低海拔人工飼養(yǎng)條件下喜馬拉雅旱獺血液生理生化及性激素指標(biāo)的測(cè)定與分析*

聶金秋 朱慶峰 顏 彬 朱 彬 周順長(zhǎng) 楊東亮 王遠(yuǎn)志 王寶菊

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢 430022)(2.華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，武漢 430030) (3.石河子大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，石河子 832000)

喜馬拉雅旱獺(Marmotahimalayana)是嚙齒目(Rodentia)、松鼠科(Sciuridae)、旱獺屬(Marmota)的大型地棲性嚙齒類哺乳動(dòng)物之一，低氧高寒較高海拔的青藏高原及其周邊地區(qū)是其主要的活動(dòng)區(qū)域[1]，高海拔低氧的生長(zhǎng)環(huán)境賦予其特殊的生理特征。喜馬拉雅旱獺作為一種寶貴的實(shí)驗(yàn)資源，深化研究并不斷推進(jìn)其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程，有利于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的發(fā)展，也利于生物醫(yī)學(xué)研究中用其作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建造。近些年來(lái)，在國(guó)內(nèi)外多個(gè)科研項(xiàng)目中，旱獺頻頻作為研究人類乙肝病毒和抗核苷酸藥物毒性評(píng)價(jià)等研究的模型動(dòng)物[2-3]。本文對(duì)新疆地區(qū)人工飼養(yǎng)條件下不同性別、年齡及飼養(yǎng)時(shí)間、喜馬拉雅旱獺的血液生理、生化及性激素各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定和統(tǒng)計(jì)分析，旨在為喜馬拉雅旱獺的健康管理、配種繁育甚至產(chǎn)業(yè)化及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化等研究提供相應(yīng)的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

捕捉生長(zhǎng)于海拔2 000～3 000 m新疆和田地區(qū)的45只喜馬拉雅旱獺，雄性旱獺24只，雌性旱獺21只(無(wú)妊娠期個(gè)體)；3歲齡以下旱獺22只，3歲齡及以上旱獺23只。在捕捉地隔離15 d，所有動(dòng)物經(jīng)鼠疫檢測(cè)陰性，臨床檢查體健，確認(rèn)其不攜帶各類烈性傳染病病原體及各類寄生蟲，多輪衛(wèi)生檢疫合格后轉(zhuǎn)運(yùn)至海拔470 m左右的新疆石河子進(jìn)行低海拔適應(yīng)性人工飼養(yǎng)。

飼養(yǎng)管理及環(huán)境：飼養(yǎng)室內(nèi)光照一般為自然光照，光照時(shí)間強(qiáng)度不足時(shí)可由日光燈補(bǔ)充。溫度控制在 10～15 ℃，維持相對(duì)濕度40%～60%，每日定時(shí)啟動(dòng)室內(nèi)空氣輸送系統(tǒng)，交互室外空氣，盡量保持內(nèi)外壓強(qiáng)及空氣氧含量一致，并降低由氨氣聚集形成的異味。每日3次定時(shí)飼喂；每日食物供給為新鮮可食青草、蔬菜、水果及顆粒飼料的多樣組合，其中顆粒飼料營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)為：粗蛋白12%、粗脂肪3%、粗纖維40%、粗灰分6%、水分30%；供給清潔弱酸化水。每日清掃1次室內(nèi)并充分沖洗籠具中托糞盤；每15 d使用2%過(guò)氧乙酸將飼養(yǎng)場(chǎng)地及設(shè)施特別是籠具清潔消毒1次[1]。

1．2 方法

1.2.1血樣采集：上述動(dòng)物人工飼養(yǎng)6個(gè)月和18個(gè)月后各采樣1次，采樣時(shí)間均為10月份。方法為：早晨空腹?fàn)顟B(tài)下，人工保定動(dòng)物，后肢肌肉內(nèi)注射鹽酸氯胺酮進(jìn)行麻醉，由后肢靜脈采集血液，共采集5 mL全血，其中乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2) 抗凝血 2 mL，用于血常規(guī)檢測(cè)，非抗凝血3 mL，分離得血清，用于血清生化指標(biāo)及性激素指標(biāo)檢測(cè)[4-5]，所有樣本在采集完畢置于冰盒中后立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)[4-5]。

1.2.2血液生理指標(biāo)測(cè)定：應(yīng)用希森美康XN-1000(B4) 全自動(dòng)血球細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，全血玻璃涂片鏡檢和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)采用顯微鏡下人工計(jì)數(shù)復(fù)核，檢測(cè)正常血常規(guī)指標(biāo)8項(xiàng)，分別為白細(xì)胞(WBC)數(shù)、中性粒細(xì)胞(NEUT)百分率、淋巴細(xì)胞(LYM)百分率、單核細(xì)胞(MONO)百分率、嗜堿粒細(xì)胞(BA)百分率、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)和血小板(PLT)。

1.2.3血清生化指標(biāo)測(cè)定：應(yīng)用強(qiáng)生VITROS 5600全自動(dòng)生化免疫分析儀(干化學(xué)法)進(jìn)行血生化常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)，檢測(cè)常用正常血液部分生化指標(biāo)9項(xiàng)，分別為肝功能參數(shù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TB)、直接膽紅素(DB)，腎功能參數(shù)尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)，以及空腹血糖(GLU)。

1.2.4血清性激素測(cè)定：應(yīng)用羅氏Cobas E602全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀(電化學(xué)法發(fā)光)進(jìn)行性激素常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)，檢測(cè)常用正常血液性激素指標(biāo)3項(xiàng)，分別為孕酮、睪酮及雌二醇。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血液常規(guī)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

通過(guò)血常規(guī)分析，獲得喜馬拉雅旱獺血液生理指標(biāo)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。3歲齡及以上旱獺的血紅蛋白(Hb)水平明顯高于3歲齡以下旱獺(P<0.05)，而3歲齡以下旱獺的血小板(PLT)水平明顯高于3歲齡及以上旱獺(P<0.05)，余血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)在不同年齡組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。人工飼養(yǎng)1年以下旱獺的血小板(PLT)水平明顯高于人工飼養(yǎng)1年及以上旱獺(P<0.001)，余血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)在不同飼養(yǎng)年限組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同性別組間血常規(guī)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

通過(guò)血清血生化分析，獲得喜馬拉雅旱獺血液血生化指標(biāo)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。血清生化檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)中，雌性旱獺的血清總膽紅素(TB)明顯高于雄性(P<0.05),直接膽紅素(DB)水平也明顯高于雄性(P<0.05)，而雄性的血清尿素氮(BUN)水平明顯高于雌性(P<0.05)，余血生化各項(xiàng)指標(biāo)在不同性別組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3歲齡及以上旱獺的血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)及肌酐(CREA)水平明顯高于3歲齡以下旱獺(P<0.01，P<0.001)，余血生化各項(xiàng)指標(biāo)在不同年齡組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同飼養(yǎng)時(shí)間組間血生化各檢測(cè)指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 血液性激素測(cè)定結(jié)果

通過(guò)血清性激素分析，獲得喜馬拉雅旱獺血液性激素指標(biāo)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。血液性激素檢測(cè)中各項(xiàng)指標(biāo)，3歲齡及以上雌性旱獺的血清雌二醇水平明顯高于3歲齡以下雌性(P<0.05)，3歲齡及以上雌性旱獺的血清雌二醇水平顯著高于同齡雄性(P<0.001)，相同飼養(yǎng)時(shí)間不同性別組間雌性旱獺的血清雌二醇水平均高于雄性(P<0.05)，不同飼養(yǎng)時(shí)間相同性別組間血清雌二醇水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本次檢測(cè)中，旱獺血清孕酮水平極低，血清睪酮水平也較低，各組間血清孕酮及睪酮水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 人工飼養(yǎng)喜馬拉雅旱獺血常規(guī)參數(shù)與性別、年齡和飼養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系Table 1 The relationship between blood parameters of captive Marmota himalayan and sex, age and feeding time

表2 人工飼養(yǎng)喜馬拉雅旱獺血生化參數(shù)與性別、年齡和飼養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系Table 2 The relationship between blood biochemical parameters of the captive Marmota himalayan and gender, age and feeding time

表3 人工飼養(yǎng)喜馬拉雅旱獺性激素參數(shù)與性別、年齡和飼養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系Table 3 The relationship between sex hormone parameters and sex, age and feeding time of the captive Marmota himalayan

3 討論

喜馬拉雅旱獺是具有冬眠特性的高原原生哺乳動(dòng)物，其生理狀態(tài)、海拔高度及季節(jié)周期關(guān)聯(lián)密切[10-11]，作為可用于研究人類乙肝、脂代謝疾病及藥物安全性評(píng)價(jià)等方面的新型動(dòng)物模型[6-9]，具有很高的科研價(jià)值。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化研究中擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源并實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展是亟待解決的問題之一，而高原野生動(dòng)物資源有限且健康狀況不明[1]，受地理?xiàng)l件限制，捕捉與運(yùn)輸工作均也存在一定困難和風(fēng)險(xiǎn)，為此我們嘗試開展適應(yīng)性低海拔人工飼養(yǎng)管理旱獺的工作，并測(cè)量了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化研究中具有重要價(jià)值的低創(chuàng)傷指標(biāo)——血常規(guī)、血生化與血清性激素，以判定此環(huán)境下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康及疾病狀態(tài)，以探尋更優(yōu)化的飼養(yǎng)管理與配種繁育模式。

從血常規(guī)指標(biāo)變化分析，機(jī)體血小板數(shù)目在生成與破壞中保持一定的平衡，系統(tǒng)調(diào)控復(fù)雜，影響因素眾多，其中不同海拔不同適應(yīng)時(shí)間對(duì)不同物種血小板數(shù)目的影響尚無(wú)一致結(jié)論[12]。不同海拔高度飼養(yǎng)的SD大鼠、青海湖羊的血小板數(shù)目與海拔高度呈負(fù)相關(guān)[13-14]，藏豬、藏雞的血小板數(shù)目與海拔高度呈正相關(guān)[15-16]，有研究報(bào)道稱，久居高原漢族返回平原1年后血小板水平顯著降低[17]，青海旱獺血小板水平隨海拔降低有逐步降低的趨勢(shì)[10]，這與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上相符，隨著低海拔適應(yīng)性人工飼養(yǎng)時(shí)間增加，新疆旱獺的血小板數(shù)目降低。既往研究報(bào)道，多數(shù)物種，如昆明犬、北平頂猴、SPF小型豬及四川大熊貓的血小板數(shù)目隨著年齡的增長(zhǎng)而降低[18-21]，青海旱獺血小板數(shù)目也有隨年齡的增長(zhǎng)而降低的趨勢(shì)[4]，在本研究中，新疆旱獺血小板數(shù)目與年齡的關(guān)系一致，可能是隨著年齡的增長(zhǎng)，血小板的破壞會(huì)增加，終致血小板數(shù)目降低。紅細(xì)胞與血紅蛋白水平反應(yīng)了機(jī)體的載氧能力，研究表明，紅細(xì)胞及血紅蛋白水平多與海拔高度呈正相關(guān)[22]，同時(shí)也受到年齡的影響，如牦牛血紅蛋白水平隨年齡的增加而升高[23]。既往研究中青海旱獺隨著年齡增長(zhǎng)紅細(xì)胞及血紅蛋白水平無(wú)明顯改變[4]，相較于該研究，本次研究中調(diào)整了食物的比例，增加了蛋白質(zhì)配比，一方面海拔降低雖可能致紅細(xì)胞及血紅蛋白水平降低，另一方面人工飼養(yǎng)條件下食物充足，隨著旱獺年齡增加其環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)且營(yíng)養(yǎng)水平改善程度更甚，血紅蛋白的合成增加，綜合呈現(xiàn)的結(jié)果為紅細(xì)胞水平保持穩(wěn)定，而血紅蛋白水平顯著升高。既往研究中青海旱獺外周血中炎性細(xì)胞略有波動(dòng)但大體上可保持穩(wěn)定[4]，這與本研究中不同性別、年齡及飼養(yǎng)時(shí)間組間炎性細(xì)胞指標(biāo)無(wú)明顯差異的結(jié)果基本一致，可能是人工飼養(yǎng)管理下，外部環(huán)境更為穩(wěn)定，飼養(yǎng)房中可能致動(dòng)物處于亞健康甚至疾病狀態(tài)的各類因素得到控制，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)水平得到保障，旱獺的生理狀態(tài)更為穩(wěn)定。

從血清生化指標(biāo)變化分析，總蛋白、白蛋白、尿素氮及肌酐水平反應(yīng)了機(jī)體蛋白質(zhì)代謝水平，食物中蛋白質(zhì)的含量增加，機(jī)體總蛋白及白蛋白的合成增加，但同時(shí)增加了機(jī)體蛋白質(zhì)分解代謝負(fù)擔(dān)。既往研究中青海旱獺總蛋白及白蛋白水平隨著年齡的增長(zhǎng)而降低[5]。但相比該研究，本研究中動(dòng)物食物結(jié)構(gòu)比例優(yōu)化，蛋白質(zhì)含量提升。成年旱獺血清總蛋白、白蛋白及肌酐水平更高，雄性旱獺的尿素氮水平也較高，與成年體旱獺及雄性旱獺的體型偏大且營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)更好不無(wú)關(guān)系。既往研究報(bào)道雌二醇、肝細(xì)胞功能及膽紅素代謝三者聯(lián)系緊密，雌二醇水平與膽紅素水平呈正相關(guān)[24]，同時(shí)旱獺在不同季節(jié)其血液生化指標(biāo)可能存在波動(dòng)[11]，既往研究中青海正常毛色雌雄旱獺總膽紅素水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5,25]，而10月青海白化雌旱獺的血清膽紅素水平顯著高于雄性[25]，膽紅素指標(biāo)與肝臟功能、激素波動(dòng)、食物、適應(yīng)性等相關(guān)，本研究中，人工飼養(yǎng)條件下旱獺飲食統(tǒng)一，雌性旱獺的膽紅素水平更高，可能與高雌激素水平有關(guān)，也可能與新疆旱獺的體質(zhì)有關(guān)，但也需對(duì)動(dòng)物狀態(tài)做進(jìn)一步檢查，如開展腹部B超及肝臟穿刺等檢查，以排除肝膽系統(tǒng)可能存在的隱性損傷導(dǎo)致的血清膽紅素水平升高。既往研究中，青海旱獺在人工飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)年限增加生化指標(biāo)可基本保持穩(wěn)定[5]，本研究中，隨低海拔適應(yīng)性人工飼養(yǎng)年限增加，旱獺血清血生化各項(xiàng)指標(biāo)仍保持穩(wěn)定，說(shuō)明喜馬拉雅旱獺能適應(yīng)低海拔地區(qū)的人工飼養(yǎng)。

從血清性激素指標(biāo)變化分析，性激素水平變化貫穿動(dòng)物的生殖周期，嚙齒類動(dòng)物的血清性激素水平的影響因素眾多，如性別、年齡及季節(jié)周期等[26]。10月份為赤腹松鼠的繁殖休止期，在10月份赤腹松鼠雌、雄間血清睪酮水平相近，孕酮水平降到最低，雌激素水平雌性高于雄性[27]，與本研究中旱獺性激素各指標(biāo)的走勢(shì)大致相似。幼獺長(zhǎng)到3歲達(dá)性成熟狀態(tài)[28]，這與本研究中旱獺雌二醇水平與年齡及性別的關(guān)系一致。本研究中性別相同飼養(yǎng)時(shí)間、不同組間性激素指標(biāo)無(wú)明顯改變，而相同飼養(yǎng)時(shí)間、不同性別組間差異有顯著性的指標(biāo)僅雌二醇，說(shuō)明低海拔適應(yīng)性人工飼養(yǎng)時(shí)限對(duì)旱獺血清性激素水平的影響比較有限，總體上人工飼養(yǎng)條件下，旱獺生殖激素水平可基本保持穩(wěn)定。

綜上所述，新疆喜馬拉雅旱獺表現(xiàn)出較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，在低海拔適應(yīng)性人工飼養(yǎng)管理下，旱獺會(huì)出現(xiàn)了一些適應(yīng)性改變，如血小板水平降低，但其生理狀態(tài)總體上可基本保持穩(wěn)定，且營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)得到改善。本研究為繁殖休止期旱獺的生理狀態(tài)判定積累了數(shù)據(jù)，為了盡可能提升低海拔適應(yīng)性人工飼養(yǎng)管理的效果，后期可隨其生殖周期密切監(jiān)測(cè)相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)而更全面地掌握旱獺的健康狀態(tài)及生殖規(guī)律，以期盡快摸索出低海拔人工繁育及產(chǎn)業(yè)化的道路。