基于EPG技術(shù)的棉蚜抗性指標篩選

劉偉嬌，李玲玉，高雪珂，張開心，李東陽，雒珺瑜，崔金杰*，楊 君*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，保定 071000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室，安陽 455000）

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物，棉蚜Aphis gossypiiGlover屬于半翅目Hemiptera蚜科Aphididae，是棉花生產(chǎn)上主要害蟲之一。棉蚜主要通過刺吸取食、排泄蜜露等途徑為害棉花，使棉花生長發(fā)育受到嚴重影響[1-3]。同時由于其個體小、繁殖快、擴散能力強以及易產(chǎn)生抗性等特點，防治較為困難[4]，選育和種植抗蚜品種是進行蚜蟲綜合治理的重要措施之一。

刺探電位圖譜（electrical penetration graph，EPG）技術(shù)是一種可以將刺吸式口器昆蟲口針在寄主植物組織中復(fù)雜的刺探行為轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌ㄐ坞娦盘柕碾娚砑夹g(shù)，是探索寄主植物與刺吸式口器昆蟲之間隱秘的取食行為的有效手段[5,6]。目前，該技術(shù)在刺吸式口器昆蟲取食行為[7-9]、昆蟲與植物的互作關(guān)系[10]、害蟲的傳毒機制[11]、刺吸式口器昆蟲的寄主?；蚚12]等方面的研究中起到了越來越重要的作用。近年來，由于EPG參數(shù)具有可靠的穩(wěn)定性和可操作性，并能用于高通量的檢測，EPG技術(shù)逐漸應(yīng)用于寄主植物對刺吸式害蟲的抗性研究中[13]。但關(guān)于利用 EPG技術(shù)研究棉花對棉蚜抗性機制，探索可以判定棉花抗蚜等級指標方面的報道較少。

本研究通過室內(nèi)生物測定棉蚜取食不同抗性等級苗期棉花的死亡率、產(chǎn)仔數(shù)等生物學(xué)特征來評估不同種質(zhì)材料對棉蚜的影響，結(jié)合棉蚜在不同棉花品種上的EPG參數(shù)，分析了EPG各參數(shù)與生長發(fā)育參數(shù)的相關(guān)性，初步篩選可作為棉花對蚜蟲抗性鑒定的主要EPG參數(shù)，以期為棉花抗蚜性鑒定方法提供重要的數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

棉蚜采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場棉田，在室內(nèi)用棉花中棉所49（CCRI 49）飼養(yǎng)繁殖多代（n＞30）后用于試驗。

1.2 供試棉花品種

高抗材料：遼5632-642、TYJ-98-6、錦454、中G5；中抗材料：中棉所49（CCRI 49）、中棉所79（CCRI 79）、雷克斯（光葉）、非洲棉E-40；高感材料：遼棉6號。

以上材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種質(zhì)資源中期庫提供。抗性水平參考劉旭明等[14]、蘆屹等[15,16]、李進步等[17]、呂麗敏等[18]的研究結(jié)果和國家標準[19]。

1.3 棉蚜生物學(xué)測定

試驗在人工智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行，條件：溫度（26±1）℃，光周期14L∶10D，相對濕度70%～80%。將30頭成蚜接到獨立罩籠的中棉所49（常規(guī)品種）棉花葉片上，當其產(chǎn)仔時，移去成蚜，保留仔蚜繼續(xù)飼養(yǎng)，待到仔蚜長為成蚜后用于試驗。

采用在離體葉片上組建生命表的方法，將葉柄插入裝有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將1頭無翅棉蚜成蟲接到各個品種棉花葉片上，飼養(yǎng)2 d后開始試驗。每天調(diào)查、記錄存活蟲量及產(chǎn)仔量，試驗進行10 d。每培養(yǎng)皿為1次重復(fù)，每品種重復(fù)20次。每隔2 d更換1次葉片，保持葉片新鮮。

1.4 棉蚜刺吸電位試驗

待棉苗長至真葉3葉期，選擇體型大小基本一致的無翅成蚜用于試驗。使用八通道直流型（DC-EPG Giga-8）（荷蘭Wageningen University）刺吸電位儀來記錄棉蚜口針取食EPG波形，用DI-720型（美國Dataq instruments，Inc）信號轉(zhuǎn)換器來進行信號轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)采集過程參照湯清波等[20]。棉蚜在粘連金絲之后，對其進行1 h的饑餓處理。試驗時，調(diào)整棉蚜在棉花葉片背面上的位置，使其具有一定的活動范圍。隨后接通電源，進行記錄。記錄時間為6 h，每頭棉蚜只使用1次，每個處理取有效重復(fù)15～20次。

根據(jù)胡想順等[5]和何應(yīng)琴等[7]對蚜蟲取食行為波形的劃分，可將棉蚜在棉花上的取食波形分為以下幾種。（1）C波：蚜蟲口針在葉肉細胞間隙或韌皮部篩分子外部刺探；（2）Pd波：蚜蟲口針刺破細胞膜時所測的膜內(nèi)外電位差；（3）F波：蚜蟲口針在葉片表面和細胞外部遇到機械阻力的波形；（4）E1波：蚜蟲口針在韌皮部篩管內(nèi)分泌唾液；（5）E2波：蚜蟲口針在韌皮部篩管內(nèi)部被動取食；（6）Np波：非刺探時期波形。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

棉蚜在棉花上的生命表參數(shù)包括凈增殖率（R0），平均世代時間（T）以及內(nèi)稟增長率（rm），R0＝Σlxmx，T＝(Σxlxmx)/(Σlxmx)，rm＝lnR0/T，式中x為試驗時間（d），lx為棉蚜在x時的存活率，mx為棉蚜在x－1到x時間內(nèi)的每個重復(fù)產(chǎn)仔量，即每頭棉蚜產(chǎn)仔量。棉蚜在棉花上的存活率以及生命表參數(shù)均用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性比較（Duncan’s法），差異顯著性水平設(shè)為0.05。

EPG數(shù)據(jù)由style＋d軟件轉(zhuǎn)化成波形圖譜，記錄并保存；用分析軟件style＋a對波形進行分析。將各EPG參數(shù)分類統(tǒng)計后，運用SPSS 17.0軟件對棉蚜在不同棉花品種上的各EPG參數(shù)分別進行差異顯著性比較（Duncan’s）和主成分分析（PCA），差異顯著性水平設(shè)為0.05。

運用SPSS 17.0軟件對EPG主要波形與棉蚜存活率、平均產(chǎn)仔數(shù)進行相關(guān)性分析（Pearson法），差異顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉蚜在棉花葉片上的存活與繁殖

2.1.1 存活率 棉蚜在3組間的生存情況存在明顯差異。棉蚜在高抗品種“遼5632-642”、“錦454”上的存活率最低；高抗品種“TYJ-98-6”、“中 G5”和中抗品種“中棉所 79”上的次之；中抗品種“中棉所49”、“雷克斯（光葉）”、“非洲E-40”和高感品種“遼棉6號”上的棉蚜存活率最高，在80%以上；且差異達到顯著水平（P＜0.05）。棉蚜在各品種間的凈增殖率為：高抗品種“錦454”＜高抗品種“遼5632-642”、“TYJ-98-6” ＜高抗品種“中G5”、中抗品種“中棉所79”＜中抗品種“中棉所49”、“雷克斯（光葉）”、“非洲E-40”、高抗品種“遼棉6號”；其中以“遼棉6號”上的棉蚜凈增殖率最高，達到36.10；且差異顯著（P＜0.05）。平均世代時間在高抗品種“遼5632-642”、“錦454”上最低；在中抗品種“中棉所49”、“中棉所79”、“非洲E-40”上次之；在高抗品種“TYJ-98-6”、“中G5”和中抗品種“雷克斯（光葉）”、高感品種“遼棉6號”上最高；且差異顯著（P＜0.05）。各品種上的棉蚜平均世代在 4.84～6.42 d，各組間無明顯規(guī)律。棉蚜的內(nèi)稟增長率在高抗品種“遼 5632-642”、“TYJ-98-6”、“中G5”上最低，均低于52%；在高抗品種“錦454”、中抗品種“雷克斯（光葉）”和高感品種“遼棉6號”上次之；在中抗品種“中棉所49”、“中棉所79”、“非洲E-40”上最高；且差異顯著（P＜0.05）。棉蚜在這3組抗性品種上均表現(xiàn)為rm＞0且R0＞1，可以產(chǎn)仔的成蚜多，且產(chǎn)仔量大，為增長型種群，即棉蚜可以在田間這幾種棉花品種上建立種群，但在高感品種上棉蚜的種群存活數(shù)量更多且擴繁能力更強（表1）。

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2.1.2 繁殖率 在高抗品種“遼5632-642”和“錦454”上的棉蚜平均產(chǎn)仔數(shù)最少，均低于20頭；在高抗品種“TYJ-98-6”和“中G5”上次之；在中抗品種和高感品種上最多；且差異達到顯著水平（P＜0.05）。高抗品種上的棉蚜產(chǎn)仔數(shù)個體差異較大，中抗品種上的棉蚜產(chǎn)仔數(shù)差異較?。▓D1）。

圖1 棉蚜在各品種棉花上的平均產(chǎn)仔數(shù)Fig.1 The average number of offspring with A.gossypii on various cotton varieties

2.2 棉蚜在棉花葉片上的取食行為

2.2.1 棉蚜口針在韌皮部之外的刺探行為 9個棉花品種上的Np、C、Pd波和F波見表2。6 h內(nèi)棉蚜在高抗品種（遼5632-642、TYJ-98-6、錦454和中G5）上的Np波總時間與總次數(shù)最多，中抗品種（中棉所49、中棉79和雷克斯（光葉））上的次之，中抗品種非洲棉E-40和高感品種遼棉6號上的最少，差異均達顯著水平（P＜0.05）。

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C波總時間與總次數(shù)在中抗品種非洲棉E-40和高感品種遼棉6號，尤其是遼棉6號上的最多，其他3個中抗品種上的次之，4個高抗品種上的最少，且3組之間差異顯著（P＜0.05）。高感品種遼棉6號上的C波平均時間最長，達到每次0.57 min。

4個高抗品種與中抗品種雷克斯（光葉）上的Pd波總時間與總次數(shù)最多，均達到30 min和300次以上；中抗品種中棉所49與中棉所79上的次之；中抗品種非洲棉E-40和高感品種遼棉6號，尤其是遼棉6號上的最少。中抗品種非洲棉E-40上的Pd波平均持續(xù)時間最長，高抗品種TYJ-98-6上的次之，其他品種上的時間最短且差異不顯著（P＞0.05）。

在高抗品種錦454上的F波（＞10 s）總時間、F波（＞10 s）總次數(shù)和F波（＞10 s）平均持續(xù)時間均最多，且與其他品種差異極顯著（P＜0.01）；高感品種遼棉6號上的則最少。各品種間存在F波（＞10 s）的個體比例，在4個高抗品種與3個中抗品種（中棉所49、中棉79和雷克斯（光葉））多，但差異不顯著；在中抗品種非洲棉E-40和高感品種遼棉6號中少，且均低于30%。兩類之間差異極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 棉蚜口針在韌皮部取食的刺探行為 E1波的長短反映植物韌皮部對蚜蟲取食的抗性程度的高低，E1波長，植物抗性水平高。由表3可見，在4個高抗品種上，第1次E1波出現(xiàn)時間顯著晚于其他品種，而在高感品種遼棉6號上最早出現(xiàn)E1波形。4個高抗品種上第1次E1波持續(xù)時間最長，E1波總時間最長且總次數(shù)最多；3個中抗品種（中棉所49、中棉79和雷克斯（光葉））上的次之；中抗品種非洲棉E-40和高感品種遼棉6號上的最少。4個高抗品種上E1波平均持續(xù)時間＜3個中抗品種（中棉所49、中棉79和雷克斯（光葉）＜中抗品種非洲棉E-40和高感品種遼棉6號，且差異顯著（P＜0.05）。

E2波出現(xiàn)的早晚及持續(xù)時間說明昆蟲對植物韌皮部汁液的喜好程度。在高感品種遼棉6號上最早出現(xiàn)E2波形，4個高抗品種上最晚出現(xiàn)E2波（表3）。高感品種遼棉6號上的第1次E2波持續(xù)時間最長，中抗品種非洲棉E-40次之，其他品種上的時間最短，但差異不顯著（P＞0.05）。E2波出現(xiàn)的總時間、總次數(shù)在4個高抗品種上顯著低于其他品種，但E2波平均持續(xù)時間較長。4個高抗品種上的E波總時間和E2波占整個E波的比例，顯著低于其他品種。

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2.2.3 棉蚜在棉花上取食的EPG參數(shù)主成分分析 對28個EPG參數(shù)做了主成分分析（圖2）。所有指標來分類品種，只能涵蓋78%的品種數(shù)（圖2A）。所以，我們根據(jù)各個成分的貢獻度和變異系數(shù)，得到Np波總次數(shù)、E1波總次數(shù)、第1次刺探出現(xiàn)時間、第1次E1波持續(xù)時間和第1次E2波出現(xiàn)時間5個主要參數(shù)，再次對品種進行了分類，結(jié)果可以涵蓋94%的品種數(shù)（圖2B），同時這5個EPG參數(shù)在4個高抗品種、3個中抗品種（中棉所49、中棉79和雷克斯（光葉））和高感品種間均差異顯著（P＜0.05），這說明我們選擇的主要參數(shù)是可行的，Np波總次數(shù)、E1波總次數(shù)、第1次刺探出現(xiàn)時間等5個EPG參數(shù)，是用來品種分類的重要指標。

圖2 棉蚜在9個棉花品種上取食的EPG參數(shù)主成分分析Fig.2 Principal component analysis of EPG parameters of A.gossypii feeding on 9 cotton varieties

2.3 主要EPG參數(shù)與棉蚜存活率、平均產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性分析

對主要EPG參數(shù)與棉蚜存活率、平均產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性分析（表4），發(fā)現(xiàn)5個主成分EPG參數(shù)Np波總次數(shù)、E1波總次數(shù)、第1次刺探出現(xiàn)時間、第1次E1波持續(xù)時間和第1次E2波出現(xiàn)時間和棉蚜的存活率、平均產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)（P＜0.05），甚至Np波總次數(shù)、第1次E1波持續(xù)時間和第1次E2波出現(xiàn)時間這3個參數(shù)與棉蚜的存活率、平均產(chǎn)仔數(shù)均達到極其顯著相關(guān)的程度（P＜0.01）。所以我們可以確定這5個EPG參數(shù)是室內(nèi)棉花抗蚜等級鑒定的重要指標。

表4 主要EPG參數(shù)與棉蚜存活率、平均產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)程度（P值）Table 4 Correlation between main EPG parameters and survival rate and average litter size of A.gossypii (P)

3 討論

目前，對棉花抗蚜等級的鑒定主要是靠田間試驗與蟲情調(diào)查，田間抗蚜性的研究較多[21]，而在室內(nèi)和苗期鑒定棉花種質(zhì)材料抗蚜特征的報道較少。本文通過研究室內(nèi)不同抗性等級棉花上棉蚜的生長發(fā)育，初步明確了不同抗蚜棉花材料上棉蚜的生長發(fā)育存在差異。研究結(jié)果表明，棉蚜在高抗、中抗和高感3組品種間的生存發(fā)育情況存在明顯差異。棉蚜在高抗品種上的存活率普遍較低，中抗品種上的次之，高感品種上的棉蚜存活率最高。高抗品種上的棉蚜凈增殖率、內(nèi)稟增長率和平均產(chǎn)仔數(shù)均較低，而中抗品種和高感品種上的數(shù)據(jù)差異不顯著。平均世代時間在各個品種間無顯著差異。該結(jié)論與薛麗等[22]、馬超等[23]、李海強等[24]在棉蚜生命表構(gòu)建上的研究結(jié)果基本一致。

植食性刺吸式口器昆蟲在植物表面刺探或取食時，其口針可以探測到包括植物表面和組織內(nèi)部的物理和化學(xué)信息，從而產(chǎn)生不同的取食行為。EPG技術(shù)作為一種研究刺吸式口器昆蟲攝食行為的電生理技術(shù)，其應(yīng)用之一就是可以通過比較昆蟲在不同作物品種上的刺探過程，判斷植物是否含有抗蟲特征[13]。與田間調(diào)查鑒定抗蟲等級相比，EPG技術(shù)具有周期短、簡捷方便、受干擾小等特點[5]。在室內(nèi)可控的條件下，選擇合適的EPG參數(shù)，對植物的抗蟲級別進行劃分，快速篩選抗性植物已經(jīng)是植物抗性研究方面的熱點[13]。選擇具有代表性的EPG參數(shù)為指標，對大批量的植物材料進行歸類，可以大致判斷其抗性強弱。本文研究了棉蚜在不同品種棉花葉片上的取食行為，分析了EPG各參數(shù)在不同等級棉花材料上的差異。

結(jié)果表明，在高感品種遼5632-642、TYJ-98-6、錦454和中G5中，棉蚜在葉片上經(jīng)常長時間的爬行或停息，首次嘗試刺探意愿低，多次刺探且持續(xù)刺探時間長，口針經(jīng)常出現(xiàn)回撤與頻繁穿刺現(xiàn)象；魯卓越等[25]在蚜蟲取食過程中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象；表明這4個品種的葉肉組織不是棉蚜的適宜取食位點。盡管棉蚜在其韌皮部每次吸食的時間較長，但由于某種原因仍不能停留此部位連續(xù)取食；這種現(xiàn)象與趙曼等[26]在 2015年對玉米蚜的取食行為研究中的結(jié)果基本一致；這表明葉肉組織和韌皮部均可能存在抗蚜因子。棉蚜低頻率短時間的取食葉片汁液，口針在葉片表面遇到較強的機械阻力，這可能與棉花葉片存在茸毛，細胞壁厚等對口針起到了機械障礙作用有關(guān)；郭建國等[27]在蚜蟲取食不同抗性表型燕麥上的取食行為的研究中做了類似的描述；這說明抗蚜因子也可能存在于葉片表面。棉蚜口針較晚到達葉片韌皮部且分泌唾液，在韌皮部被動吸食時間短，口針活動的時間長、次數(shù)多，表明棉蚜在這4個品種上需要多量、多次分泌唾液才能保證其順利吸食；這與郭建國等[27]的研究中的結(jié)果相一致；這些現(xiàn)象說明這4個品種對棉蚜的抗性水平相對較高。在中抗品種中棉所49、中棉所79和雷克斯（光葉）中，棉蚜在葉片上低頻率較長時間的爬行或停息，口針在葉片表面遇到較弱的機械阻力，這3種品種均為光葉無茸毛材料，這證明茸毛少甚至無茸毛的材料更利于蚜蟲的滋生；這與劉旭明等[14]、蘆屹等[15,16]、李進步等[17]、呂麗敏等[18]在田間鑒定棉花種質(zhì)材料的抗蚜等級的結(jié)果相一致。在中抗品種非洲E-40和高感品種遼棉6號中，棉蚜在葉片上幾乎沒有爬行或停息的階段，接觸棉花葉片后即產(chǎn)生刺探意愿，刺探次數(shù)少且?guī)缀醪粫掷m(xù)刺探，口針在同一部位停留時間長，很少出現(xiàn)回撤與頻繁穿刺的現(xiàn)象。同時高頻率長時間的取食葉片汁液，這表明棉蚜喜歡吸食這2個品種的葉肉細胞汁液。棉蚜口針在葉片表面幾乎沒有遇到機械阻力，這表明這2個品種的抗蚜因子很小程度上位于葉片表面。棉蚜口針順利的到達其葉片韌皮部，低頻率的分泌唾液，被動吸食時間長，這表明這2種棉花品種韌皮部幾乎沒有抗蚜因子的存在。這些現(xiàn)象說明這2個品種對棉蚜的抗性水平相對較低。趙曼等[26]在對玉米蚜取食行為研究中也得出了類似的結(jié)論。而棉蚜在中抗品種非洲 E-40上的取食行為變化介于其他中抗品種與高感品種之間，這個結(jié)果的產(chǎn)生可能與棉花種質(zhì)材料本身對EPG技術(shù)的適合度、種質(zhì)材料的變異、試驗環(huán)境各異等因素有關(guān)。

通過對9種棉花材料上棉蚜EPG參數(shù)與棉蚜存活率、平均產(chǎn)仔數(shù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，5個主成分EPG參數(shù)Np波總次數(shù)、E1波總次數(shù)、第1次刺探出現(xiàn)時間、第1次E1波持續(xù)時間和第1次E2波出現(xiàn)時間和棉蚜的存活率、平均產(chǎn)仔數(shù)均達到顯著相關(guān)的程度，這5個EPG參數(shù)與棉蚜生理學(xué)特征相一致。

利用刺吸電位儀記錄并進而比較、分析了棉蚜在9個田間抗蚜水平表現(xiàn)不同的棉花品種上的刺探、取食行為，結(jié)果顯示在室內(nèi)鑒定的棉花抗蚜等級與在田間鑒定的抗蚜等級相一致。同時結(jié)合棉蚜在棉花葉片上的存活率、平均產(chǎn)仔數(shù)，篩選出5個主要的EPG參數(shù)，可作為棉花對蚜蟲抗性的評價指標，探索了抗蚜指標建立的思路，對室內(nèi)棉花抗蚜等級鑒定方法進行初步定性。