實(shí)驗(yàn)兔胸腺取材及檢測(cè)方法*

方 慧 田岳鳳

(1.運(yùn)城第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，運(yùn)城 044000)(2.山西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，晉中 030619)

胸腺是T細(xì)胞發(fā)育成熟的關(guān)鍵，機(jī)體重要的中樞免疫器官之一。它還可以分泌多種胸腺激素及激素類物質(zhì)，具內(nèi)分泌功能。胸腺對(duì)于機(jī)體的健康有著十分重要的作用，一些免疫力功能低下或自身免疫疾病、腫瘤的發(fā)生及衰老等與胸腺密切相關(guān)[1]。兔在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，主要用于免疫學(xué)、生物制品、發(fā)熱解熱和檢測(cè)致熱源、生殖生理和避孕藥、眼科學(xué)、骨骼等多個(gè)方面[2]。目前兔在免疫學(xué)的應(yīng)用中，關(guān)于其胸腺的論述較少，這可能與其退化和取材的困難性有關(guān)。因此本文就兔胸腺的發(fā)育退化過(guò)程及取材時(shí)的注意事項(xiàng)敘述如下，希望可以對(duì)一些研究有所幫助。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組

清潔級(jí)大耳白兔8只，雌雄各半，體質(zhì)量(2.18±0.23)kg，由北京昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)提供【動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0007】，飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)科研樓，實(shí)驗(yàn)室溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度45%～65 %，隨機(jī)分為空白組、免疫抑制模型組，每組4只。

1.2 儀器和試劑

注射用環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)(200 mg/瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857)，恒溫箱(三洋，MIR-262)，石蠟包埋機(jī)(孝感亞光，YB-6LF)，顯微鏡(奧林巴斯，BX51)。

1.3 造模及取材

實(shí)驗(yàn)以環(huán)磷酰胺制備免疫抑制模型，造模方法以60 mg/kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)造模7 d[7]，空白組連續(xù)腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，飼養(yǎng)20 d后進(jìn)行胸腺組織取材。

2 結(jié)果

2.1 一般形態(tài)結(jié)果

一般形態(tài)結(jié)果顯示，胸腺多呈左、右雙葉狀，質(zhì)地偏硬，與脂肪組織比更有韌性。其中空白組胸腺多呈淡粉色，環(huán)磷酰胺模型組胸腺多呈白色。

2.2 HE染色結(jié)果

圖1 兔胸腺HE染色切片(×200)Fig.1 HE staining of thymus from rabbits (×200)

為了確定取材的結(jié)果及胸腺退化的程度，對(duì)其進(jìn)行HE染色，如圖1：空白組胸腺結(jié)構(gòu)完整，皮髓界限清楚，皮質(zhì)淋巴細(xì)胞密集；免疫抑制模型組胸腺失去正常結(jié)構(gòu)，皮髓界限不清，皮質(zhì)淋巴細(xì)胞減少，周圍脂肪組織多。

3 討論

3.1 兔胸腺發(fā)育退化過(guò)程

胸腺是機(jī)體重要的中樞免疫器官，動(dòng)物和人的胸腺隨著年齡的增長(zhǎng)均會(huì)逐漸萎縮退化，主要表現(xiàn)為脂肪組織增多、體積變小和初始T淋巴細(xì)胞輸出減少，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，增加了患感染、腫瘤和自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。胸腺這種隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的形態(tài)改變和功能退化被稱為胸腺增齡性萎縮[3-4]。

兔胸腺起于頸部，分為左、右兩葉，大部分位于胸腔前縱隔，在胸骨后面并緊靠心臟，表面有薄層結(jié)締組織被膜(圖2)。在兔的生長(zhǎng)發(fā)育期間，幼兔的胸腺最為明顯，長(zhǎng)度約2.5 cm，寬2 cm，厚4 mm。重量為2.3～2.8 g，占總體質(zhì)量的百分比也最高，但是隨著年齡的增加，該器官也發(fā)生著明顯的退行性變化, 主要表現(xiàn)為出現(xiàn)大部分脂肪組織，僅剩下極少的胸腺皮質(zhì)或髓質(zhì)，成兔的胸腺幾乎全被脂肪和結(jié)締組織填充[5]。

圖2 兔胸腺的解剖位置Fig.2 Anatomical location of rabbit thymus

3.2 具體年齡對(duì)應(yīng)的胸腺狀況

兔從出生到斷奶的時(shí)期稱為仔兔期，一般為0～35 d；斷奶當(dāng)天至3月齡的時(shí)期稱為幼兔期，整3月齡的家兔平均體質(zhì)量在1.7～2.0 kg；滿3月齡至初配前稱為中兔期也稱后備兔，這個(gè)時(shí)期的家兔4月齡平均體質(zhì)量2.0～2.3 kg，5月齡平均體質(zhì)量在2.5～2.8 kg。一般培養(yǎng)、毒性實(shí)驗(yàn)多使用45～90 d的幼兔，慢性實(shí)驗(yàn)使用90～180 d的兔[6]。就目前取材的胸腺發(fā)現(xiàn)：尚未開始退化的胸腺呈粉紅色，開始退化之后的胸腺，顏色偏白，這與其大量的脂肪組織增多有關(guān)，可能顏色的變化能說(shuō)明其退化的程度(圖3)。

圖3 兔胸腺組織Fig.3 Rabbit thymus tissue

3.3 取材要點(diǎn)及注意事項(xiàng)

(1)胸腺位置準(zhǔn)確定位

將兔麻醉后仰臥位置捆綁固定于兔解剖臺(tái)上，因?yàn)榧彝玫男叵傥挥谛毓呛竺娌⒕o靠心臟，基本位于第1～3肋骨處，所以我們找取胸腺時(shí)多用手術(shù)刀和手術(shù)剪沿腹白線向上打開胸腔，先暴露其心臟，發(fā)現(xiàn)心臟后繼續(xù)向上剪開胸骨，注意此時(shí)的動(dòng)作一定要小心，防止傷及胸腺。在胸腔充分暴露后，多數(shù)情況下會(huì)發(fā)現(xiàn)胸腺就覆蓋在心臟上，呈左、右雙葉狀，還未出現(xiàn)退化情況的胸腺呈淡粉色，已退化的胸腺因組織中脂肪不斷增多其顏色多偏白；還有一些情況會(huì)發(fā)現(xiàn)胸腺?zèng)]有覆蓋在心臟上而是緊貼于胸骨，但是也呈雙葉狀；此外有極少例可能是胸腺已經(jīng)完全退化,并沒有找到胸腺組織。

(2)明確胸腺的分布區(qū)域

用手術(shù)鑷夾起覆蓋于心臟上方或胸骨后方的胸腺，稍微向上挑起，會(huì)發(fā)現(xiàn)它起自于兔頸部的位置，肉眼仔細(xì)觀察胸腺起始的這個(gè)區(qū)域，為之后的取材打下基礎(chǔ)，防止取材到一半不知道這個(gè)部分是不是自己要的。因?yàn)樾叵倥c縱隔脂肪組織的真正界限比較難以確定，尤其是已經(jīng)發(fā)生退化的胸腺組織。

(3)取材方法

因?yàn)樾叵俦砻嬗斜咏Y(jié)締組織被膜，讓其緊貼于心臟上方或胸骨后方，因此在取材的時(shí)候需要用小的手術(shù)剪將其分離，分離后的重點(diǎn)就在于胸腺和頸部連接的部位的處理，這個(gè)時(shí)候千萬(wàn)要小心，防止出血過(guò)多。這是因?yàn)樾叵傺汗?yīng)主要來(lái)自于幾條從胸腺四周穿越被膜進(jìn)入小葉間隔的小動(dòng)脈[8]。其血供雖然不是很豐富，但是如果不注意，沿著胸腺與頸部的連接部位隨意處理，會(huì)引起一定的出血，而兔胸腺的顏色呈粉紅色或者淡白色，著色淺而輕薄，這些出血會(huì)和胸腺組織的顏色發(fā)生變化，與周圍組織難以區(qū)分，造成接下來(lái)分離的困難。

取材完畢后，將取下的標(biāo)本放置于0.9%氯化鈉溶液中，把表面的血液清洗后用濾紙擦拭干凈。接下來(lái)，用手術(shù)鑷和手術(shù)剪進(jìn)行下一步的工作，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)生退化的胸腺組織與縱隔脂肪組織的界限比較難以區(qū)分，如果對(duì)自己取到的組織不太確定可以用自己的雙手的拇指和食指進(jìn)行揉捏感受一下它的質(zhì)地，正常情況下胸腺的質(zhì)地偏硬比較有韌性，而脂肪組織的質(zhì)地偏軟，沒什么韌性，可以根據(jù)此對(duì)取到的標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。

綜上可知，隨著年齡增長(zhǎng)，兔胸腺會(huì)不斷退化，有的甚至消失，并且經(jīng)環(huán)磷酰胺制備的免疫抑制模型后，兔胸腺組織形態(tài)也發(fā)生明顯的不可逆的改變。