新型冠狀病毒核酸檢測質量控制物質研究及應用進展*

陳穎瑋，趙冉，王雪亮(上海市臨床檢驗中心質控品研發(fā)實驗室，上海 200126)

新型冠狀病毒(以下簡稱新冠病毒)被國際病毒分類委員會命名為SARS-CoV-2，屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬，是一種有包膜的正單鏈核糖核酸(RNA)病毒，會引起嚴重的呼吸道感染[1]。自2019年12月被報道以來，新冠病毒及其多個“需關切突變株”(variants of concern，VOC)，如阿爾法、德爾塔、奧密克戎等，在全球范圍內的感染人數(shù)已超過4億，其中包括近600萬的死亡病例[2]，且該人數(shù)仍在持續(xù)增長中。

為有效控制疫情，需采取便捷可靠的篩查方式，以及時發(fā)現(xiàn)傳染源并切斷疫情傳播途徑。實時熒光PCR因具有靈敏度高、特異性強、檢測周期短、可自動化、高通量批處理等優(yōu)點，被認為是新冠病毒檢測的金標準[3-4]。實時熒光PCR的關鍵步驟包括核酸抽提、逆轉錄、擴增等，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會影響其檢測質量。為有效保證核酸檢測質量，需要借助于能評價檢測系統(tǒng)性能或監(jiān)測實驗室檢測結果重復性和準確性的質量控制物質，如標準物質和質控品等。目前在臨床中使用的新冠病毒核酸檢測質量控制物質分為陰性和陽性質量控制物質。陰性質量控制物質形式較為簡單，如《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第九版)》(聯(lián)防聯(lián)控機制綜發(fā)〔2022〕71號)中要求實驗室使用生理鹽水作為陰性質量控制物質，以監(jiān)測實驗室可能出現(xiàn)的假陽性情況。而陽性質量控制物質形式多樣，主要包括患者樣本、病毒培養(yǎng)和人工制備物質等類型。本文對新冠病毒核酸檢測陽性質量控制物質的不同種類及應用情況進行介紹，以期為新冠病毒核酸檢測質量控制物質的合理選用提供參考。

1 患者樣本

患者樣本是臨床常用的質量控制物質之一，可經(jīng)臨床確診的新冠患者鼻咽拭子、灌洗液等樣本滅活稀釋制備而成。此類型樣本作為質控品，可監(jiān)控檢測結果的精密度，特別是在缺乏商品化質控品的情況下。如G?rzer等[5]在奧地利新冠病毒核酸檢測室間質量評價(external quality assessment，EQA)中使用3個100倍稀釋的口鼻拭子樣本，而后在第3次EQA中，又使用B.1.1.7突變株在內的2個患者樣本[6]，對于監(jiān)測實驗室檢測結果的準確性起到了重要作用。

患者樣本具有與臨床樣本一致的組成成分，可真實地反映實際檢測情況，使得檢測結果更具有說服力。但由于其自身成分復雜，可能存在生物安全方面的問題，加之患者陽性樣本難以獲取，這在一定程度上限制了其臨床應用。

2 病毒培養(yǎng)樣本

病毒培養(yǎng)樣本是將新冠病毒經(jīng)細胞(如Vero E6細胞)培養(yǎng)、純化滅活處理后得到可用作質量控制物質的樣本。Baronti等[7]采用Vero E6細胞培養(yǎng)2020/FR/702新冠病毒，用蔗糖作為穩(wěn)定劑，將收獲病毒凍干分裝后可作為標準物質供臨床使用。Matheeussen等[8]使用經(jīng)數(shù)字PCR定量的新冠病毒培養(yǎng)樣本開展EQA活動，發(fā)現(xiàn)部分實驗室對低濃度樣本檢出率較低，為相關實驗室后續(xù)提升檢測質量提供了建議。Sung等[9]在韓國組織的EQA中采用Vero細胞培養(yǎng)的新冠病毒模擬上呼吸道樣本，要求報告假陰性的實驗室采取額外糾正措施并參與后續(xù)EQA，對實驗室發(fā)現(xiàn)檢測中存在的潛在問題和持續(xù)質量改進起到推進作用。

培養(yǎng)病毒的樣本具有完整的病毒結構，也是較為理想的質量控制物質類型。但由于病毒培養(yǎng)需在三級生物安全實驗室中展開，且需經(jīng)滅活處理，這也增加了其生產與使用的局限性。

3 人工制備的樣本

3.1質粒樣本 質粒是存在于染色體外的遺傳物質，能獨立復制并表達攜帶的遺傳信息，是常用的載體類型。常見質粒制備方式是將外源基因片段插入載體，轉染感受態(tài)大腸埃希菌增殖表達，經(jīng)過純化可獲得含有目的片段的質粒[10]。質粒生產工藝成熟，穩(wěn)定性好，易于構建，能夠準確定量，且可通過測序得到準確的堿基序列，是商品化核酸檢測試劑盒中最為常見的質控品類型[11]。然而，高濃度質粒容易造成環(huán)境氣溶膠污染。Mascuch等[12]報道實驗室在研制新冠病毒核酸檢測試劑過程中發(fā)現(xiàn)在處理質粒的實驗室以及相鄰實驗室物表上有陽性質粒污染。

質粒易于制備且方便定量，可被用于評估新冠病毒核酸檢測方法或試劑性能，如檢測下限的確定、標準曲線繪制、重復性檢測等。但質粒與實際病毒樣本相差較大，需要添加額外基質樣本以更好地模擬臨床樣本，如陰性唾液樣本。此外，質粒也無法監(jiān)控核酸抽提過程以及RNA逆轉錄過程。因此，作為廣泛應用的商品化質控品類型，質粒仍存在較大不足。

3.2體外轉錄的RNA樣本 體外轉錄是指在體外模擬體內轉錄過程，通過RNA轉錄酶合成RNA片段。如將合成的新冠病毒靶標DNA片段構建入含有T7啟動子的載體中，利用T7 RNA聚合酶進行體外轉錄可得到相應的RNA片段[13-14]。體外轉錄的RNA使得RNA量產變?yōu)榭赡?，可作為質量控制物質來保證診斷試劑的準確性。

體外轉錄的RNA常被用于新冠病毒核酸檢測試劑方法學性能驗證，如將體外轉錄的RNA標準物質用于新冠病毒核酸定量[15]，或用于最低檢出限研究[16]。體外轉錄的RNA也是常見的新冠病毒標準物質類型，美國國家標準和技術協(xié)會、歐盟委員會聯(lián)合研究中心、中國計量科學研究院和上海市計量測試技術研究院等多家研究機構均可提供體外轉錄RNA形式的標準物質。

體外轉錄的RNA不僅易于批量制備，還可彌補質粒無法監(jiān)控RNA逆轉錄步驟的不足，從而更好地監(jiān)測PCR檢測全過程[17]。但是，體外轉錄的RNA依然無法監(jiān)測病毒RNA的抽提過程。此外，體外轉錄的RNA穩(wěn)定性較差，需通過優(yōu)化保存劑來保證其不發(fā)生降解[13]，對存儲運輸條件也提出了更高要求。

3.3病毒抽提的RNA樣本 從新冠病毒中抽提得到的RNA具有完整的新冠病毒基因組信息，常被用于標準物質或質控品等質量控制物質的制備。本研究組將病毒抽提RNA制備的新冠病毒標準物質倍比稀釋，用于評估14種常規(guī)新冠病毒檢測試劑和3種快檢試劑的檢測靈敏度，發(fā)現(xiàn)不同檢測試劑間最低檢出限可相差8倍[18]。此外，本研究組也曾使用病毒抽提的RNA作為EQA質控品，發(fā)現(xiàn)部分實驗室存在低濃度樣本檢出率不太理想的情況[19]。然而，與體外轉錄RNA相似，病毒抽提的RNA樣本也存在不能監(jiān)測核酸抽提過程、穩(wěn)定性較差的問題。

3.4噬菌體假病毒顆粒 噬菌體MS2的外殼蛋白CP、成熟酶蛋白A和包裝位點PAC可以自行組裝形成噬菌體病毒樣顆粒，并將PAC下游的外源RNA包裝到外殼蛋白內[20]。使用該技術制備的質量控制物質在形態(tài)結構上與天然病毒顆粒相似，由于缺乏完整的病毒核酸，無法進行獨立復制，可有效減少生物安全性的問題。Wang等[21]將覆蓋EQA試劑檢測靶點的部分ORF1ab基因、N基因和E基因序列插入到pACYC-MS2載體中，制備了4個濃度的樣本用于EQA。

MS2病毒樣顆粒無感染性且復制缺陷，遺傳物質由蛋白質外殼包裹，彌補了體外轉錄RNA無法監(jiān)測病毒RNA抽提的問題，從而做到全過程監(jiān)控。此外，外殼蛋白的包裹可使其耐受核酸酶降解，因而具有較好的穩(wěn)定性。然而，由于MS2病毒樣顆粒對外源片段的包裹能力有限，導致其無法一次性包裹較長外源基因片段，如新冠病毒ORF1ab基因，因而往往需要制備多個假病毒顆粒，混合后作為質控品使用，增加了操作的復雜性。因此，在選用此類質量控制物質時，應確認噬菌體假病毒顆粒所包含的基因片段能覆蓋檢測試劑的擴增區(qū)域，以有效用于實驗室檢測系統(tǒng)中。

3.5慢病毒 慢病毒載體是一種復制缺陷病毒載體，能夠將外源基因整合到宿主染色體上得到表達[22]。此種方式也用于制備質量控制物質，如中國計量科學研究院將新冠病毒N基因、E基因和ORF1ab基因片段克隆至慢病毒載體pCDH上，轉染細胞后獲得帶有相應目的片段的慢病毒顆粒，可作為新冠病毒核糖核酸標準物質[23]。Lee等[24]也通過pCDH載體制備了含有RdRp基因、N基因、E基因和S基因片段的慢病毒，并使用數(shù)字PCR定量，可作為標準物質用于RT-qPCR、二代測序、等溫擴增和CRISPR檢測方法中。相較于噬菌體假病毒，慢病毒能整合較大的外源DNA，但目前對于其安全性仍會有一定的擔憂，常需要通過使用復制缺陷的慢病毒載體、插入額外的停止子和熱滅活來確保其生物安全。

3.6其他 此外，也有其他一些人工制備的樣本用于新冠病毒質量控制物質的制備，如在疫苗制備中廣泛應用的甲病毒。東京都政府在2020年7月組織的EQA中使用了甲病毒制備的新冠病毒質控品[25]。此外，Chan等[26]開發(fā)了基于噬菌體Qβ和植物病毒豇豆褪綠斑駁病毒(CCMV)的帶有新冠病毒基因片段的病毒樣顆粒，可作為新冠病毒核酸檢測質控品。

4 總結

在新冠病毒核酸檢測中，人員操作誤差、儀器設備未及時校準或故障、試劑質量等因素都會影響檢測質量[14]。因此，必須采取嚴格的質量控制措施，而性能可靠的質量控制物質的應用是其中重要一環(huán)。本文內容揭示了不同類型的質量控制物質具有各自不同的優(yōu)缺點，應根據(jù)實際應用場景進行合理選擇。當前，研發(fā)一種更易于制備、生物安全風險低、穩(wěn)定可靠、可監(jiān)控反應全程的理想新冠病毒核酸檢測質量控制物質仍是業(yè)內從業(yè)人員的研究熱點。此外，由于新冠病毒核酸檢測技術的廣泛應用，臨床分子檢測平臺不斷完善，更多的分子檢測技術將在臨床加速開展。為保證相關項目檢測結果的準確可靠，這對分子檢測質量控制物質提出了更高要求，而新冠病毒核酸檢測質量控制物質的應用也將為其他相關分子檢測項目質量控制物質的研發(fā)和選用提供參考借鑒。