關(guān)節(jié)液組分分析在膝骨關(guān)節(jié)炎康復(fù)中的應(yīng)用研究

羅光會　杜麗英　王秀珠　張琳　孫一圣　肖衛(wèi)平　韓偉　羅叢寶　田麗娜

【摘 要】目的：研究膝骨關(guān)節(jié)炎患者康復(fù)程度與關(guān)節(jié)液成分變化之間的關(guān)系，尋找特異性及敏感性高的生化標(biāo)志物，為準(zhǔn)確診斷早期膝骨關(guān)節(jié)炎提供新的方法，探尋康復(fù)程度與關(guān)節(jié)液微環(huán)境變化的關(guān)系。方法：選擇膝骨關(guān)節(jié)炎患者120例，對所有患者進(jìn)行膝關(guān)節(jié)鏡檢查，按照Outerbridge分級標(biāo)準(zhǔn)將患者分為4組，Ⅰ度到Ⅳ度，每組30例。再將每組分成3組，分別進(jìn)行自體富血小板血漿（PRP）+ 干細(xì)胞，自體PRP，以及臭氧灌注 + 透明質(zhì)酸鈉（HA）治療。治療前和治療后8個月收集膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液標(biāo)本各120份。標(biāo)本均采用ELISA雙抗夾心法對關(guān)節(jié)液中的印度刺猬蛋白、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）含量進(jìn)行測定。比較治療前后印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13在關(guān)節(jié)液中的表達(dá)差異，以Spearman等級相關(guān)分析Outerbridge分級與關(guān)節(jié)液組分的關(guān)系。采用Shahariarre評分標(biāo)準(zhǔn)評價療效。結(jié)果：印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13表達(dá)水平與Outerbridge分級之間均呈正相關(guān)（r = 0.790、r = 0.476、r = 0.684，P < 0.01）；預(yù)后良好組與預(yù)后不良組印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；根據(jù)Outerbridge分級標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ度患者自體PRP + 干細(xì)胞治療優(yōu)良率與自體PRP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；Ⅱ～Ⅳ度患者自體PRP +

干細(xì)胞組治療優(yōu)良率明顯高于自體PRP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；Ⅰ～Ⅳ度患者自體PRP + 干細(xì)胞組治療優(yōu)良率均高于臭氧灌注 + HA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；Ⅱ度患者自體PRP組治療優(yōu)良率與臭氧灌注 + HA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），在Ⅰ度以及Ⅲ～Ⅳ度的患者中

2組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：自體PRP聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞治療膝骨關(guān)節(jié)炎較常規(guī)HA + 臭氧灌注治療效果顯著，且膝骨關(guān)節(jié)炎患者的康復(fù)程度與關(guān)節(jié)液中印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13

的表達(dá)水平相關(guān)，說明膝骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨損傷作用機(jī)制與印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13的表達(dá)水平相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎；印度刺猬蛋白；尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑；基質(zhì)金屬蛋白酶-13；關(guān)節(jié)液組分；康復(fù)

Study on the Application of Component Analysis of Joint Fluid in the Rehabilitation of Knee Osteoarthritis

LUO Guang-hui，DU Li-ying，WANG Xiu-zhu，ZHANG Lin，SUN Yi-sheng，XIAO Wei-ping，HAN Wei，

LUO Cong-bao，TIAN Li-na

【ABSTRACT】Objective：To study the relationship between the degree of rehabilitation of knee osteoarthritis and changes in the composition of joint fluid，to find biochemical markers with high specificity and sensitivity，to provide a new method for accurate diagnosis of early knee osteoarthritis，and to explore the relationship between the degree of rehabilitation and changes in the microenvironment of joint fluid.Methods：One hundred and twenty patients with knee osteoarthritis were selected.All patients were examined by knee arthroscopy.According to the Outerbridge grading standard，the patients were divided into four groups from grade Ⅰ to Ⅳ，with 30 patients in each group.Then，each group was divided into three groups，which were treated with PRP plus stem cells，autologous PRP，and ozone perfusion plus HA.One hundred and twenty samples of knee osteoarthritis were collected before treatment and 8 months after treatment.The contents of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13 in joint fluid were determined by ELISA double antibody sandwich method.The expressions of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13 in joint fluid were compared before and after operation，and the relationship between Outerbridge grade and joint fluid components was analyzed by Spearman rank correlation.The therapeutic effect was evaluated by the Shahariarre scoring standard.Results：The expression levels of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13 were positively correlated with Outerbridge grading（r = 0.790，r = 0.476，r = 0.684，P < 0.01）.The expression levels of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13?in the good prognosis group were significantly different from those in the poor prognosis group（P < 0.01）.According to the Outerbridge grading standard，the therapeutic excellent rate of autologous PRP plus stem cells in patients with grade I was not significantly different from that in the autologous PRP group（P > 0.05）.The therapeutic excellent rate of autologous PRP plus stem cell group was significantly higher than that of autologous PRP group in patients with grade Ⅱ～Ⅳ（P < 0.05）.The therapeutic excellent rate of theⅠ～Ⅳ degree autologous PRP plus stem cell group was higher than that of the ozone perfusion plus HA group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.The therapeutic excellent rate of autologous PRP treatment group in patients with grade Ⅱ was not statistically significant compared with that of the ozone perfusion plus HA group（P > 0.05），but there was statistically significant difference between the two groups in patients with grade Ⅰ andⅢ～Ⅳ（P < 0.05）.Conclusion：The effect of autologous PRP combined with mesenchymal stem cells in the treatment of knee osteoarthritis is more significant than that of conventional HA plus ozone perfusion，and the degree of rehabilitation of knee osteoarthritis patients is related to the expression levels of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13 in joint fluid.The difference is significant，which indicates that the mechanism of cartilage damage in knee osteoarthritis patients is related to the expression levels of Indian hedgehog protein，uPA and MMP-13.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Indian hedgehog protein;uPA;MMP-13;joint fluid components;recovery

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）以膝關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞、骨質(zhì)增生和軟組織退化為特性，臨床常見癥狀有關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)積液和骨性肥大等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)功能障礙甚至畸形。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計，我國40歲人群的患病率為10%～17%，65歲以上50%的人群出現(xiàn)放射學(xué)改變，75歲以上人群中發(fā)病率約為80%。

KOA的發(fā)病原因和機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為與炎癥、創(chuàng)傷、肥胖、衰老、遺傳、代謝障礙等有一定的關(guān)系［1-3］。臨床中，主要依靠病史詢問、體格檢查、影像學(xué)和相關(guān)血液學(xué)檢查等進(jìn)行診斷。即便如此，早期準(zhǔn)確診斷KOA的方法并未確立，使得很多患者錯過寶貴的早期治療機(jī)會。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和檢測手段的多樣化，關(guān)節(jié)液組分分析為早期準(zhǔn)確診斷關(guān)節(jié)疾病提供了可能。關(guān)節(jié)液組分的相關(guān)檢查是直觀反映關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境變化的有效方法，其結(jié)果與關(guān)節(jié)疾病的性質(zhì)及病變程度密切相關(guān)。因此，深入研究關(guān)節(jié)液中的相關(guān)生物標(biāo)志物并應(yīng)用于KOA的早期準(zhǔn)確診斷及開展相應(yīng)的治療具有廣闊的前景。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017年10月至2018年12月

在山東省泰山醫(yī)院就診的KOA患者120例，對所有受試者行膝關(guān)節(jié)鏡檢查，按Outerbridge分級標(biāo)準(zhǔn)將患者隨機(jī)分為Ⅰ度組、Ⅱ度組、Ⅲ度組、Ⅳ度組，每組30例。再將每組分成3組，分別進(jìn)行自體富血小板血漿（PRP）+ 干細(xì)胞、自體PRP、臭氧灌注 + 透明質(zhì)酸鈉（HA）治療。同時，選擇30例膝關(guān)節(jié)正常者，抽取關(guān)節(jié)液作為對照組。本次研究經(jīng)山東省泰山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并備案。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會發(fā)布的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡40～80歲，性別不限；③疼痛持續(xù)超過半年；

④目標(biāo)側(cè)膝關(guān)節(jié)Outerbridge分級為Ⅰ～Ⅳ級，另一側(cè)低于Ⅱ級；⑤受試者身體一般狀況良好，能夠自主行走；⑥能夠理解并自愿簽署知情同意書，能自愿完成試驗程序和隨訪檢查。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①既往關(guān)節(jié)腔內(nèi)進(jìn)行過藥物注射（如類固醇激素、玻璃酸鈉等）者；②關(guān)節(jié)液標(biāo)本被血液污染者。

2 方 法

2.1 治療方法 自體PRP +干細(xì)胞治療組：抽取患者40～60 mL外周血，分離得到PRP，與間充質(zhì)干細(xì)胞混合后，注射到患側(cè)膝關(guān)節(jié)腔。自體PRP治療組：抽取患者40～60 mL外周血，分離得到PRP，注射到患側(cè)膝關(guān)節(jié)腔。臭氧灌注 + HA治療組：患側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注射HA，同時注射醫(yī)用臭氧。

2.2 樣本采集 使用美國史密斯公司生產(chǎn)的膝關(guān)節(jié)鏡系統(tǒng)，所有病例治療前后均行膝關(guān)節(jié)鏡檢查，并進(jìn)行Outerbridge分級。治療前、治療后8個月，由同一位醫(yī)生在早晨8：00對患者進(jìn)行膝關(guān)節(jié)穿刺，收集關(guān)節(jié)液，嚴(yán)格按照無菌操作原則，收集樣本后立刻送檢。

2.3 樣本檢測 治療前后對所有患者穿刺膝關(guān)節(jié)抽取關(guān)節(jié)液10 mL，離心機(jī)以3000 r·min-1離心15 min，離心半徑10 cm，取上清液，并采用美國R&D System公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒對關(guān)節(jié)液中的印度刺猬蛋白、尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）進(jìn)行含量測定。試驗的主要儀器設(shè)備為美國Hyperion M RⅢ型酶標(biāo)儀。

2.4 觀察指標(biāo) 采用Shahariarre評分標(biāo)準(zhǔn)作為評價指標(biāo)。優(yōu)：疼痛完全消失，腫脹消退，關(guān)節(jié)功能正常。良：疼痛和腫脹明顯減輕，無壓痛，關(guān)節(jié)功能基本正常。差：疼痛和腫脹及關(guān)節(jié)功能無改善或更差。根據(jù)Shahariarre評分標(biāo)準(zhǔn)將患者分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組。預(yù)后良好組為評分優(yōu)、良的患者，預(yù)后不良組為評分差的患者。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用t檢驗、方差分析，以Spearman等級相關(guān)性分析Outerbridge分級與關(guān)節(jié)液組分的關(guān)系。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 不同分級患者治療前關(guān)節(jié)液中的印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13表達(dá)水平比較 不同病變程度的患者，關(guān)節(jié)液中的印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13

含量隨著病情加重增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

3.2 不同方法治療后患者優(yōu)良率比較 根據(jù)Outerbridge分級標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ度患者自體PRP +干細(xì)胞治療優(yōu)良率與自體PRP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；Ⅱ～Ⅳ度患者中自體PRP +干細(xì)胞組治療效果明顯高于自體PRP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。Ⅰ～Ⅳ度自體PRP +干細(xì)胞組治療優(yōu)良率均高于臭氧灌注 + HA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。自體PRP治療組在Ⅱ度患者中治療優(yōu)良率與臭氧灌注+ HA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；在Ⅰ度以及Ⅲ～Ⅳ度患者中，2組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3.3 不同預(yù)后患者印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13水平比較 預(yù)后良好組印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13的含量明顯低于預(yù)后不良組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

3.4 印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13與病變程度的Spearman相關(guān)性分析 KOA患者的印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13水平經(jīng)等級相關(guān)分析，與患者的病變程度均呈正相關(guān)（r = 0.790、r = 0.476、r = 0.684，P < 0.01）。

4 討 論

KOA患者會因為疼痛因素的影響而減少自身的活動量，所以容易造成周圍肌肉萎縮、關(guān)節(jié)失穩(wěn)、韌帶松弛，以及關(guān)節(jié)應(yīng)力不均等癥狀，一旦改變正常負(fù)荷傳導(dǎo)，則會很容易加重對關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞。

關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子種類繁多，成分復(fù)雜，是一組具有可調(diào)性的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，可以傳達(dá)細(xì)胞間的信號，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，如細(xì)胞間的信息傳導(dǎo)、生長和分化。細(xì)胞因子被認(rèn)為在KOA的發(fā)病中扮演著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子能夠促使軟骨細(xì)胞分泌促炎相關(guān)因子，最初由滑膜產(chǎn)生，然后透過關(guān)節(jié)液彌散到軟骨表面。臨床上，白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-18、TNF-α符合用于診斷的分類，可用于輔助OA的早期診斷［5-7］。另外，關(guān)節(jié)液中的蛋白酶如MMP-l、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9能夠直接反映軟骨的破壞情況，也與骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷密切相關(guān)［8-9］。使用新的研究技術(shù)檢測關(guān)節(jié)液相關(guān)標(biāo)志物，如研究者利用關(guān)節(jié)炎動物模型，進(jìn)行磁捕獲關(guān)節(jié)標(biāo)志物研究，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原C-肽端、葡糖氨基聚糖、軟骨寡基質(zhì)蛋白可以捕獲［10-11］。此外，外源性和內(nèi)源性晶體物質(zhì)可以在關(guān)節(jié)液中檢測到，如在診斷KOA中最常用的水尿酸鈉鹽化合物、焦磷酸鈣鹽脫水物和磷酸鈣鹽［12］。

印度刺猬蛋白屬于刺猬信號通路蛋白家族，具有調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大、增殖以及軟骨內(nèi)成骨的明顯作用。研究結(jié)果顯示，KOA患者關(guān)節(jié)液中印度刺猬蛋白含量明顯上升，印度刺猬蛋白的表達(dá)水平與膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度密切相關(guān)［13］。印度刺猬蛋白可通過誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大，降解軟骨基質(zhì)以及促進(jìn)MMP-13的表達(dá)，以促進(jìn)KOA的發(fā)展進(jìn)程。

PAP等［14］研究不同程度KOA患者不同層面軟骨組織中MMP-3和uPA的表達(dá)情況，認(rèn)為兩者之間呈正相關(guān)，協(xié)同作用，共同加快軟骨組織的降解。uPA/uPAR與細(xì)胞因子之間相互影響，相互調(diào)節(jié)，共同促進(jìn)KOA的發(fā)病和進(jìn)展。

目前，有26種MMPs被發(fā)現(xiàn)，按發(fā)現(xiàn)的先后順序依次被命名為MMP-1到MMP-26。MMP-13在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的表達(dá)明顯增高，約為正常軟骨的10倍［15］。研究發(fā)現(xiàn)，在KOA患者軟骨損傷部位，軟骨Ⅱ型膠原發(fā)生降解，并且同一區(qū)域的MMP-13 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，增高程度與病變部位軟骨損傷的破壞程度一致，也表明軟骨損傷程度越嚴(yán)重，酶的表達(dá)程度越高；并且對比發(fā)現(xiàn)，軟骨正常區(qū)域并未降解［16-17］。

本研究通過對120例KOA患者的關(guān)節(jié)液組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)KOA患者關(guān)節(jié)液中的印度刺猬蛋白水平、uPA在關(guān)節(jié)液中的表達(dá)水平和MMP-13的表達(dá)程度明顯高于正常對照組，與患者后期康復(fù)水平呈現(xiàn)一致性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。這些臨床研究結(jié)果表明，印度刺猬蛋白、uPA和MMP-13在KOA的發(fā)病機(jī)制中有著極其重要的地位。KOA的發(fā)病過程是漫長并且復(fù)雜的，至今尚未能完全產(chǎn)闡明。根據(jù)本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為，在KOA發(fā)病的早期，軟骨細(xì)胞分泌很少量的uPA、MMP-13等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子與其特異性抑制劑的比例處于一個平衡狀態(tài)，但隨著KOA的發(fā)展，這種平衡被打破。通過對患者關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子的表達(dá)水平檢測，臨床醫(yī)師指導(dǎo)早期患者改正不良的生活方式和習(xí)慣，KOA的發(fā)病進(jìn)程將會減速或者終止。對于KOA已經(jīng)發(fā)展到一定程度的患者，通過檢測關(guān)節(jié)液中uPA、印度刺猬蛋白和MMP-13的含量變化，可以為KOA的治療效果提供參考指標(biāo)，并且能夠為臨床醫(yī)師更好地判斷患者病情變化提供依據(jù)。

KOA的發(fā)生、發(fā)展是多種因素共同作用、共同參與的結(jié)果，筆者在研究的過程中試圖發(fā)現(xiàn)更多與KOA發(fā)生相關(guān)的因素，并且期待找出它們之間的作用規(guī)律。希望本研究能夠為臨床醫(yī)師判斷疾病的進(jìn)程、治療效果，以及為KOA的治療和預(yù)防提供一些參考依據(jù)。

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收稿日期：2022-04-15；修回日期：2022-06-01

作者單位：1.山東省泰山醫(yī)院，山東 泰安 271099；2.泰安市中醫(yī)醫(yī)院，山東 泰安 271000；3.泰安市中心醫(yī)院，山東 泰安 271000；4.山東景源生物科技有限公司，山東 泰安 271000

通信作者：田麗娜 山東省泰安市高新區(qū)北天門大街2957號，tianangelt@163.com