數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因植物檢測中的應(yīng)用

游英華，趙 志，李亞楠，宋治國，常洪雷

（1.普勒萊孚（河南）生物科技有限公司，鄭州 450008；2.普勒萊孚（河北）生物科技有限公司，石家莊 050221；3.普勒萊孚生物科技有限公司，北京 100081）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用基因工程手段將外源基因?qū)肷矬w基因組并使之表現(xiàn)出預期性狀的技術(shù)，該技術(shù)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)后，培育了許多具有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因植物。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以幫助我們獲得抗病蟲、耐除草劑、抗非生物脅迫、品質(zhì)改良等轉(zhuǎn)基因植物[1]。幾千年來，植物一直被用來預防和治療疾病，在大多數(shù)情況下，植物藥來源于野生或栽培植物，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)一些具有治療性和診斷性的重組蛋白和疫苗可以在植物中生產(chǎn)，并且與基于微生物或者哺乳動物細胞的傳統(tǒng)生產(chǎn)系統(tǒng)相比，植物具有許多優(yōu)勢，特別是在經(jīng)濟性、生產(chǎn)規(guī)模、安全性和實用性等方面[2]。近些年觀賞植物市場競爭激烈，許多商家為了引入商業(yè)利益，將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于觀賞植物的基因改造，例如，改良花的解剖和形態(tài)，開發(fā)生成新的花顏色，誘導早花，增強香味或壽命等[3]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因生物的日益普及，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進入市場的種類和數(shù)量越來越多，人們在生活中擁有了更多的選擇，轉(zhuǎn)基因生物也面臨著越來越多的監(jiān)管和壓力[4]。我國作為農(nóng)業(yè)大國，轉(zhuǎn)基因植物的安全問題一直是我們重點關(guān)注的問題。轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)量高，富含更豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，轉(zhuǎn)基因作物自商業(yè)化以來，種植面積逐年增長[5]。為保護消費者的知情權(quán)，我國頒布實施了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標識制度。為了保障轉(zhuǎn)基因標識制度的順利實施，建立精確有效的檢測方法尤為重要。由于需要對產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因含量進行精確定量，因此對于檢測方法定量的準確性提出了很高的要求。外源基因?qū)胫参锛毎?，整合到基因組的位置和拷貝數(shù)是影響目的基因表達和遺傳的關(guān)鍵因素，也是需要重點檢測的指標。在過去的 20多年中，實時熒光定量PCR技術(shù)，因為其定量準確的特性，廣泛地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物檢測[6]。但由于實時熒光定量PCR技術(shù)，在定量時需要依賴標準物質(zhì)，這為轉(zhuǎn)基因檢測特別是新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測帶來一定困擾。數(shù)字PCR技術(shù)的興起，給基因檢測技術(shù)領(lǐng)域帶來了突破性進展，它以高靈敏度的核酸絕對定量方法在轉(zhuǎn)基因檢測中的基因檢測、拷貝數(shù)鑒定甚至標準物質(zhì)的制備和定值檢測等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的技術(shù)優(yōu)勢和應(yīng)用能力[7]。

1 數(shù)字PCR介紹

1.1 數(shù)字PCR原理

數(shù)字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）技術(shù)，是一種核酸高靈敏檢測和絕對定量的新方法。它將傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)體系進行了有限稀釋，把反應(yīng)體系微滴化，將一個復雜的幾十微升的反應(yīng)體系分割成上萬個微小的獨立反應(yīng)體系。在理想狀態(tài)下，核酸模板分散進入到獨立的微滴中，每個微滴中含有一個或零個分子的核酸模板和PCR反應(yīng)液。數(shù)字PCR應(yīng)用終點判讀法，進行大規(guī)模單拷貝PCR擴增，擴增完成后對所有微滴進行熒光信號的判讀和數(shù)據(jù)分析，通過泊松分布的原理計算初始樣品中靶標分子的濃度，可實現(xiàn)對核酸樣本真正意義上的數(shù)字化精確分析（圖1）。數(shù)字PCR由于其獨有的靈敏度、特異性和精確性，尤其在復雜基質(zhì)及痕量樣品檢測方面具有獨特優(yōu)勢，其為農(nóng)業(yè)方向研究的轉(zhuǎn)基因成分檢測、物種鑒定、病原微生物監(jiān)測等提供了全新的技術(shù)手段和思路[8]。

圖1 數(shù)字PCR原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the principle of digital PCR

1.2 數(shù)字PCR特點

數(shù)字PCR技術(shù)，被認為是第三代的PCR技術(shù)，在業(yè)內(nèi)被認為是繼熒光定量PCR以及測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）之后，目前基因檢測領(lǐng)域最為重大的創(chuàng)新之一[9]。相較于傳統(tǒng)分子檢測技術(shù)，數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中的優(yōu)勢在于：

（1）數(shù)字PCR技術(shù)可實現(xiàn)對靶標基因的精確的絕對定量，不依賴標準曲線定量，試驗中不需要必須加入標準品，比實時熒光定量更方便，這對轉(zhuǎn)基因檢測尤其是新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測非常友好。

（2）植物中常含有多糖，可以抑制PCR反應(yīng)，為了確保PCR檢測的準確性，有效去除PCR擴增抑制物至關(guān)重要，而數(shù)字PCR技術(shù)對抑制物具有極強的抗干擾能力，不受反應(yīng)擴增效率的影響，可用于復雜樣品的基因的準確定量檢測。

（3）數(shù)字PCR檢測靈敏度高，可低至單拷貝，重復性好，節(jié)省樣本，尤其適用于靶標分子表達豐度低或樣品比較珍貴的基因檢測。

2 數(shù)字PCR的應(yīng)用

2.1 定量檢測方面的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因含量檢測閾值的設(shè)置對轉(zhuǎn)基因植物的定量提出了更高標準的要求，一直以來不少學者利用數(shù)字PCR對其進行了定量分析與檢測。根據(jù)低純度樣本的檢測要求，通過數(shù)字PCR將轉(zhuǎn)基因大豆MON87705、MON87769、DP356043定量檢測限設(shè)置為0.5%，定性檢測限設(shè)置為0.05%[10]；轉(zhuǎn)基因水稻品系“Bt汕優(yōu)63”的定量檢測下限可達0.5%、定性檢出下限可達0.05%[11]；轉(zhuǎn)基因大豆MON89788定量限設(shè)定為0.1%[12]；轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034、MON810、MIR162定量限設(shè)定為0.1%[13]；轉(zhuǎn)基因大豆DAS-68416-4定量限設(shè)定為0.1%[14]。2017年發(fā)布到的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品數(shù)字PCR檢測方法標準規(guī)定的檢測低限為0.1%（質(zhì)量分數(shù)），上述的試驗定限大部分滿足其標準的規(guī)定。而Demeke等[15]對轉(zhuǎn)基因大豆DP305423和油菜OXY235的檢測中提出使用數(shù)字PCR甚至可以對低于0.01%的轉(zhuǎn)基因大豆和油菜樣本進行檢測，這個試驗結(jié)果的提出表明數(shù)字PCR可以擁有更低數(shù)量級的檢測下限。該觀點在劉津等[16]對轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系的檢測結(jié)果也有呈現(xiàn)，但于曉帆等[17]對轉(zhuǎn)基因大豆DAS-44406中的檢測結(jié)果卻顯示當樣本含量小于1%時雖然可以檢測到目的基因，但無法進行準確定量。這可能是由于試驗樣本、試驗方法以及操作上的不同引起的，這還需要更多試驗結(jié)果對其進行進一步驗證，當然試驗樣本之間在本質(zhì)上就存在不同，自然無法以同一個標準來對待所有的轉(zhuǎn)基因植物，但是研究結(jié)果可以為在其他轉(zhuǎn)基因植物的研究中提供進一步探究的理論依據(jù)。Cottenet等[4]使用數(shù)字PCR對轉(zhuǎn)基因含量的高、中、低三個程度上的多個轉(zhuǎn)基因玉米和大豆的檢測分析偏差均低于±25%，具有較好的精確度，證實了數(shù)字PCR不是指在低樣本含量水平下進行檢測，而是在一個合理的范圍內(nèi)，這個就需要根據(jù)實際的樣品情況進行分析摸索。利用數(shù)字 PCR平臺對轉(zhuǎn)基因玉米MON863品系[18]、轉(zhuǎn)基因水稻HSA/PlD[19]以及 KMD/PlD[20]檢測中均表明，與單重 PCR相比，雙重數(shù)字PCR 顯示出更高的檢測精度、方法穩(wěn)定性更好、靈敏度高、成本低廉，精準可靠?；陔p重數(shù)字PCR的優(yōu)勢，也有研究人員開始嘗試使用多重檢測方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的研究中。Dobnik等[21]通過對DAS1507、DAS59122 等12個轉(zhuǎn)基因玉米品系的多重定量檢測分析，完成了轉(zhuǎn)基因玉米通過數(shù)字PCR手段進行多重定量檢測的方法。Demeke等[22]使用雙重、三重、四重數(shù)字 PCR方法在0.1%、1%和5%的水平上同時檢測和定量轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因油菜，結(jié)果表明多重數(shù)字PCR相對于單重數(shù)字PCR而言有助于提高大豆轉(zhuǎn)基因檢測和量化效率。多重檢測在保證轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的精準性的同時，可降低檢測成本，是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的有力工具，保證了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性及溯源。

2.2 標準物質(zhì)制備與定值方面的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因植物檢測過程中所使用的標準物質(zhì)是其安全監(jiān)管、定性與定量檢測、檢測方法建立與標準化、質(zhì)量控制中必不可少的基礎(chǔ)，因此，標準物質(zhì)的選擇和相關(guān)定值就顯得尤為重要。關(guān)于標準物質(zhì)的定值之前主要依賴于熒光定量方法，由于是相對定量，無法對標準物質(zhì)進行準確賦值。數(shù)字PCR作為可以實現(xiàn)核酸絕對定量的一種技術(shù)，它的出現(xiàn)提供了可靠準確的測量方法，彌補了之前熒光定量方法無法準確量值的缺點。李俊等[23]和李夏瑩等[24]分別以轉(zhuǎn)基因大豆MON89788和MON87751的純合種子為原料制作標準物質(zhì)，9家實驗室聯(lián)合測定將標準物質(zhì)的量值定為1.00和1.0022，72次測定數(shù)據(jù)之間的標準差為0.0007和0.0107，該兩個試驗結(jié)果證實了數(shù)字PCR在標準物質(zhì)定值應(yīng)用上的準確性和精確性，表明數(shù)字PCR可以廣泛地應(yīng)用于標準物質(zhì)的定值。Zhai等[25]還以轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的雜合種子為原料制作標準物質(zhì)，由9家實驗室共同進行測定后定值為0.50。上述三種標準物質(zhì)均通過相關(guān)評委審核并獲得標準物質(zhì)證書，有效解決了轉(zhuǎn)基因大豆和玉米檢測和監(jiān)測過程中各實驗室之間結(jié)果無法統(tǒng)一比較的問題，也為其檢測和監(jiān)控提供了強有力的保障。單露英等[26]利用雙重數(shù)字PCR對轉(zhuǎn)基因玉米NK603雜合種子配置不同質(zhì)量分數(shù)的標準物質(zhì)，進行均勻性和穩(wěn)定性確認，從而判定其可用于標準物質(zhì)定性和定量檢測。上述標準物質(zhì)均由轉(zhuǎn)基因植物的種子研磨成粉末制成，除此之外，轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA和質(zhì)粒DNA也可以被制作為標準物質(zhì)，并且可以通過數(shù)字PCR進行定值。Li等[27]以轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號葉片為材料，提取其基因組DNA制成標準物質(zhì)，利用 KF6/PlD雙重數(shù)字 PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)該批基因組 DNA標準物質(zhì)與市場上的基因組DNA標準物質(zhì)相比具有更好的準確性，從而為轉(zhuǎn)基因水稻科6號的檢驗和監(jiān)測提供了方便易用的校準物質(zhì)。張秀杰[28]以轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻克螟稻為基礎(chǔ)材料提取其基因組DNA，以數(shù)字PCR方法對其進行定值，制備出克螟稻基因組DNA標準物質(zhì)，為轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻克螟稻的檢測和監(jiān)管提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。除此之外馬麗俠等[29]以玉米MON863中外源基因構(gòu)建質(zhì)粒制作標準物質(zhì)，雙重數(shù)字PCR鑒定顯示了該方法優(yōu)異的特異性和穩(wěn)定性，可以準確地對標準物質(zhì)進行定值。多種標準物質(zhì)的形式均可以利用數(shù)字PCR對其進行定值，為以后標準物質(zhì)的研發(fā)提供了更加廣闊的思路和渠道，也為轉(zhuǎn)基因植物的精確化檢測和監(jiān)管提供了有力的基礎(chǔ)工具。

2.3 拷貝數(shù)鑒定方面的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因作物中插入外源基因的拷貝數(shù)鑒定是轉(zhuǎn)基因生物安全評價中表達載體、目的基因整合情況、外源插入序列表達情況等分子特征的重要內(nèi)容。Corbisier等[30]最先利用數(shù)字PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810中外源基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，提出數(shù)字PCR儀用于轉(zhuǎn)基因相關(guān)DNA拷貝比率的測量的可行性和可靠性，為數(shù)字 PCR在轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)鑒定的應(yīng)用中奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。姜志軍等[31]對轉(zhuǎn)基因玉米中G23V-EPSPS外源基因的拷貝數(shù)分析、周圓等[32]對TC1507、MIR162、MIR604 轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測中以及劉二龍[33,34]在轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1和GTSB77中轉(zhuǎn)基因成分定量試驗中其檢測下限均為0.61拷貝/μL，這些試驗結(jié)果均表明數(shù)字 PCR在轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)的檢測方面較高的靈敏度和精確性。潘廣等[35]利用雙重數(shù)字PCR建立了針對轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21的檢測方法，通過對其中不同質(zhì)量百分含量標準物質(zhì)的外源和內(nèi)源基因拷貝數(shù)的測量，確立了兩者之間高度的相關(guān)性；李瑞環(huán)等[36]利用數(shù)字 PCR儀對轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆品種ZH10-6進行檢測的結(jié)果中也指出樣品拷貝數(shù)與反應(yīng)模板含量之間具有高度的正相關(guān)，這樣就可以通過拷貝數(shù)的結(jié)果反推檢測樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量，因為在轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品數(shù)字PCR標準的檢測方法中的檢測限也是以質(zhì)量分數(shù)的形式呈現(xiàn)的，更方便在數(shù)據(jù)統(tǒng)計的情況下進行呈現(xiàn)方式的統(tǒng)一。Sun等[37]使用數(shù)字PCR方法判斷ACT等位基因可作為Q208A和Q240A中功能基因的基因拷貝數(shù)變異和定量研究的合適內(nèi)源參考基因；Demeke等[38]利用數(shù)字 PCR檢測轉(zhuǎn)基因油菜的外源基因拷貝數(shù)的過程中也提出FatA(A)可作為首選的內(nèi)參基因，他們的篩查試驗為后續(xù)相關(guān)檢測提供了參考標準。Collier等[39]利用數(shù)字PCR技術(shù)對水稻、小麥、玉米、番茄、馬鈴薯和柑橘等品種進行轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)測定；王犇等[40]對轉(zhuǎn)基因玉米中檢測外源基因拷貝數(shù)以及王永等[41]鑒定轉(zhuǎn)基因水稻中插入目的基因的拷貝數(shù)的結(jié)果均顯示出與傳統(tǒng)定量Southern blot的一致性，其中Collier等[39]的研究中通過分析純合子和半合子的單拷貝轉(zhuǎn)基因植株，也證實了這些結(jié)果的準確性，但和傳統(tǒng)定量Southern blot相比較之下，數(shù)字PCR在操作簡便性、結(jié)果重復性和數(shù)據(jù)可靠性上更勝一籌，因此使用數(shù)字PCR對其拷貝數(shù)進行鑒定，避免了傳統(tǒng)試驗方法的繁雜操作，而且數(shù)字PCR在試驗流程上基本實現(xiàn)自動化操作，手動操作環(huán)節(jié)減少，在一定程度上避免了人為操作對試驗結(jié)果的影響。而趙新等[42]基于數(shù)字 PCR平臺對轉(zhuǎn)基因大豆“GE-J12”中的外源目的基因進行檢測，結(jié)果顯示外源目的基因G2-EPSPS的拷貝數(shù)值為0.99，GAT拷貝數(shù)為1.01，3′轉(zhuǎn)化體特異性序列的拷貝數(shù)值為1.00，表明外源基因在大豆基因組上為單拷貝插入，該植株為純合子，進一步表明可以利用數(shù)字PCR對轉(zhuǎn)基因植株的純合度進行分析，而在之前是以外源基因和內(nèi)參基因的CT差值進行轉(zhuǎn)基因植株純合度的判斷，并不能反映其真實情況。

3 結(jié)論與展望

轉(zhuǎn)基因植物的研究，是為了能夠?qū)⑻岣弋a(chǎn)量、擁有疾病和昆蟲抗性、更好適應(yīng)逆境環(huán)境、高營養(yǎng)品質(zhì)等優(yōu)良性狀基因轉(zhuǎn)入到目標植物體內(nèi)，獲得優(yōu)良性狀的植物并得以遺傳改良。傳統(tǒng)植物研究分為常規(guī)植物以及雜交植物，成功改良植物性狀需要極長的時間。無論是哪一種的研究，都是為了獲得高產(chǎn)糧食和擁有優(yōu)良基因的品種。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，研究表明轉(zhuǎn)基因植物的培育更準確、更直接、更高效[43]。轉(zhuǎn)基因植物培育過程中，對目的基因功能明確，能夠準確地對目標基因進行改造，也可同時轉(zhuǎn)入多個優(yōu)良基因，準確生成同時具有多抗性的新品種[44]。另外轉(zhuǎn)基因植物的培育，受物種限制影響較小，培育新品種擁有更多可能性。因此，將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)植物培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，能夠培育出更多優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗性新品種，可減少農(nóng)業(yè)中化肥和農(nóng)藥的使用，節(jié)約人力資源同時綠色環(huán)保、保護生態(tài)環(huán)境。同時，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展帶動了轉(zhuǎn)基因藥物在醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因盆栽、各種觀賞性植物的新品種漸漸進入市場，均表明轉(zhuǎn)基因技術(shù)正在各行各業(yè)迅猛發(fā)展，將給大家?guī)聿豢晒懒康纳鐣б鎇45,46]。

數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測中的廣泛應(yīng)用，表明該技術(shù)的優(yōu)勢已經(jīng)得到了充分的證明。數(shù)字PCR技術(shù)用于檢測轉(zhuǎn)基因成分已經(jīng)有了國家標準。與傳統(tǒng)熒光定量PCR檢測方法相比，在受體植物插入的外源基因檢測中，數(shù)字PCR對于含有抑制劑的復雜樣本擁有更低的敏感性，數(shù)字PCR在試驗中需要更少的樣本量，對于核酸含量少或者樣品極為珍貴的待測物十分友好，檢測靈敏度高、重復性好。數(shù)字PCR技術(shù)不需要標準物質(zhì)的加入，當新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品培育成功后，可以減少合成高純度的標準物質(zhì)的資金成本和時間成本，大大提高了檢測效率。傳統(tǒng)檢測方法中，經(jīng)過認證的標準物質(zhì)在轉(zhuǎn)基因植物檢測中的應(yīng)用是保證定量結(jié)果準確性和可追溯性的關(guān)鍵，基于數(shù)字PCR可以實現(xiàn)絕對定量的特點，近些年該技術(shù)在標準物質(zhì)制備與定值檢測方面發(fā)揮了重要作用[27]。當然，若外源基因轉(zhuǎn)入研究中，出現(xiàn)了意外不可控的新物種，無論是數(shù)字PCR技術(shù)還是傳統(tǒng)熒光定量PCR技術(shù)都是無法檢測的，這時NGS測序技術(shù)是最合適的研究方法[47]。因為PCR技術(shù)只能對已知目標基因的樣品進行定量檢測，全新物種無法得知它的序列，也就不能設(shè)計特異性引物等一系列后續(xù)操作，這也是這個方法的局限性。但實驗技術(shù)之間都是相互補充，相互印證的關(guān)系。近年來，數(shù)字PCR技術(shù)多重檢測轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用頻繁報道，表明多重檢測可以使轉(zhuǎn)基因生物檢測更方便、更具成本效益[21]。現(xiàn)階段，相較于常規(guī)檢測技術(shù)來說，數(shù)字 PCR具有更高的成本，這也是限制它發(fā)展的一個重要原因。但由于其擁有常規(guī)檢測技術(shù)不可替代的優(yōu)勢，且更準確、更實用方便的檢測方法必將是以后發(fā)展的趨勢，隨著技術(shù)平臺的優(yōu)化和成熟，數(shù)字 PCR技術(shù)將會對基因檢測領(lǐng)域產(chǎn)生深遠影響。因此數(shù)字PCR技術(shù)未來在轉(zhuǎn)基因植物檢測甚至各領(lǐng)域都是強有力的分子生物檢測工具。