單細胞測序在腫瘤藥物開發(fā)中的應(yīng)用

袁鎏柳，秦成姣，邊靜，夏元錚

（ 中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

0 引言

腫瘤是人類面臨的一大健康威脅[1]，腫瘤組織中的細胞類型多種多樣，單個細胞同樣具有不同特性。以往科研人員從大量細胞中獲取DNA樣本進行測序，測序結(jié)果僅能展現(xiàn)細胞群體表征。由于細胞間異質(zhì)性的存在，相同表型的細胞遺傳信息可能存在顯著差異，很多低豐度的信息在整體表征中會被丟失。2009年湯富酬教授在國際上率先發(fā)展了單細胞功能基因組學(xué)研究體系，這一技術(shù)彌補了傳統(tǒng)高通量測序的局限性，開啟了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序時代[2]。2011年單細胞測序技術(shù)被Nature Methods評為年度最值得關(guān)注和期待的技術(shù)之一，此后越來越多地被應(yīng)用于科學(xué)研究領(lǐng)域[3]。2018年三篇Science[4-6]以精確的方式跟蹤并描繪了組織以至整個機體從單細胞發(fā)育而來的完整歷程，成為年度最重要科學(xué)進展，位居十大科學(xué)突破榜首。目前已有多種處理單細胞測序的流程，比如STRT-Seq[7]，sci-RNA-seq[9]，Drop-seq[10]，MARSseq[11]，SAMRT-seq2[12]，F(xiàn)luidigm C1[13]，WaferGen ICELL8[14]，10xGenomics[15]等。這些技術(shù)的快速發(fā)展使我們能夠快速獲取大量腫瘤相關(guān)生理病理信息。鑒于單細胞測序的最新進展，它在人類疾病中的應(yīng)用可能有助于更好的理解病理過程[16]。我們假設(shè)，單細胞測序可以通過在單細胞水平上觀測基因表達，以此提供一種強大的個性化醫(yī)療手段，這不僅加深了我們對疾病發(fā)展機制的了解，而且可以鑒定出特異性變化通路或潛在靶標，使通過目前可用的單克隆抗體或小分子靶向抑制劑治療成為可能[17]。為此，我們總結(jié)了目前單細胞測序技術(shù)在分析腫瘤異質(zhì)性、腫瘤藥物研發(fā)、藥物篩選等方面的研究進展。

1 單細胞測序在分析腫瘤異質(zhì)性中的應(yīng)用

腫瘤異質(zhì)性描述了同一類型腫瘤在不同患者之間的差異，以及腫瘤內(nèi)部不同細胞之間的差異，兩者都會導(dǎo)致對治療的不同反應(yīng)。腫瘤細胞之間的遺傳和表觀遺傳差異可能解釋了為什么在癌癥治療結(jié)束后，一些腫瘤細胞仍然存在于患者體內(nèi)。近年來，在研究腫瘤異質(zhì)性和動態(tài)可塑性方面取得了重大進展，了解不同腫瘤異質(zhì)性對于基礎(chǔ)研究，以及將基礎(chǔ)研究成果應(yīng)用到臨床治療方案設(shè)計中具有重要意義[18]。G. Gambardella等[19]對32個乳腺癌細胞系中35276個單個細胞進行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并生成單細胞圖譜，通過在圖譜上訓(xùn)練迭代反褶積算法，根據(jù)腫瘤活檢中大量基因表達譜確定細胞譜系組成，實現(xiàn)了基于細胞譜系的患者分型。

為了在單細胞水平上預(yù)測藥物反應(yīng)，這項研究開發(fā)了一種生物信息學(xué)工具DREEP（DRug Estimation from single-cell Expression Profiles）將大規(guī)模體外藥物篩選結(jié)果與單細胞數(shù)據(jù)聯(lián)系起來。這項研究為依據(jù)腫瘤異質(zhì)性確定細胞譜系組成和藥物反應(yīng)提供了一個框架。要想深入了解癌癥如何開始、發(fā)展和獲得治療性耐藥，就需要對癌癥干細胞生物學(xué)進行更深入的探索。Charles P. Couturier等[20]利 用10xGenomics對55000個膠質(zhì)母細胞瘤細胞和20000個正常腦細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，通過PCA和聚類非負矩陣分解（cNMF）開發(fā)了一種路線圖技術(shù)，可以將每個腫瘤細胞投影到正常腦數(shù)據(jù)集上，研究分析表明，正常大腦發(fā)育協(xié)調(diào)了膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)育，提示了膠質(zhì)母細胞瘤層次的可能來源，并有助于識別癌癥干細胞的特異性靶點。Qiming Zhang團隊[21]結(jié)合10xGenomics和SMART-seq2單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，對肝癌患者多個組織中免疫細胞進行了系統(tǒng)性的刻畫，利用通過Monocle2算法以及全轉(zhuǎn)錄組擴散圖譜對免疫細胞動態(tài)遷移和狀態(tài)轉(zhuǎn)化的特征進行分析，描繪了肝癌浸潤免疫細胞跨組織的動態(tài)過程，對肝癌治療有重要意義。Min Zhang等[22]對9例胃腫瘤和3例非腫瘤樣本中27677個細胞進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組分析，通過反復(fù)對TCGA中的上皮細胞腫瘤樣本和正常配對樣本做差異分析，得到惡性和非惡性上皮細胞。通過分化相關(guān)基因揭示了腫瘤內(nèi)部和腫瘤之間分化程度高低的多樣性，低分化度可預(yù)測胃癌的預(yù)后不良。Junya Peng等[23]通過10xGenomics對24個原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌病人樣本及11個對照胰腺樣本進行單細胞測序，發(fā)現(xiàn)具有獨特增殖特征的導(dǎo)管細胞亞群與腫瘤浸潤性T細胞的失活狀態(tài)相關(guān)。此外大量研究表明腫瘤異質(zhì)性是腫瘤細胞耐藥性[24]的主要原因，耐藥細胞在化療過程中能夠逐步取代對藥物敏感的細胞，因此研究者需要深入探究腫瘤的異質(zhì)性?？傮w來說單細胞測序的發(fā)展更有利于研究人員揭示腫瘤異質(zhì)性，確定腫瘤生物學(xué)特征，也為腫瘤藥物研發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

2 單細胞測序在腫瘤藥物研發(fā)中的應(yīng)用

單細胞測序為單個細胞的整個轉(zhuǎn)錄組進行采樣提供了機會，從而將細胞處理成獨立于表面標記或物種保護的細胞狀態(tài)，并且對可用于分析的標記基因數(shù)量沒有嚴格的限制[4]，單細胞測序技術(shù)可以有效評估藥物治療條件下腫瘤微環(huán)境中不同細胞分子間的動態(tài)變化，提供一個多維度的藥效評價體系，包括用藥前后細胞頻率變化，細胞耐藥性檢測，關(guān)鍵通路和基因變化，聯(lián)合治療相性等。Krieg等[25]應(yīng)用高維單細胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析黑色素瘤患者外周血中的免疫細胞亞群，發(fā)現(xiàn)單核細胞的數(shù)量可以成功預(yù)測PD-1抑制劑的治療反應(yīng)效果。Kathryn E. Yost等[26]在基底細胞癌和鱗癌患者中進行單細胞TCR測序，研究了PD-1治療前后T細胞克隆種類的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-1抑制劑可以促進T細胞具備新的腫瘤抗原，并且促進新的T細胞進入腫瘤微環(huán)境。Zhuting Hu等[27]為揭示黑色素瘤患者體內(nèi)的變化和機制，利用全外顯子組測序（WES）和RNA測序表征了接種NeoVax疫苗前和接種疫苗后腫瘤樣本的突變譜，發(fā)現(xiàn)NeoVax疫苗不僅誘導(dǎo)這些患者體內(nèi)產(chǎn)生靶向目標新抗原的特異性T細胞，而且還擴展到識別其他與黑色素瘤相關(guān)的新抗原，從而起到一個持久抗腫瘤的效果。監(jiān)測藥物治療反應(yīng)可以揭示不同癌種不同病人的耐藥機制，這對于尋找更新的免疫治療靶點十分重要。單細胞測序允許我們追蹤腫瘤細胞起源并比較腫瘤細胞對不同療法的即時反應(yīng)，大大加速了腫瘤藥物反應(yīng)以及腫瘤耐藥性的研究，可以獲得大量的致病基因以及可藥用基因組靶標，單細胞測序的發(fā)展不僅可以從多角度豐富靶點容量，還可以更為精準的縮小靶點范圍。Matthew T. Chang等[28]利用TraCe-seq追蹤暴露于不同EGFR抑制劑靶向治療后有反應(yīng)和耐藥的細胞，并進行差異基因分析和時間軌跡比較，發(fā)現(xiàn)抑制劑結(jié)合的EGFR引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對于實現(xiàn)完全療效至關(guān)重要。深入了解抑制劑結(jié)合EGFR和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的生化機制有助于將來開發(fā)靶向EGFR和其他膜相關(guān)蛋白的小分子藥物。Yael C. Cohen等[29]通過MARSseq鑒定多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)患者硼替佐米耐藥途徑和治療靶點。通過對差異表達基因進行評分發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)途徑的核心酶肽基脯氨酰異構(gòu)酶A（PPIA）是多發(fā)性骨髓瘤耐藥的潛在治療新靶標。利用CRISPR-Cas9敲除PPIA或使用小分子抑制劑（環(huán)孢菌素）抑制PPIA可使多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細胞對蛋白酶體抑制劑敏感。這項工作確定了在臨床試驗中整合單細胞測序的路線圖，確定了多發(fā)性骨髓瘤耐藥患者的特征，并發(fā)現(xiàn)PPIA是這類腫瘤的有效治療靶點。不同臨床試驗的結(jié)果差異提示，不同的化療藥物可能會導(dǎo)致不同的腫瘤微環(huán)境特征，進而影響免疫檢查點抑制劑的治療效果。Yuanyuan Zhang團隊[30]通過10xGenomics單細胞轉(zhuǎn)錄組測序收集了來自22例TNBC患者（11例接受阿替利珠單抗聯(lián)合紫杉醇化療，11例接受紫杉醇單藥化療）治療前和治療后的78例配對樣本。通過整合TCR測序和scATAC測序構(gòu)建了TNBC患者腫瘤微環(huán)境和外周血中免疫細胞的高分辨轉(zhuǎn)錄組和表觀組的動態(tài)圖譜，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境富集中高水平的CD8-CXCL13+和CD4-CXCL13+ T細胞能夠預(yù)測更好的聯(lián)合治療響應(yīng)。

單細胞測序技術(shù)可以用于藥物研發(fā)中的各個環(huán)節(jié)，目前研發(fā)抗腫瘤藥物的一個關(guān)鍵方式是使用臨床前動物模型[31]。雖然許多重要的發(fā)現(xiàn)都是通過臨床前動物模型實現(xiàn)的，但是這些動物模型往往都是高度可變的，并且時常不能準確地概括人類腫瘤患者的反應(yīng)。使用臨床前動物模型的主要挑戰(zhàn)是人和小鼠免疫系統(tǒng)之間可能存在的差異，因此將人類和小鼠的種群結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來至關(guān)重要[32]，單細胞測序的發(fā)展為篩選更為合適的動物模型提供了機會。RapolasZilionis等[33]使用inDropscRNAseq對七名非小細胞肺癌（NSCLC）患者以及患有該疾病的模型小鼠和健康小鼠肺中的髓系細胞進行分析，并通過貝葉斯細胞分類器歸類為相應(yīng)的細胞類型。該項研究通過光譜聚類算法發(fā)現(xiàn)三種不同亞型的單核細胞以及四種不同亞型的樹突細胞，這些亞型在人類和小鼠之間高度匹配，即在物種之間是保守的。然而巨噬細胞的九個亞群在人類和小鼠之間差異很大，顯示出種間異質(zhì)性。因此利用單細胞測序技術(shù)可以獲得不同動物模型的細胞圖譜，并將之與病人圖譜進行比較，找出與患者腫瘤微環(huán)境特征相似的動物模型，從而用于正在開發(fā)的特定藥物臨床前研究。以上研究進展表明單細胞測序技術(shù)已經(jīng)在藥物研發(fā)中展現(xiàn)出巨大的潛力。

3 單細胞測序在藥物篩選中的應(yīng)用

藥物篩選在藥物研發(fā)中至關(guān)重要，但傳統(tǒng)藥物篩選過程工作量大且耗時耗力。細胞水平基因表達分析可以反映藥物作用機制，高通量測序通過對基因表達進行測定可以篩選出大量的靶標藥物，大大提高藥物篩選的效率，促進新藥的快速研發(fā)[34]。Chaoyang Ye等[35]分 析 了8種 劑 量 下433種 化合物處理的骨肉瘤U2OS細胞，并利用DRUGseq（Digital RNA with pertUrbation of Genes）對這些藥物進行高通量篩選，得到細胞轉(zhuǎn)錄譜并根據(jù)其預(yù)期靶標藥理作用機制（Mechanism of actions，MoAs）對化合物進行t-SNE聚類。同一簇中不同化合物的藥理作用機制基本相同，進而可以推測出同一簇其他靶標化合物的藥理作用機制。借助單細胞測序的藥物篩選可以鑒定具有相似藥理作用機制的化合物，并區(qū)分相關(guān)但不同的化合物，可以促進藥物篩選和新藥研發(fā)有效快速發(fā)展。Dongju Shin等[36]設(shè)計了一種多重scRNA-seq方法，該方法涉及帶有獨特細胞標記的條形碼（barcode）和poly-A結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸序列（SBO）的瞬時轉(zhuǎn)染，以標記來自各種實驗條件的樣品。混合樣本的藥物治療實驗揭示了不同處理時間下基因表達軌跡，同時發(fā)現(xiàn)了藥物作用下細胞的差異表達基因以及單細胞水平上特異性靶基因表達信號，這些實驗結(jié)果為臨床藥物篩選提供實踐依據(jù)，表明單細胞測序可在藥物篩選中發(fā)揮重要的作用。SANJAY R.SRIVATSAN等[37]開發(fā)了一種名為sci-Plex的藥物篩選新技術(shù)，這種技術(shù)使用多腺苷酸化單鏈寡核苷酸來標記細胞核，從而實現(xiàn)細胞散列和雙峰檢測。該技術(shù)可分析和定量響應(yīng)成千上萬種不同化合物的單細胞的基因表達，從而揭示藥物對細胞所起的作用。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)使得獲得大規(guī)模的抗體庫多樣性信息成為可能。單細胞BCR測序極大促進了抗體的發(fā)展，在傳染病研究也有很多應(yīng)用，通過單細胞BCR測序可以研究免疫系統(tǒng)對疫苗接種[38]的反應(yīng)，單細胞BCR測序也可以用于尋找新冠病毒[39]的中和抗體。組織細胞通常具有異質(zhì)性，特別是腫瘤細胞，傳統(tǒng)的高通量測序樣品由混合細胞組成，許多有價值的信息被均一化，不能充分展示群體中細胞對于藥物的反應(yīng)。以上研究成功表明，單細胞測序技術(shù)可以更加容易地完成這些分析，成為藥物高通量篩選[40]強勁有效的工具。

4 總結(jié)與展望

腫瘤細胞的突變速率非常快，是一種高度異質(zhì)性的群體。單細胞測序使人們能夠在單個細胞水平上觀測細胞類型的改變，以此來分析特定的細胞亞群變化，確定腫瘤組織中是否存在或存在哪些細胞亞群對化療藥物敏感，哪些細胞亞群處于免疫抑制狀態(tài)，這些信息均有助于臨床治療，目前單細胞測序已被廣泛應(yīng)用于揭示各類疾病的免疫學(xué)特性[41,42]。通過對腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中惡性細胞，鄰近間質(zhì)細胞和免疫細胞之間復(fù)雜通信的描述，單細胞測序成為解決腫瘤異質(zhì)性的有力工具[43]。不同腫瘤類型、相同腫瘤不同發(fā)展階段、不同病人腫瘤微環(huán)境以及腫瘤細胞圖譜均存在差異，這些原因?qū)е麓罅坎∪藷o法從臨床治療中獲益。目前抗腫瘤藥物的研發(fā)路線主要集中在組織水平的分子特征，對藥物靶向的細胞以及具體作用途徑等機制缺乏透徹了解，因此限制了藥物臨床試驗的成功率。如果獲得了藥物治療前后靶細胞和作用途徑的詳細圖譜，這將極大的促進抗腫瘤藥物的研究進展。傳統(tǒng)高通量篩選是現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)，但是無法針對體內(nèi)各類不同細胞的作用途徑和分子機制進行分析，無法評估藥物對不同類別細胞的響應(yīng)。單細胞測序技術(shù)對藥物開發(fā)提供了新的視角，未來單細胞測序技術(shù)有望成為藥物開發(fā)的重要工具。