8種植物精油對(duì)4種植物病原真菌的抑菌活性及椒蒿精油的GC-MS成分分析

趙娜娜，楊安沛，加米古麗·木斯?fàn)柡?，閆曦蕊

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091）

新疆是國內(nèi)棉花的主產(chǎn)區(qū)，總種植面積、單位面積產(chǎn)量和總產(chǎn)量穩(wěn)居全國首位[1]。棉花在生長發(fā)育期內(nèi)可遭受多種病原菌的侵害，嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，包括枯萎病、黃萎病、苗期病害（紅腐病和立枯?。⒁约凹?xì)菌性角斑病，統(tǒng)稱為棉花4大病害[2]。棉花枯萎病是造成棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)下降的主要病害之一，在棉花的整個(gè)生育期都能造成侵害[3]，是主要由尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum引起的一種真菌土傳病害[4]。棉花紅腐病病原菌以串珠鐮刀菌F.moniliforme為主[5]，近年來發(fā)生危害漸增，在適宜條件下造成缺苗斷壟、產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降[6-8]。

甜菜在國內(nèi)的主產(chǎn)區(qū)集中在新疆、內(nèi)蒙古及黑龍江，總種植面積和總產(chǎn)量約占全國的90%左右。其中，新疆種植面積最大、單產(chǎn)最高[9,10]。在甜菜生育期會(huì)發(fā)生多種病害，造成甜菜產(chǎn)量損失和質(zhì)量下降，使得其經(jīng)濟(jì)價(jià)值大大降低。甜菜根腐病是重要的病害之一，在新疆普遍發(fā)生，且有日益加重的趨勢(shì)，嚴(yán)重者甚至造成絕收，嚴(yán)重制約甜菜生產(chǎn)[11]。甜菜根腐病可由多種病原菌引起，包括黃色鐮孢菌F.culmorum引起的鐮刀菌根腐病和立枯絲核菌Rhizoctonia solani引起的絲核菌根腐病，據(jù)報(bào)道，這兩種病害在我國所有甜菜產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，特別是甜菜連年種植的地區(qū)[12]。

化學(xué)殺菌劑依然是控制棉花和甜菜病害最普遍的策略，如種子包衣、藥劑拌種和藥劑灌根等[12,13]。然而，化學(xué)殺菌劑的頻繁使用不僅顯著增加了植物病原菌的抗藥性，也對(duì)環(huán)境造成了負(fù)擔(dān)，給非靶標(biāo)生物造成生命威脅，破壞了生態(tài)系統(tǒng)中的自然生物控制能力。因此，植物病原菌的防治亟需開拓其他道路。

植物精油是從植物中提取的芳香類物質(zhì)，主要成分以萜烯及其氧化物和倍半萜烯為主，此外還有酯、酸、醛、酮等[14,15]，其中醛類、醇和酚類化合物具有抗真菌活性[16]。自然界中植物資源豐富，成分復(fù)雜，對(duì)植物精油抗菌活性的研究可為新型植物源殺菌劑的化學(xué)合成提供依據(jù)。本研究通過水蒸汽蒸餾法提取 8種植物精油，以分離自發(fā)病棉花的尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌和分離自發(fā)病甜菜的黃色鐮孢菌、立枯絲核菌為靶標(biāo)，評(píng)價(jià)8種植物精油對(duì)4種植物病原真菌的抑菌活性，為植物源殺菌劑的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 椒蒿采自新疆伊犁白石峰，驅(qū)蟲斑鳩菊、啤酒花、一枝蒿和香青蘭購于新疆伊鼎輝煌有限公司，蔞蒿、茵陳蒿和黃花蒿分別采集自江蘇省、陜西省和河南省。植物標(biāo)本保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院天然產(chǎn)物與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，8種植物信息詳見下表1。

表1 供試植物信息Table 1 Directory of tested plants

1.1.2 供試病原菌 尖孢鐮刀菌和串珠鐮刀菌分離自發(fā)病棉花，黃色鐮孢菌和立枯絲核菌分離自發(fā)病甜菜。4種病原真菌均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，菌種現(xiàn)保存于該實(shí)驗(yàn)室。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。

1.1.3 試驗(yàn)儀器及化學(xué)試劑 連續(xù)蒸餾裝置，北京玻璃儀器廠；LE204E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；PQX-280B-22H人工氣候箱，寧波萊福科技有限公司；電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；RE-52AA型號(hào)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-III循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；數(shù)控升降式水浴鍋，上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

無水硫酸鈉、正己烷（分析純），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物精油的提取 500 g植物（花期）經(jīng)過自然陰干、剪碎，置于體積為3000 mL的圓底燒瓶中，加入2000 mL水，使用連續(xù)蒸餾裝置蒸餾6 h；正己烷萃取油水混合物，無水硫酸鈉脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)濃縮（40 ℃）回收正己烷，剩余的油狀液體即為精油；精油收集于棕色瓶中密封保存，測(cè)比重，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 菌絲生長抑制法測(cè)定植物精油的抑菌活性 含藥平板的配制：在無菌操作條件下，將預(yù)先融化的49.5 mL的滅菌PDA培養(yǎng)基加入到無菌三角瓶中。正己烷為溶劑，配制濃度為50、5 μL/mL的精油溶液。吸取0.5 mL精油溶液加入到上述三角瓶中混勻，倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿，制成相應(yīng)濃度的含藥平板（1 mLPDA中含0.5 μL和0.05 μL精油）。試驗(yàn)設(shè)不加精油的處理為空白對(duì)照（0.5 mL正己烷）。

接種：選取菌落生長均勻的病原菌，用打孔器在菌落邊緣取直徑為5 mm菌餅，置于培養(yǎng)基中心，將培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱（25 ℃）中，培養(yǎng)6～9 d。

測(cè)量和數(shù)據(jù)分析：觀察對(duì)照組培養(yǎng)基的生長情況，待菌絲接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑( mm)，重復(fù)3 次，取平均值。利用Microsoft Excel 和SPSS 19.00 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計(jì)算相對(duì)抑制率[17]，運(yùn)用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－5）×100。根據(jù)上述活性測(cè)定結(jié)果，從中選取抑菌活性較好的精油，正己烷為溶劑稀釋成系列濃度（具體濃度如下表2和表3），按上述方法測(cè)定精油對(duì)4種病原真菌的抑菌活性，制訂回歸方程y = ax + b，并求其有效中濃度（EC50值）和95%有效濃度（EC95值）。

表2 椒蒿精油的供試濃度Table 2 Test concentrations of the essential oil of A.dracunculus against four fungi

表3 香青蘭精油的供試濃度Table 3 Test concentrations of the essential oil of D.moldavica against three fungi

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測(cè)定精油化學(xué)成分 樣品送至北京師范大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行檢測(cè)鑒定。采用美國Bruker公司450GC-320MS三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，配備BP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m)。EI離子源溫度：210 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：1 μL，分流比1∶10。升溫程序：起始溫度50 ℃，停留5 min，之后以10 ℃/min的速率升溫至290 ℃，停留15 min。通過HP-MSD化學(xué)工作站檢索Nist05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，檢測(cè)并鑒定精油化學(xué)成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油對(duì)4種病原真菌的抑菌活性

2.1.1 植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性 8種植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性如表4所示。在精油體積濃度為0.5 μL/mL時(shí)，香青蘭精油的抑菌率最高，可高達(dá)96.11%；其次為椒蒿和黃花蒿，抑菌率分別為73.20%和69.39%；其后，依次為一枝蒿、蔞蒿、啤酒花、茵陳蒿，抑菌率分別為57.23%、47.88%、41.82%、31.94%；活性最弱的是驅(qū)蟲斑鳩菊，抑菌率僅為12.42%。在精油體積濃度為0.05 μL/mL時(shí)，椒蒿、一枝蒿、香青蘭、黃花蒿的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌率分別為56.21%、49.06%、45.56%和44.90%，四者之間無顯著差異；驅(qū)蟲斑鳩菊在該濃度下無抑菌活性。

表4 植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性Table 4 Fungicidal activity of eight essential oils against F.oxysporum

2.1.2 植物精油對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌活性 8種植物精油對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌率如表5所示。在體積濃度為0.5 μL/mL時(shí)，椒蒿精油的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌率為91.84%，顯著優(yōu)于其他7種植物精油；其次為黃花蒿和一枝蒿，抑菌率為70.45%和62.60%；香青蘭、蔞蒿、啤酒花和茵陳蒿的活性稍弱，抑菌率分別為46.10%、45.14%、39.72%和39.61%，4種精油對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌活性相當(dāng)，無顯著差異；驅(qū)蟲斑鳩菊的活性最弱，抑菌率僅為3.70%。在體積濃度為0.05 μL/mL時(shí)，椒蒿精油對(duì)串珠鐮刀菌依然具有較好的抑菌活性，抑菌率為65.31%，顯著優(yōu)于其他7種植物精油。

表5 植物精油對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌活性Table 5 Fungicidal activity of eight essential oils against F.moniliforme

2.1.3 植物精油對(duì)黃色鐮孢菌的抑菌活性 8種植物精油對(duì)黃色鐮孢菌的抑菌活性如表6所示。香青蘭精油在體積濃度為0.5 μL/mL時(shí)，對(duì)黃色鐮孢菌的抑菌活性達(dá)到100%，可完全抑制該菌絲的生長。其次為椒蒿精油，抑菌率為80.95%。在體積濃度為0.05 μL/mL時(shí)，椒蒿精油的抑菌活性與香青蘭精油活性相當(dāng)，無顯著差異，抑菌率分別為 61.90%、55.09%。驅(qū)蟲斑鳩菊精油對(duì)黃色鐮孢菌無抑菌活性，其他 5種植物精油在兩種濃度下，對(duì)黃色鐮孢菌具有較弱的抑菌活性。

表6 植物精油對(duì)黃色鐮孢菌的抑菌活性Table 6 Fungicidal activity of eight essential oils against F.culmorum

2.1.4 植物精油對(duì)立枯絲核菌的抑菌活性 8種植物精油對(duì)立枯絲核菌的抑菌活性如表7所示。在體積濃度為0.5 μL/mL時(shí)，香青蘭精油抑菌率最高，高達(dá)98.55%，次之為椒蒿精油和黃花蒿精油，抑菌率為71.28%和70.91%。在體積濃度為0.05 μL/mL時(shí)，椒蒿和黃花蒿精油的抑菌活性依然較好，抑菌率分別為52.73%和61.03%。

表7 植物精油對(duì)立枯絲核菌的抑菌活性Table 7 Fungicidal activity of eight essential oils against R.solani

2.2 高活性精油對(duì)4種病原真菌的EC50和EC95

2.2.1 椒蒿精油對(duì)4種病原菌的EC50和EC95椒蒿精油對(duì)4種病原真菌均具有較高的活性。菌絲生長抑制法測(cè)定椒蒿精油對(duì)4種病原真菌的EC50值和EC95值結(jié)果如表8。椒蒿精油對(duì)尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、黃色鐮孢菌和立枯絲核菌的EC50值分別為0.134、0.083、0.122和0.165 μL/mL，EC95值分別為2.510、0.502、1.739 和 2.015 μL/mL。

表8 椒蒿精油對(duì)4種病原真菌的EC50值和EC95值Table 8 EC50 and EC95 value of the essential oil of A.dracunculus against four fungi

2.2.2 香青蘭精油對(duì)3種病原真菌的EC50生長速率法測(cè)定香青蘭精油對(duì)3種病原真菌的EC50和EC95值結(jié)果如表9。香青蘭精油對(duì)尖孢鐮刀菌、黃色鐮孢菌和立枯絲核菌的EC50值分別為0.062、0.037和0.194μL/mL，EC95值分別為 0.448、0.173 和 0.455 μL/mL。

表9 香青蘭精油對(duì)3種病原真菌的EC50值和EC95值Table 9 EC50 and EC95 value of the essential oil of D.moldavica against three fungi

2.3 GC-MS分析椒蒿精油的化學(xué)成分

椒蒿精油通過GC-MS檢測(cè)并鑒定出36個(gè)峰，其中出峰時(shí)間在21.46 min的物質(zhì)相對(duì)含量最高。由表10的質(zhì)譜分析結(jié)果可知，相對(duì)含量最高的為a,a-二甲基-1,4-二氧-2-奈乙醛（72.17%）。

表10 椒蒿精油的化學(xué)成分分析（＞1%）Table 10 Chemical constituents of the essential oil derived from A.dracunculus

3 討論

植物精油來源于自然，在自然界中資源豐富。相比于化學(xué)合成殺菌劑，植物精油具有化學(xué)成分多樣，殺菌譜廣，作用靶標(biāo)位點(diǎn)多樣，不易產(chǎn)生抗性，對(duì)環(huán)境友好，不殺傷非靶標(biāo)生物等優(yōu)點(diǎn)。已有研究證明，多種植物精油具有較強(qiáng)的殺菌活性，且殺菌譜廣，如大蒜、丁香、石香薷、百里香、牛至精油等[18-20]。據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可知，椒蒿、黃花蒿、啤酒花、茵陳蒿、香青蘭、蔞蒿和一枝蒿7種植物精油對(duì)4種病原菌均有一定的抑菌活性，其中香青蘭和椒蒿的活性最好。

香青蘭系維吾爾族、蒙古族常用藥材，在新疆維吾爾自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)具有豐富的植物資源[21]。香青蘭精油對(duì)尖孢鐮刀菌、黃色鐮孢菌和立枯絲核菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，在體積濃度為0.5 μL/mL時(shí)，抑菌率均在 95%以上，對(duì)串珠鐮刀菌的抑菌活性較弱，抑菌率為 46.10%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，香青蘭精油的主要成分為乙酸香葉酯（16.26%）、丁香酚（13.90%）、香葉醛（13.20%）、草蒿腦（7.89%）、丙烯酸-2-乙基己酯（8.55%）和橙花醛（7.60%）等[22]。其中，香葉醛、橙花醛具有殺菌活性[23,24]，是該精油主要的關(guān)鍵殺菌物質(zhì)。椒蒿為菊科蒿屬植物，在新疆博爾塔拉蒙古自治州的精河縣、溫泉縣，哈密地區(qū)巴里坤哈薩克自治縣，伊犁哈薩克自治州察布查爾錫伯自治縣等地，都有野生椒蒿的分布；椒蒿精油對(duì)灰葡萄孢菌、油菜菌核病菌、辣椒疫霉病菌和棉花枯萎病菌有較好的抑制活性[25]，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果可知椒蒿精油對(duì)多種病原真菌具有抑菌活性，椒蒿精油中相對(duì)含量最高的為 a,a-二甲基-1,4-二氧-2-奈乙醛(72.17%)，但其是否為關(guān)鍵化學(xué)成分還未知，需以活性成分測(cè)定為指導(dǎo)對(duì)精油進(jìn)行分離純化。椒蒿和香青蘭均為菊科植物，菊科植物是雙子葉植物的一大類，也是種子植物中種類最多的一科，植物源抗菌物質(zhì)在菊科中廣泛存在，開展對(duì)菊科植物殺菌活性的研究，對(duì)于開發(fā)利用豐富的菊科植物資源具有重要意義[26]，本文可為菊科植物綠色抑菌農(nóng)藥的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

精油的抗真菌作用是由于其對(duì)真菌細(xì)胞壁和質(zhì)膜的影響，這可能與質(zhì)膜的收縮、菌絲壁變形、細(xì)胞質(zhì)凝聚和菌絲體形成有關(guān)[27]；除此之外，精油成分的疏水性調(diào)節(jié)陽離子的滲透性，導(dǎo)致質(zhì)子動(dòng)力和細(xì)胞ATP合成的改變，影響線粒體系統(tǒng)的功能[28]。但確切的抑菌作用機(jī)制尚未得到明確的論證。椒蒿和香青蘭精油對(duì)植物病原真菌的作用機(jī)制也暫不明確，值得進(jìn)一步研究，研究結(jié)果可為新型殺菌劑的化學(xué)合成提供依據(jù)。