］。本實(shí)驗(yàn)肝胰腺中TAA、NEAA含量呈現(xiàn)鹽度10＞0＞20趨勢(shì)（P＜0.05），表明降低鹽度使肝胰腺中氨基酸含量增多，與先前報(bào)道中低鹽下肝胰腺中氨基酸含量增多的結(jié)果一致［16］，具體機(jī)制需進(jìn)一步探究。本研究肌肉中NEAA降低量、肝胰腺中NEAA增高量均高于EAA，NEAA可能在鹽度脅迫中起重要作用。

3.2 低鹽脅迫對(duì)脂肪酸的影響

水生廣鹽動(dòng)物依靠能量重組來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境鹽度的變化，水生動(dòng)物的鹽度脅迫是能量-消耗（占總代謝能量的20%～50%）過(guò)程［22］。脂類是重要的產(chǎn)能營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，代謝產(chǎn)生的許多脂肪酸是水生動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的。

本研究在3種鹽度中養(yǎng)殖擬穴青蟹幼蟹30 d后，所有鹽度下肌肉中脂肪酸含量均極低，TFA隨鹽度下降而增加，呈現(xiàn)鹽度0＞10＞20趨勢(shì)。中華絨螯蟹成蟹不同鹽度養(yǎng)殖30 d，肌肉脂肪酸含量為鹽度0＞20［9］，本研究趨勢(shì)與其一致，表明低鹽脅迫可使擬穴青蟹肌肉中脂肪酸含量增加。本研究肌肉中n-3-PUFA、DHA的含量和占比隨鹽度的降低而增加，與鋸緣青蟹（Scylla serrata）［11］、凡納濱對(duì)蝦［12］研究結(jié)果一致。鹽度0組中肌肉SFA占比高于鹽度10組和鹽度20組，與曾霖等［20］研究報(bào)道的趨勢(shì)一致。

肝胰腺是蟹類能量?jī)?chǔ)存的重要器官［23］，與肌肉相比，鹽度對(duì)肝胰腺中脂肪酸組成影響更大。在本研究中，低鹽下擬穴青蟹幼蟹肝胰腺中TFA含量大幅降低，鹽度0組TFA降低52.85%，鹽度10組TFA降低31.25%，總脂肪酸含量為鹽度20＞10＞0，與不同鹽度養(yǎng)殖30 d后中華絨螯蟹成蟹肝胰腺總脂肪酸變化趨勢(shì)（鹽度20＞0）相同［9］。脂肪酸在鹽度適應(yīng)的能量補(bǔ)充中起重要作用，飽和脂肪酸主要通過(guò)氧化提供足夠的能量以滿足額外的能量需求［12，24］。水生動(dòng)物的多不飽和脂肪酸受鹽度影響較大，是海水水生動(dòng)物維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和機(jī)能完整性的重要生理功能物質(zhì)［25］。n-3PUFA可提高水生動(dòng)物對(duì)滲透脅迫的抵抗力，增加細(xì)胞膜滲透性和流動(dòng)性［25-27］，也可增加鰓面積和酶效率，以提高低鹽度滲透調(diào)節(jié)能力，并提高存活率［29-31］。研究發(fā)現(xiàn)低鹽脅迫可顯著增強(qiáng)肝胰腺中脂肪酸生物合成［32］，且低鹽脅迫可促進(jìn)脂肪動(dòng)員和脂解能力［12］。本研究低鹽下肝胰腺中脂肪酸含量降低，可能因?yàn)榈望}下脂肪酸用于供能和增加膜流動(dòng)性，且這種消耗量可能大于其食物攝取或自身合成量以致積累減少。

較高的n-3PUFA、DHA水平能提高對(duì)鹽脅迫的耐受性和抵抗力，提高存活率，也在蛻皮和生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用［26-29，33-34］。本研究鹽度0組肝胰腺中PUFA、n-3-PUFA、DHA的含量和占比最低，可能是由于低鹽度下幼蟹中脂肪酸消耗增加，且食物中沒(méi)有足夠的補(bǔ)充或擬穴青蟹低鹽適應(yīng)能力較低導(dǎo)致肝胰腺中儲(chǔ)存降低。這可能也是本課題組發(fā)現(xiàn)鹽度0組擬穴青蟹存活率很低、生長(zhǎng)最慢的原因之一。與鹽度20組相比，鹽度10組肝胰腺中PUFA、n-3PUFA、DHA的含量降低，占比增加（鹽度10＞20＞0）。先前報(bào)道鋸緣青蟹幼蟹［11］在不同鹽度下肝胰腺中n-3PUFA占比為鹽度12＞20＞4，兩者趨勢(shì)一致，適當(dāng)降低鹽度可使肝胰腺中n-3PUFA、DHA占比增加。

4 小結(jié)

本文研究結(jié)果表明，在慢性低鹽條件下，擬穴青蟹肌肉和肝胰腺中氨基酸、脂肪酸均產(chǎn)生了顯著變化。肌肉中氨基酸含量下降，肝胰腺中氨基酸表現(xiàn)出一定積累；脂肪酸含量在肌肉中增多（所有鹽度下肌肉中脂肪酸含量均很低），在肝胰腺中大幅下降。綜合各鹽度組兩組織中氨基酸或脂肪酸含量總和得出，鹽度10組兩組織中總氨基酸含量及n-3PUFA、DHA比例增加，總脂肪酸含量降低；鹽度0組兩組織中總氨基酸、總脂肪酸含量及n-3PUFA、DHA比例均降低。本研究可為低鹽養(yǎng)殖下青蟹營(yíng)養(yǎng)成分的變化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。在今后研究中，還需進(jìn)一步探究氨基酸、脂肪酸代謝及其在適應(yīng)環(huán)境鹽度變化中的作用?？山Y(jié)合本實(shí)驗(yàn)各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化趨勢(shì)，進(jìn)一步開(kāi)展低鹽度下擬穴青蟹營(yíng)養(yǎng)生理和營(yíng)養(yǎng)需求試驗(yàn)，提高低鹽度下青蟹的存活率及生長(zhǎng)性能。