不同籽粒顏色玉米自交系類胡蘿卜素含量分析

朱 航 崔方慶 盧傳禮 陳衛(wèi)衛(wèi) 李旭輝陸思奇 張湘博 趙 華 齊永文

（1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，434025，湖北荊州；2廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所，510316，廣東廣州；3仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，510100，廣東廣州；4廣州國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新中心，510520，廣東廣州）

玉米作為主要糧食作物之一，含有對人體有益的核黃素、多種微量元素和維生素A（VA）等化學(xué)物質(zhì)[1]。目前，自然界中已有750余種類胡蘿卜素被研究[2]。近年來，在玉米VA源物質(zhì)類胡蘿卜素的合成分子機制方面的研究取得了重要進展，鑒定了一些與類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵QTL位點。開展了lcyE、crtRB、PSY1和crtRB3等類胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因的多態(tài)性對玉米籽粒中類胡蘿卜素含量的影響，開發(fā)了功能位點的分子標記，為實施利用分子標記加快高VA品種的選育提供了重要的方法[3]。對玉米籽粒中類胡蘿卜素研究鑒定出葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素4種主要的類胡蘿卜素[4-5]。類胡蘿卜素最主要的分離方法有高效液相色譜法[6-8]、超高效液相色譜法[9]、分光光度法[10]、超臨界流體色譜法[11]、拉曼光譜法[12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等。類胡蘿卜素是一種對身體有益的健康天然食用色素，以黃色、橙色或紅色表現(xiàn)出來，不僅具有為食品添色的功效，還含有較高的保健價值[14]。因其具有抗氧化和抗衰老等特點，被視為一類抗氧化劑。類胡蘿卜素含有對人體有益的葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素等[15-16]，其中葉黃素和玉米黃質(zhì)對緩解癌癥和降低心血管疾病等方面具有較好的效果[17]。類胡蘿卜素對人體健康有十分重要的作用，可在食品和醫(yī)藥等行業(yè)大規(guī)模應(yīng)用[18-19]。

陳潔瓊等[20]對5種鮮食甜、糯玉米籽粒中類胡蘿卜素含量進行分析，發(fā)現(xiàn)不同種類玉米籽粒中的類胡蘿卜素含量差別較大，甜玉米籽粒（39.68mg/kg）比糯玉米（2.10～3.69mg/kg）高出十幾倍。章園等[21]對黃玉米不同時期籽粒類胡蘿卜素含量進行分析，發(fā)現(xiàn)玉米黃質(zhì)、葉黃素和β-隱黃質(zhì)含量水平隨著籽粒成熟度的提高總體呈上升態(tài)勢，β-胡蘿卜素含量無明顯變化。嚴華等[22]使用高效液相色譜分析法對沙棘中4種類胡蘿卜素進行檢測，發(fā)現(xiàn)不同品種沙棘中類胡蘿卜素含量具有較大差異。郭艷等[23]采用液相色譜法對甘藍不同顏色花的類胡蘿卜素含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和葉黃素等是導(dǎo)致花瓣顏色變化的主要原因。

本試驗用高效液相色譜技術(shù)測定不同籽粒顏色玉米自交系葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素4種類胡蘿卜素含量，探究玉米籽粒中類胡蘿卜素含量與籽粒顏色間的關(guān)系，為優(yōu)質(zhì)玉米品種培育提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

依據(jù)顏色等級挑選60個自交系組成的自然群體作為試驗材料（表1），所有材料均來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)賴錦盛教授實驗室[24]。試驗材料于2020年下半年種植于廣東省韶關(guān)市翁源縣（114°7′48″E，24°21′0″N）。

表1 60份供試材料Table 1 60 tested materials

1.2 儀器與設(shè)備

儀器為高效液相色譜儀、6530 Q-TOF精確質(zhì)量級四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（atmosphericpressure chemical ionization，APCI）、精宏水浴鍋、真空離心濃縮儀Eppendorf concentrator 5301和掃描儀（ImagescannerⅢ）。試驗用的葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和β-隱黃質(zhì)的標準品來自美國Sigma公司。甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）和甲醇均為色譜級，環(huán)己烷、乙醇、無水硫酸鈉和氫氧化鉀等均為分析純。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 玉米籽粒顏色鑒定 每個自交系挑選外觀一致的種子約30粒，使用EPSON EU-88掃描設(shè)備和EPSON Scan軟件進行圖像數(shù)據(jù)采集，獲得初始圖片進行提取和計算，得到60份材料籽粒顏色的R（紅色）、G（綠色）、B（藍色）和Gray（灰度）值數(shù)據(jù)。并將60份玉米自交系籽粒色澤分為4個等級（圖1），等級1為白色，等級2為黃色，等級3為橙黃色，等級4為紫黑色，以此為籽粒顏色的視覺分級表型數(shù)據(jù)。

圖1 玉米籽粒顏色分級Fig.1 The color grades of maize kernels

1.3.2 玉米中類胡蘿卜素的提取 成熟的玉米籽粒經(jīng)磨樣機粉碎研磨后，稱量3.0g置于50.0mL離心管中，加入乙醇30mL（含0.1%BHT），密封搖勻，85℃水浴加熱孵育20min，加入80%KOH 0.6mL溶液，水浴60min進行皂化后冰水冷卻，將皂化溶劑放入分液漏斗中，加入環(huán)己烷30.0mL和去離子水15.0mL振蕩搖勻，重復(fù)2次。加入無水硫酸鈉5.0g過濾，收集分液漏斗中上層溶液，減壓濃縮至干燥，用乙腈-甲醇（75:25，V/V）溶液溶解，將溶液過0.22μL有機系濾膜后進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定，整個前處理過程注意避光[25]。

1.3.3 高效液相色譜分析 色譜柱：YMC carotenoid（250×4.6mm，5μm）色譜柱；柱溫：30℃；檢測器波長為325和450nm；流動相：A為甲醇-MTBE-水（81:15:4，V/V），B為甲醇-MTBE-水（6:90:4，V/V），進樣20μL；線性梯度洗脫，流速為 1mL/min。洗脫程序：0～12.5min（100%B），12.5～25min（0%B）。DAD檢測器測定波長為450nm。

1.3.4 類胡蘿卜素組分定性定量分析 對于有標樣的部分加以比較，利用保留時間的統(tǒng)一性加以測定，并利用外標定量法建立回歸方程，對玉米類胡蘿卜素各組分含量作出量化分析（表2）。

表2 混合標準液濃度Table 2 Concentration of mixed standard solution mg/kg

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析及組間差異的Duncan's多重比較，采用SPSS分析變量間的Pearson相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性分析，用GraphPad Prism 5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米類胡蘿卜素含量統(tǒng)計的回歸方程

采用外標定量法進行試樣中各組分峰的定量。配制標準溶液樣品，按上述色譜要求計算標準試樣的相對峰面積，由相對峰面積-進樣量關(guān)系，按線性回歸方式得出其中4種主要類胡蘿卜素線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)值與線性范圍，結(jié)果見表3。試樣中各組分的含量使用的標準曲線數(shù)據(jù)，3次重復(fù)，取平均值。

表3 4種類胡蘿卜素的線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear range and correlation coefficients of the four carotenoid groups

2.2 不同自交系中類胡蘿卜素含量分布

60份玉米自交系籽粒類胡蘿卜素檢測（表4）表明，玉米籽粒中含有豐富的類胡蘿卜素，且變化范圍在1.49～119.31mg/kg。其中，總類胡蘿卜素含量占比最低的是自交系C1，僅有1.49mg/kg，最高的自交系為C47，可達119.31mg/kg，最高與最低含量之間相差近80倍。60份玉米自交系葉黃素平均含量為56.32mg/kg，其中C27含量最高，達99.98mg/kg，C1含量最低，為0.56mg/kg；玉米黃質(zhì)平均含量為0.85mg/kg，其中C35含量最高，達2.91mg/kg，C14含量最低，為0.02mg/kg；β-隱黃質(zhì)平均含量為1.31mg/kg，其中C27含量最高，達2.20mg/kg，C1含量最低，為0.94mg/kg；β-胡蘿卜素平均含量為5.75mg/kg，其中C52號含量最高，達26.61mg/kg，C19含量最低，為0.61mg/kg。

表4 玉米自交系的類胡蘿卜素含量統(tǒng)計分析Table 4 Statistical analysis of carotenoid content of maize inbred lines mg/kg

2.3 不同顏色等級籽粒中類胡蘿卜素的含量

圖2和表5表明，葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素含量在4個籽粒顏色等級中表現(xiàn)出顯著的遺傳多樣性，不同顏色等級間具有較大差別。

圖2 不同籽粒顏色等級中4種類胡蘿卜素含量Fig.2 Carotenoid content of four groups in different seed color grades

玉米自交系中的葉黃素平均含量遠大于玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素的平均含量，其在等級3的含量最高，為71.05mg/kg，依次是等級4和等級2，分別為54.76和50.53mg/kg，含量最低的是等級1，為1.69mg/kg。玉米黃質(zhì)中等級4的含量最高，為1.35 mg/kg，其次為等級3（1.31mg/kg）和等級2（0.37mg/kg），等級1未檢出。β-隱黃質(zhì)中等級1、等級2與等級3、等級4間有顯著差異（表5），等級4和等級3中β-隱黃質(zhì)含量較高，等級1和等級2含量較低，等級4（1.56mg/kg）中β-隱黃質(zhì)含量大約是等級1（0.94mg/kg）的1.7倍。另外玉米籽粒中β-胡蘿卜素含量較高的是等級4（10.89mg/kg），而在等級1中沒有檢測到β-胡蘿卜素（表4）。

表5 不同顏色等級中葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素的含量分析Table 5 Analysis of lutein,zeaxanthin,β-cryptoxanthin and β-carotene contents in different color grades mg/kg

2.4 R、G、B和Gray值與類胡蘿卜素含量的相關(guān)性分析

對60份玉米自交系中R、G、B、Gray值與類胡蘿卜素含量進行相關(guān)性分析，如表6所示，R、G、B、Gray值間和類胡蘿卜素之間均具有極顯著正相關(guān)性；R、G、B、Gray值與葉黃素、玉米黃素、β-隱黃質(zhì)、β-胡蘿卜素間具有極顯著負相關(guān)性，即類胡蘿卜素含量越高，紅度、綠度、藍度和灰度值越低。總體而言，R、G、B和Gray值之間，G與Gray值的正相關(guān)性最高，達0.992，其次是R值與Gray和G值，正相關(guān)性分別達到0.939和0.912，R與B值正相關(guān)性較低，為0.408；類胡蘿卜素含量之間，β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素相關(guān)性較高，達0.830，其次是玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)，達0.815，而葉黃素與β-胡蘿卜素關(guān)聯(lián)性較低，為0.343；葉黃素與B值負相關(guān)性較高，達-0.619，而葉黃素與R值負相關(guān)性則較低，為-0.593。

表6 R、G、B和Gray值與類胡蘿卜素含量間的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis between R,G,B,and Gray values and carotenoid content

2.5 玉米自交系類胡蘿卜素含量的聚類分析

根據(jù)類胡蘿卜素含量，采用系統(tǒng)聚類法，用歐式距離可變類平均法對60個品種進行聚類分析，60份玉米自交系按籽粒中類胡蘿卜素含量差異可分為5大類，其中編號C1～C8聚為一類；C9～C34、C36～C46、C48、C49、C52～54、C56、C58和C60聚為一類；C59單獨聚為一類；C50、C51和C57聚為一類；C35、C55和C47聚為一類。

在5個類群中，第5類的葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)含量都是最高的，屬于高VA的自交系，第1類葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素的含量都最低，β-隱黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)含量在5個類群中的平均值較低。第2類包含了多個自交系，屬于中富含類胡蘿卜素的自交系（表7）。

表7 不同類群間類胡蘿卜素含量的分析Table 7 Analysis between carotenoid contents among different groups

3 討論

篩選高含量類胡蘿卜素玉米是十分關(guān)鍵的，但這需要一種快速、準確、操作簡便的分析測定方法。與其他檢測方法相比，高效液相色譜法具有高效性、精確性和顯著性等優(yōu)勢，已成為化學(xué)分析中主要分離方法[26]。本試驗采用高效液相色譜法測定玉米類胡蘿卜素中的葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉米籽粒中類胡蘿卜素各組分間含量差異顯著，與Baseggio等[27]和周毅等[28]研究結(jié)果一致。Hwang等[29]采用紫外分光光度計法檢測白色和橙色玉米類胡蘿卜素含量，結(jié)果表明類胡蘿卜素的組成及其濃度是影響籽粒色澤的主要原因。Hu等[30]通過高效液相色譜法測定不同玉米籽粒顏色，結(jié)果表明，黃色、橙黃色和黑色玉米中有相對高含量的類胡蘿卜素，而白色玉米最低。類胡蘿卜素組成成分分析表明，葉黃素被確定是玉米中主要的類胡蘿卜素，并且紫黑色玉米類胡蘿卜素含量總體最高，這與Hu等[31]和O'Hare等[32]的研究結(jié)果類似。本試驗以60份玉米自交系為材料，運用高效液相色譜技術(shù)對各種玉米自交系的類胡蘿卜素組成成分進行分析測定，探究玉米籽粒顏色與類胡蘿卜素含量的關(guān)系，結(jié)果顯示，類胡蘿卜素含量占比最高的是葉黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)，其次是β-隱黃質(zhì)。同時發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素各組分間含量差異影響籽粒顏色。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜檢測法，對60份玉米自交系籽粒中類胡蘿卜素含量進行測定，結(jié)果顯示各自交系中葉黃素含量最高，是類胡蘿卜素的主要成分，其次是β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和β-隱黃質(zhì)。其中，4種類胡蘿卜素含量間均有顯著性差異，玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素含量隨著籽粒顏色等級的增加而增加，葉黃素含量呈先增加后降低的變化趨勢。籽粒中類胡蘿卜素含量與籽粒顏色相關(guān)指標相關(guān)性分析顯示，4種主要類胡蘿卜素含量與R、G、B、Gray值均呈極顯著負相關(guān)，而4種主要類胡蘿卜素組分間呈極顯著正相關(guān)，R、G、B和Gray值間也呈極顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，隨著顏色等級的增長，類胡蘿卜素含量也隨之增長，且在等級3時達最高，其次是等級4，因此籽粒顏色可用作判斷總類胡蘿卜素含量的依據(jù)，可為培育高富集營養(yǎng)玉米品種提供直觀有效的方法。