肺移植術后真菌感染診斷的研究進展

劉嘉茜，王春新(1. 南京醫(yī)科大學，南京 11166；. 南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，江蘇無錫 1403)

隨著科學技術發(fā)展和人類生活水平的提高，肺移植對于大部分慢性肺部疾病患者的治療越來越有效。在世界范圍內(nèi)，每年約有100名兒童和4 500名成人進行肺移植[1]。很多患者進行肺移植后，面臨著發(fā)生原發(fā)性移植物功能喪失(primary graft dysfunction, PGD)[2]、感染、移植后免疫功能障礙等并發(fā)癥的風險。而感染性術后并發(fā)癥的發(fā)病率和歸因在移植術后的各個階段都占據(jù)首位[3]。肺移植術后真菌感染的風險因素可分為內(nèi)在和外界因素，內(nèi)在因素如免疫功能低下、宿主防御系統(tǒng)損害、受者結構異常，外界因素如患者住院時間延長、呼吸機或?qū)Ч芰糁脮r間延長、與ICU環(huán)境的頻繁接觸等，都使得患者容易被真菌等微生物病原體感染。本文對肺移植術后真菌感染的特點及影響，特別是實驗室診斷方法的應用價值、優(yōu)劣及發(fā)展前景作一綜述。

1 肺移植術后真菌感染特點及影響

肺移植術后真菌感染的發(fā)生和類型取決于以下幾個因素：物理或功能性免疫抑制的強度、移植后的時間、抗菌預防的類型、移植前定植病原體的存在等[4]。肺移植術后真菌感染與其他真菌感染的區(qū)別在于以下方面。(1)感染風險更大：肺移植受者與其他患者相比，自身的組織結構異常以及術后自身的微生物清除機制受到損害，導致真菌感染的概率大幅上升。研究表明，真菌病原體在鼻竇和肺實質(zhì)的定植與肺移植后侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的發(fā)生率增加有關[5]。同時肺移植患者由于免疫抑制劑的使用，免疫抑制狀態(tài)的持續(xù)雖然一定程度上避免了異體排斥反應的發(fā)生，卻并不利于真菌感染的預防與治療。(2)診斷與治療的不同：真菌感染后出現(xiàn)的癥狀不典型使得診斷變得困難，需要無創(chuàng)生化標志物等進行輔助診斷。同時肺移植受者由于圍手術期置入深靜脈導管、動脈導管、體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ECMO)等，肺移植患者治療方案也有所影響。肺移植術后早期感染常見于氣道感染和移植肺的侵襲性感染[6]，特別是在實體器官移植后的第一年，侵襲性真菌病(invasive fungal diseases, IFDs)顯著增加了肺移植受者的死亡率。在真菌病原體中，主要的威脅是煙曲霉，分離率為3%～44%[7-9]，相應死亡率高達41%～51%[10]；其次是念珠菌感染(23%)[11]，最常見的為白念珠菌、隱球菌屬[9]，毛霉屬高達3%[9,11]；其余還有地方性真菌病(組織胞漿菌)、芽生菌、 球孢子菌(1%)[9]、孢子菌(3.5%)[11]、耶氏肺孢子菌(2%)[9]以及皮炎外瓶霉(個案報告)[12]。曲霉感染是術后早期常見并發(fā)癥，高發(fā)期集中在移植后的3個月內(nèi)。曲霉感染可分為支氣管感染、吻合口感染、侵襲性肺部感染和全身播散性感染，其中，75%為支氣管或吻合口感染，嚴重者可引起支氣管吻合口瘺等；18%為侵襲性肺部感染；7%為全身播散性感染。煙曲霉感染最常見(占91%)，黃曲霉和黑曲霉感染發(fā)生率均為2%，不同種類曲霉混合感染達5%[13]。

2 肺移植術后真菌感染實驗室診斷方法

真菌感染的呼吸道表現(xiàn)主要為真菌性肺炎、侵襲性疾病或局部吻合口感染。其中，侵襲性肺部真菌感染的典型表現(xiàn)為發(fā)熱、胸痛、呼吸困難、咳嗽和咯血，病原體可擴散到其他器官，進展為真菌血癥和全身感染。根據(jù)我國肺移植術后真菌感染的診斷標準[14]，患者典型體征、痰液性狀以及實驗室、影像學檢查可為曲霉感染的確診提供依據(jù)。其中，實驗室檢查主要為真菌(1,3)-β-D葡聚糖試驗(G試驗)、半乳甘露聚糖試驗(GM試驗)以及痰培養(yǎng)檢測，陽性可輔助診斷曲霉感染，也可與其他真菌感染相鑒別。支氣管鏡檢查也可從吻合口曲霉感染病灶中獲取標本進行培養(yǎng)和組織病理學檢查。

然而，傳統(tǒng)的真菌感染診斷方法也存在許多局限性。真菌培養(yǎng)是診斷真菌感染的金標準，但培養(yǎng)過程耗時較長，限制其早期診斷價值。念珠菌和隱球菌培養(yǎng)需要24～48 h，曲霉和根霉培養(yǎng)需要48～72 h。顯微鏡檢查雖然快捷方便，但采樣限制較多，檢出率較低，尤其是對深部真菌感染的診斷。質(zhì)譜分析血清中真菌代謝物也是一種新方法，但其檢測設備比較陳舊及昂貴。而一些罕見感染，如絲孢菌病、毛孢菌病、暗絲孢菌病、鐮刀菌病和隱球菌病等，此類菌種診斷尤其具有挑戰(zhàn)性，容易延誤最佳治療時機。由于大多數(shù)不常見的真菌感染和諾卡菌病也可能有肺外病灶，如典型的大腦或皮膚受累，這使得診斷更加困難[15]。

在實際臨床中，對于沒有典型危險因素或病情不穩(wěn)定的危重病人而言，由于免疫功能低下導致癥狀的非特異性以及影像結果的不典型性，所以研究重點已經(jīng)放在無創(chuàng)生化標記物上，可作出快速且精準診斷。以下列舉肺移植受者常見檢測真菌的實驗室診斷方法。

2.1GM試驗 半乳甘露聚糖是曲霉屬的主要細胞壁成分，在真菌復制過程中釋放。目前主要使用酶免疫分析法(enzyme immunoassay，EIA)檢測半乳甘露聚糖。2019年美國胸科協(xié)會指南[16]建議：對懷疑為侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)的不明原因肺部浸潤且嚴重免疫功能低下患者使用血清GM檢測。強烈建議對血清GM陰性但有強烈IPA危險因素的患者或血清GM陽性但有假陽性結果混雜因素的患者進行支氣管肺泡灌洗液GM檢測[17]。 血清GM和支氣管肺泡灌洗液GM均可診斷中性粒細胞減少患者的侵襲性曲霉屬或相關霉菌，血清GM對嚴重中性粒細胞減少癥患者的IFI診斷具有最高的敏感性[4]。但在非中性粒細胞減少患者中，血清GM敏感性較低，可用支氣管肺泡灌洗液GM進行輔助診斷。GM實驗的局限性體現(xiàn)在：可與其他霉菌發(fā)生交叉反應，且青霉素類抗菌藥物可導致GM假陽性等。

2.2G試驗 (1，3)-β-D葡聚糖包含在大多數(shù)真菌的細胞壁中，肺部真菌感染患者在免疫系統(tǒng)的作用下細胞壁水解，所以大部分的肺部真菌感染患者體內(nèi)(1，3)-β-D葡聚糖含量高于健康志愿者以及其余病原菌導致的肺部感染患者[18]。G試驗作為IFDs的篩查方法，其診斷敏感性和特異性分別為75% (95%CI：64%～84%)和87%(95%CI：81%～92%)[19]。

G試驗也存在局限性。在接受輸血或靜脈注射免疫球蛋白的患者以及接受血液透析的患者中，G試驗可能存在假陽性結果；毛霉和隱球菌不會引起結果升高，不應作為IFDs的獨立診斷試驗。與GM試驗類似，細胞壁靶向抗真菌預防或治療對G試驗檢測敏感性的影響尚不清楚，有待進一步研究。G試驗、GM試驗聯(lián)合檢測可起到互補作用，從而提高診斷IFI敏感性和準確性[20]。

2.3T2 Candida panel T2公司所研發(fā)的念珠菌檢測面板T2 Candida panel是一種有效的診斷和抗菌管理工具，也是美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準的唯一檢測全血樣本中念珠菌屬的試驗。試驗需取全血作為樣本，在第一次抽血后的3～5 h內(nèi)提供菌種鑒定，且不依賴于陽性血培養(yǎng)，通常在第二劑抗菌藥物給藥前進行，更快速、更準確，有著很好的應用前景。T2 Candida panel結合PCR技術擴增DNA，并通過擴增子誘導的超磁性粒子凝聚和核磁共振檢測擴增產(chǎn)物，可用于高?；颊叩臋z測，并減少不必要的抗真菌藥物使用[21]。一項針對念珠菌血癥住院患者的多中心試驗發(fā)現(xiàn)，在念珠菌感染率為10%的情況下，T2 Candida panel的敏感性為89%，陽性預測值為84%[22]。對于可疑的侵襲性念珠菌病，若結果為陰性，應謹慎解釋陰性結果，并考慮不包括在該檢測面板中的菌種[21]；若結果為陽性，為避免假陽性應進行血液培養(yǎng)，以證實T2 Candida panel結果。

2.4PCR檢測 PCR法與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)法相比，具有操作簡易、檢測周期短、敏感性更高的優(yōu)點，有利于抗真菌治療藥物的選擇。如曲霉PCR檢測，方法因DNA提取方案、擴增技術、陽性閾值和標本類型而異，目前還沒有普遍接受的檢測曲霉屬的方法。許多關于曲霉PCR的研究都是針對惡性血液病患者侵襲性曲霉病的檢測或早期診斷，因此對肺移植人群的適用性尚不清楚。毛霉 PCR目前臨床上不可用，且抗真菌藥物的應用會顯著降低檢測敏感性。PCR檢測的局限性是只能判斷標本是否有真菌，但不能確定是否是致病真菌，也不能確定是活菌還是死菌，同時也不能對抗真菌藥物的敏感性和耐藥性進行檢測[23]。研究表明，定量PCR檢測聯(lián)合G試驗、GM試驗能夠明顯提高IFI臨床檢測準確性[24]。因此，檢測應該結合其他實驗以及患者的臨床癥狀及影像學特征作出綜合判斷。

基于PCR開發(fā)的一系列分子診斷方法，主要對真菌保守序列或特異性基因片段進行擴增和檢測，其特異性隨引物設計和樣品純度的不同而不同。如外周血非編碼RNA在疾病發(fā)生發(fā)展過程中變化迅速，對其進行綜合分析可敏感地反映微環(huán)境的動態(tài)變化，幫助臨床更精確地診斷。RNA相關檢測面板檢測指標的表達穩(wěn)定，不受免疫抑制劑等藥物的影響；可以在感染的早期階段檢測到，特別是在感染相對有限的時候；只需少量外周血標本即可快速準確診斷，便于臨床應用[25]。

2.5二代測序技術(next-generation sequencing technology, NGS) NGS檢測作為目前病原微生物研究領域應用最為廣泛的測序手段，與傳統(tǒng)的測序方法相比，具有通量高、測序速度快、運行成本低和準確性高等優(yōu)點，特別是在真菌、病毒感染病例中具有顯著性優(yōu)勢。NGS不需要靶特異性引物，在單次序列測定中可確定菌株基因組完整的DNA序列，可用于所有病原體的鑒定和分型，測序時間一般不超過48 h，最快可以在8 h內(nèi)實現(xiàn)從DNA樣本建庫到數(shù)據(jù)分析獲取全過程。Roche公司的454 FLX、ABI公司的SOLID測序技術和Illumina公司的Solexa技術[26]等均是比較成熟的NGS平臺。

2.5.1Roche 454 FLX 是一種依靠生物發(fā)光進行DNA測序的新技術，是一種基于焦磷酸測序原理而建立的高通量基因測序系統(tǒng)。優(yōu)點在于快速、準確、靈敏度高和自動化，重復序列少。每個測序反應都在PTP板上獨立的小孔中進行，因而能很大地降低相互間的干擾和測序偏差，讀取長度相比于Illumina公司產(chǎn)品更長，高達400 bp。缺點在于成本耗費較大，通量較低，無法精準測量同聚物的長度，可能會引入插入和缺失錯誤。該平臺適用于從頭測序、宏基因組測序、序列拼裝和獲得新基因。但由于技術的更新和市場的發(fā)展，目前并不常用。

2.5.2ABI SOLID 使用基于磁珠的大規(guī)模并行連接測序平臺，連接反應的底物是熒光標記的8堿基單鏈DNA探針。SOLID測序具有高通量、高準確度、易區(qū)分單核苷酸多態(tài)性和測序錯誤等優(yōu)點，主要的缺點是讀長較短，運行較慢，常用于外顯子測序、基因突變測序等。由于市場和公司等原因，目前該測序技術也并不常用。

2.5.3Illumina Solexa 是單分子陣列測序，邊合成邊測序，其核心為橋式PCR和可逆末端終止。優(yōu)點在于測序快、低錯誤率、低成本、應用范圍廣，很好地解決了同聚物的測定問題。主要缺點是讀長較短，后續(xù)拼接工作的計算量和難度很大。目前適用于RNA測序和表觀遺傳學研究。

雖然NGS相較于傳統(tǒng)檢測方法有許多優(yōu)勢，但是目前并不能完全取代傳統(tǒng)方法，仍存在一些實際問題：缺乏標準化的數(shù)據(jù)處理及分析流程，缺乏統(tǒng)一準確的對照數(shù)據(jù)庫等。此外，針對支原體、衣原體、軍團菌等胞內(nèi)感染致病原和真菌等厚壁微生物，NGS的DNA提取效率低，序列數(shù)和覆蓋率偏低，最終導致檢測敏感性下降[27]。通過優(yōu)化NGS檢測技術和條件，將傳統(tǒng)和新型檢測方法相結合，可以進一步提高臨床準確率。

3 小結與展望

由于免疫抑制狀態(tài)、自然防御功能受損和環(huán)境易感性，真菌感染在肺移植受者中仍然是一個無法忽略的問題。隨著抗菌藥物的研究發(fā)展以及廣泛應用，真菌病原體耐藥模式不斷演變，如何將傳統(tǒng)檢測方法和新技術更好更高效地結合以及對新技術的不斷研發(fā)，均需要不斷探索。