基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究腸炎寧顆粒治療功能性腹瀉和腹瀉型腸易激綜合征的作用機(jī)制

田文國(guó)，陳金鵬，王春芳，劉 毅，蓋曉紅，劉全國(guó)，田成旺，陳常青

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究腸炎寧顆粒治療功能性腹瀉和腹瀉型腸易激綜合征的作用機(jī)制

田文國(guó)1, 2，陳金鵬2, 3, 4，王春芳1, 2，劉 毅2, 3, 4，蓋曉紅2, 3, 4，劉全國(guó)5，田成旺2, 3, 4*，陳常青2, 3, 4*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617 2. 天津藥物研究院，天津 300462 3. 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462 4. 釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462 5. 海南葫蘆娃藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，海南 ?？?570216

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探究腸炎寧顆粒治療功能性腹瀉（functional diarrhea，F(xiàn)D）和腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea irritable bowel syndrome，IBS-D）的作用機(jī)制。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、文獻(xiàn)檢索腸炎寧顆粒5味藥材的成分；SwissADME平臺(tái)篩選腸炎寧顆?；钚猿煞?；SwissTargetPrediction平臺(tái)反向靶標(biāo)預(yù)測(cè)腸炎寧顆粒活性成分作用靶點(diǎn)；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)FD和IBS-D靶點(diǎn)；Venny 2.1.0獲取腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的交集靶點(diǎn)；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)后導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件獲取核心靶點(diǎn)；OmicsBean數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”及“關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)；Schr?dinger-Maestro對(duì)關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。從腸炎寧顆粒中篩選得到治療FD和IBS-D的活性成分30個(gè)，其中10個(gè)關(guān)鍵活性成分為甲基異茜草素、槲皮素、4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸、焦性沒(méi)食子酸、金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素；24個(gè)核心靶點(diǎn)為蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9等。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)其主要涉及內(nèi)分泌抵抗、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路、前列腺癌等通路。分子對(duì)接表明關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)均可自發(fā)結(jié)合。腸炎寧顆?？赡芡ㄟ^(guò)多成分、多靶點(diǎn)和多通路，降低內(nèi)臟敏感、減少炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸道菌群，從而治療FD和IBS-D。

腸炎寧顆粒；功能性腹瀉；腹瀉型腸易激綜合征；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；甲基異茜草素；槲皮素；4′,5-二羥基黃酮；山柰酚；鞣花酸；焦性沒(méi)食子酸；金圣草黃素；咖啡酸；木犀草素；芹菜素

功能性腹瀉（functional diarrhea，F(xiàn)D）是臨床上消化系統(tǒng)常見(jiàn)的一種疾病，以持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作性水樣便或松散便，腹痛或腹脹癥狀不明顯，排便次數(shù)增多為主要臨床特征[1]。腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea irritable bowel syndrome，IBS-D）作為腸易激綜合征的1個(gè)亞型，是一種表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛并伴隨腹瀉的疾病[2]。FD和IBS-D的發(fā)生都不具有典型的胃腸道器質(zhì)性病變，一般FD患者以腹瀉為主而腹痛為次，IBS-D患者以腹痛為主而腹瀉輕微[3]。FD與IBS-D具有病情復(fù)雜、病程較長(zhǎng)、遷延難愈的特點(diǎn)，長(zhǎng)期患病對(duì)患者生活、工作造成了極大影響，且兩者在病情發(fā)展的過(guò)程中可相互轉(zhuǎn)化[4]。目前臨床治療FD與IBS-D主要以止瀉、止痛為主，但療效欠佳，且不良反應(yīng)多，無(wú)法長(zhǎng)期使用，因此亟需療效確切的治療藥物。

中藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，其臨床療效顯著。腸炎寧顆粒為現(xiàn)代中藥制劑，主要由金毛耳草、地錦草、樟樹(shù)根、楓樹(shù)葉、香薷組成，其中金毛耳草為君藥，性平味苦，具有清熱祛濕、止瀉的功效；地錦草與楓樹(shù)葉均為臣藥，可增強(qiáng)君藥的功效，并能起到清熱解毒、利濕止瀉的作用；樟樹(shù)根具有祛風(fēng)止痛的功效；香薷具有祛濕和中的功效，諸藥合用便可起到清熱利濕、行氣的功效[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[6]，上述5味中藥中含有多種有效成分，包括黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷、鞣質(zhì)類(lèi)等，這些成分具有抗菌、抗炎、止血、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用。但目前關(guān)于腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的作用機(jī)制尚不明確，相關(guān)研究亦不多見(jiàn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一概念由英國(guó)Hopkins教授于2007年提出[7]，近些年已成為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究的熱門(mén)工具[8-10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可基于系統(tǒng)生物學(xué)理論研究藥物，從多成分、多靶點(diǎn)、多通路探究藥物的作用機(jī)制，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不同層次的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，建立“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)模型，在揭示中藥復(fù)方的復(fù)雜作用機(jī)制方面起著重要作用，可全面研究復(fù)雜藥物對(duì)疾病的影響和干預(yù)。因此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步探討腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的作用機(jī)制，以期為腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腸炎寧顆粒中藥材成分庫(kù)的建立

腸炎寧顆粒由金毛耳草、地錦草、樟樹(shù)根、楓香樹(shù)葉、香薷5味中藥組成。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[11]篩選地錦草、香薷2味中藥的成分，對(duì)于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄的金毛耳草、樟樹(shù)根及楓香樹(shù)葉通過(guò)相關(guān)參考文獻(xiàn)，查找其所含成分。

1.2 腸炎寧顆粒活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過(guò)Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)[12]檢索腸炎寧中藥成分的Canonical SMILES結(jié)構(gòu)，將中藥成分的Canonical SMILES結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissADME平臺(tái)（http://www.swissadme.ch/）[13]進(jìn)行口服生物利用度及類(lèi)藥性分析。將Pharmacokinetics項(xiàng)下GI absorption滿(mǎn)足High，同時(shí)Druglikeness項(xiàng)下Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge滿(mǎn)足2個(gè)Yes以上的成分作為候選活性成分，將候選活性成分的Canonical SMILES結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺(tái)（http://www. swisstargetprediction.ch/）[14]，選擇物種為“Homo sapiens”，條件設(shè)為“Probability＞0.3”，進(jìn)行腸炎寧顆粒候選活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.3 FD和IBS-D疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在GeneCards（https://www.genecards.org/）[15]數(shù)據(jù)庫(kù)中以“diarrhea irritable bowel syndrome”和“functional diarrhea”為關(guān)鍵詞檢索疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，取Relevance score＞4作為FD和IBS-D候選疾病靶點(diǎn)。

1.4 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的FD和IBS-D靶點(diǎn)與腸炎寧顆粒候選靶點(diǎn)在Venny 2.1.0（https:// bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）[16]中生成韋恩圖，映射篩選出共同靶點(diǎn)。根據(jù)“腸炎寧顆粒5味中藥材”“腸炎寧顆?；钚猿煞帧币约啊澳c炎寧顆?；钚猿煞种委烣D和IBS-D的作用靶點(diǎn)”，在Excel表格中建立“藥材-活性成分”“活性成分-靶點(diǎn)”的相互對(duì)應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中構(gòu)建腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

為探究腸炎寧顆粒相關(guān)靶點(diǎn)與FD和IBS-D的相互作用，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn. stringdb.org/cgi/input?sessionId=bgKEhiAlcSw4& input_ page_show_search=on）[17]，物種設(shè)置為“Homo Sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)定置信度為0.9，隱藏游離靶標(biāo)，下載TSV格式文件并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用“Network Analyze”進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度值＞中位數(shù)篩選核心靶點(diǎn)。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

運(yùn)用Omicsbean平臺(tái)（http://www.omicsbean. cn/）[18]對(duì)腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能以及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF），篩選GO功能富集分析前10項(xiàng)結(jié)果制成柱狀圖進(jìn)行可視化；篩選KEGG通路富集分析前10條通路制成氣泡圖進(jìn)行可視化。

1.7 腸炎寧顆?！瓣P(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵活性成分以及核心靶點(diǎn)做KEGG富集通路預(yù)測(cè)結(jié)果，在Excel表格中建立“關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)”和“核心靶點(diǎn)-通路”的相互對(duì)應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中構(gòu)建腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的“關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.8 分子對(duì)接

關(guān)鍵活性成分作為小分子配體，通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)搜索關(guān)鍵活性成分CAS號(hào)，從Chem3D19.0中導(dǎo)出，對(duì)其執(zhí)行能量最低計(jì)算保存為mol2格式。核心靶點(diǎn)作為受體，從Protein Data Bank（PBD）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）[19]下載核心靶點(diǎn)蛋白的PDB格式三維結(jié)構(gòu)（核心靶點(diǎn)蛋白遵循：人源蛋白，分辨率及優(yōu)先選擇具有原始配體）。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Schr?dinger2020Maestro12.4軟件對(duì)核心靶點(diǎn)蛋白去水與關(guān)鍵活性成分做分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 腸炎寧顆粒中藥材活性成分

如表1所示，共篩選得到腸炎寧顆粒在SwissTargetPrediction平臺(tái)有作用靶點(diǎn)的活性成分88個(gè)，金毛耳草5個(gè)、地錦草10個(gè)、樟樹(shù)根6個(gè)、楓香樹(shù)葉13個(gè)、香薷60個(gè)。其中金毛耳草、香薷含有共有活性成分1個(gè)，為槲皮素；地錦草、楓香樹(shù)葉含有共有活性成分1個(gè)，為山柰酚；地錦草、香薷含有共有活性成分2個(gè)，為亞麻子油酸及軟脂酸；樟樹(shù)根、香薷含有共有活性成分2個(gè)，為桉葉油醇及黃樟素。

表1 腸炎寧顆粒中活性成分

續(xù)表1

2.2 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D作用靶點(diǎn)篩選

通過(guò)將腸炎寧顆?；钚猿煞諧anonical SMILES結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺(tái)，選擇物種為“Homo sapiens”，條件設(shè)為“Probability＞0.3”，預(yù)測(cè)得到了不重復(fù)的靶點(diǎn)共計(jì)171個(gè)。通過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)以“functional diarrhea”為關(guān)鍵詞搜索到Relevance score＞4的相關(guān)靶點(diǎn)2007個(gè)，以“diarrhea irritable bowel syndrome”為關(guān)鍵詞搜索到Relevance score＞4的相關(guān)靶點(diǎn)1970個(gè)，將在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的FD和IBS-D靶點(diǎn)與腸炎寧顆粒全方候選靶點(diǎn)在Venny 2.1.0中生成韋恩圖，映射篩選出77個(gè)共有靶點(diǎn)，作為腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D靶點(diǎn)的Venn圖

2.3 腸炎寧顆?！八幉?活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.9.1軟件處理得到“藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2，運(yùn)用“Network Analyze”進(jìn)行拓?fù)浞治?，該網(wǎng)絡(luò)有112個(gè)節(jié)點(diǎn)、282條邊，各節(jié)點(diǎn)表示藥材、成分、靶點(diǎn)，各節(jié)點(diǎn)間的邊代表“藥材-成分”“成分-靶點(diǎn)”之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)中平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為5.212，網(wǎng)絡(luò)密度0.051，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.504，網(wǎng)絡(luò)中心度0.424。表明腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D是基于多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜協(xié)同作用。

2.4 藥物與疾病靶點(diǎn)交集PPI分析

將腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的77個(gè)作用靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，設(shè)定置信度為0.9，隱藏游離靶標(biāo)，下載TSV格式文件并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖3。運(yùn)用“Network Analyze”進(jìn)行拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)此網(wǎng)絡(luò)中共有55個(gè)節(jié)點(diǎn)，130條邊，節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，每條邊則代表靶點(diǎn)互作關(guān)系，節(jié)點(diǎn)的大小與顏色代表靶點(diǎn)的度值，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，表明作用越關(guān)鍵。以節(jié)點(diǎn)連接度值＞中位數(shù)為核心靶點(diǎn)，經(jīng)計(jì)算度值中位數(shù)為4，其中原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase，SRC）、磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、雌激素受體1（estrogen receptor，ESR1）、酪氨酸激酶Fyn（tyrosine kinase Fyn，F(xiàn)YN）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、蛋白酪氨酸激酶2（protein tyrosine kinase 2，PTK2）、糖原合成酶激酶3B（glycogen synthase kinase 3B，GSK3B）、細(xì)胞周期蛋白A2（cyclin A2，CCNA2）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、CDK4、CDK6、CCND1、極光激酶A（aurora kinase A，AURKA）、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFRB）、CDK2、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase，PIK3CG）、拓?fù)洚悩?gòu)酶2α（topoisomerase 2α，TOP2A）、erb-b2受體酪氨酸激酶2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9、激酶插入域受體（kinase insert domain receptor，KDR）、脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）24個(gè)核心靶點(diǎn)的度值中位數(shù)值大于4。

圖3 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能富集分析

利用OmicsBean分析平臺(tái)對(duì)24個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋分析，共得BP 285個(gè)條目（＜0.05），CC 270個(gè)條目（＜0.05），MF 225個(gè)條目（＜0.05），按值排序，選取排名前10的項(xiàng)目進(jìn)行可視化展示，繪制GO功能注釋分析柱狀圖，見(jiàn)圖4。其中，BP主要涉及大分子代謝過(guò)程的正調(diào)控、對(duì)含氧化合物的反應(yīng)等；CC主要涉及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞核等；MF主要涉及激酶活性、作用于蛋白質(zhì)的催化活性等。

圖4 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心靶點(diǎn)GO功能富集分析(前10)

2.6 KEGG通路富集分析

利用OmicsBean分析平臺(tái)對(duì)24個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得105條信號(hào)通路（＜0.05），選取排名前10的通路進(jìn)行可視化處理，繪制KEGG信號(hào)通路氣泡圖，見(jiàn)圖5。其中rich factor表示相關(guān)基因中位于該通路的基因數(shù)目與所有注釋基因中位于該通路的基因總數(shù)的比值，該值越大代表富集程度越高。分析富集的通路發(fā)現(xiàn)，主要有內(nèi)分泌抵抗通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路等。

2.7 腸炎寧顆粒“關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)24個(gè)核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)出具有治療FD和IBS-D的腸炎寧顆粒關(guān)鍵活性成分有10個(gè)，其中金毛耳草2個(gè)，為甲基異茜草素、槲皮素；地錦草3個(gè)，為4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸；楓香樹(shù)葉2個(gè)，為焦性沒(méi)食子酸、山柰酚；香薷5個(gè)，為金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素、槲皮素。金毛耳草和香薷含有共有成分1個(gè)，為槲皮素；地錦草和楓香樹(shù)葉含有共有成分1個(gè)，為山柰酚。利用Cytoscape 3.9.1軟件得到腸炎寧顆粒24個(gè)核心靶點(diǎn)的“關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖6。運(yùn)用“Network Analyze”進(jìn)行拓?fù)浞治?，該網(wǎng)絡(luò)有139個(gè)節(jié)點(diǎn)、576邊，網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵活性成分、核心靶點(diǎn)、信號(hào)通路，各節(jié)點(diǎn)間邊表示“關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)”“核心靶點(diǎn)-通路的相互作用”，網(wǎng)絡(luò)中平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為8.259，網(wǎng)絡(luò)密度為0.060，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.437，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.579，網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示存在1個(gè)分子與多個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白的相互作用，也存在不同分子作用于同1個(gè)靶點(diǎn)蛋白的現(xiàn)象，同時(shí)也顯示了1個(gè)核心靶點(diǎn)可對(duì)應(yīng)多條信號(hào)通路，表明腸炎寧顆?？赡芡ㄟ^(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療FD與IBS-D，初步闡釋了腸炎寧顆粒治療FD與IBS-D的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

圖5 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析(前10)

圖6 “關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)

2.8 分子對(duì)接結(jié)果

利用Schr?dinger2020Maestro12.4軟件將10個(gè)關(guān)鍵活性成分（甲基異茜草素、槲皮素、4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸、焦性沒(méi)食子酸、金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素）與PPI網(wǎng)絡(luò)圖中24個(gè)核心蛋白（SRC、PIK3R1、ESR1、FYN、AKT1、CDK1、PTK2、GSK3B、CCNA2、EGFR、CDK4、CDK6、CCND1、AURKA、PDGFRB、CDK2、APP、PIK3CG、TOP2A、ERBB2、MMP2、MMP9、KDR、SYK）進(jìn)行分子對(duì)接。配體和受體結(jié)合能越低，結(jié)合越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大，一般認(rèn)為，結(jié)合能小于0表示兩者間可以自發(fā)結(jié)合，小于?20.93 kJ/mol說(shuō)明有較好的結(jié)合活性，小于?29.30 kJ/mol表示有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[20]。如表2所示，10個(gè)關(guān)鍵活性成分和24個(gè)核心蛋白均可以自發(fā)結(jié)合。其中木犀草素與16個(gè)核心靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，甲基異茜草素與15個(gè)核心靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，槲皮素與15個(gè)核心靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，鞣花酸與15個(gè)核心靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，芹菜素與14個(gè)核心靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，山柰酚與14個(gè)核心靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，4′,5-二羥基黃酮與13個(gè)核心靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，咖啡酸與6個(gè)核心靶點(diǎn)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。選取10個(gè)關(guān)鍵活性成分與各自對(duì)應(yīng)打分最高的核心蛋白可視化，其結(jié)合模式見(jiàn)圖7。甲基異茜草素與CDK4通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基VAL A:83結(jié)合，通過(guò)疏水鍵與PHE A:80結(jié)合，結(jié)合能為?40.17 kJ/mol；槲皮素與KDR通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基CYS A:919、GLU A:917、ASP A:1046結(jié)合，結(jié)合能為?44.77 kJ/mol；4′,5-二羥基黃酮與KDR通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基APS A:1046結(jié)合，通過(guò)疏水鍵與PHE A:1047結(jié)合，結(jié)合能為?41.00 kJ/mol；山柰酚與KDR通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基CYS A:919、GLU A:917、ASP A:1046結(jié)合，通過(guò)疏水鍵與PHE A:1047結(jié)合，結(jié)合能為?46.02 kJ/mol；鞣花酸與CDK4通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基VAL A:83結(jié)合，結(jié)合能為?39.33 kJ/mol；焦性沒(méi)食子酸與CDK2通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基LEU A:83結(jié)合，結(jié)合能為?28.03 kJ/mol；金圣草黃素與KDR通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基CYS A:919、ASP A:1046結(jié)合，結(jié)合能為?43.93 kJ/mol；咖啡酸與TOP2A通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基GLY B:164、MG B:904、ARG B:162、LYS B:378、SER B:149結(jié)合，結(jié)合能為?40.58 kJ/mol；木犀草素與KDR通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基CYS A:919、ASP A:1046結(jié)合，結(jié)合能為?45.19 kJ/mol；芹菜素與KDR通過(guò)氫鍵作用和氨基酸殘基ASP A:1046結(jié)合，通過(guò)疏水鍵與PHE A:1047結(jié)合，結(jié)合能為?45.19 kJ/mol。

表2 腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的關(guān)鍵活性成分與核心蛋白結(jié)合能

圖7 10個(gè)關(guān)鍵活性成分與各自對(duì)應(yīng)打分最高的核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

3 討論

近年來(lái)，F(xiàn)D和IBS-D等腸病已成為我國(guó)乃至全球范圍內(nèi)的流行病，嚴(yán)重降低了患者生活質(zhì)量，同時(shí)也增加了其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且目前FD和IBS-D的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究認(rèn)為FD和IBS-D是性別、年齡、遺傳、免疫、環(huán)境等因素及其相互疊加作用的結(jié)果[21-23]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為心理因素、免疫功能異常、內(nèi)臟高敏感性、腸道菌群失調(diào)、消化系統(tǒng)感染、腦腸軸、自主神經(jīng)功能與其發(fā)病相關(guān)[24-25]，現(xiàn)在常用抗生素、吸附劑和調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境等方式治療FD和IBS-D，短期療效尚可，但停藥后復(fù)發(fā)率高且不良反應(yīng)明顯[26-28]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為FD和IBS-D的發(fā)病的病因主要為外邪侵襲及飲食內(nèi)傷，同時(shí)情志不遂、勞倦及久病體虛等也是重要影響因素[29-30]。腸炎寧顆粒屬于中成藥，具有清熱利濕、止瀉行氣的功效[31]，常用于治療FD和IBS-D等腸性疾病，但其作用機(jī)制尚無(wú)系統(tǒng)性研究。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探索腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的作用機(jī)制，以口服生物利用度和類(lèi)藥性為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到腸炎寧顆?；钚猿煞?8個(gè)，根據(jù)“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析篩選出腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的活性成分30個(gè)及作用靶點(diǎn)77個(gè)，根據(jù)“關(guān)鍵活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)分析，最終擬合腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的主要活性成分有甲基異茜草素、槲皮素、4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸、焦性沒(méi)食子酸、金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素。槲皮素是一種天然的黃酮醇，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗癌和抗菌等多種生物活性[32-33]。5-羥色胺作為一種廣泛存在人體中樞神經(jīng)及胃腸道中的腦腸肽，參與內(nèi)臟疼痛及胃腸道動(dòng)力，與FD和IBS-D與密切相關(guān)[34]。研究表明，槲皮素可降低結(jié)腸5-羥色胺水平，減輕炎癥誘導(dǎo)型腸易激綜合征大鼠的內(nèi)臟高敏感性及內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反應(yīng)[35]；槲皮素可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞間緊密連接，調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)，維系腸道微生態(tài)穩(wěn)定，進(jìn)而保護(hù)腸道黏膜屏障功能[36]。山柰酚是一種黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化以及抗癌等作用[37-38]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素和山柰酚均可通過(guò)調(diào)控Ca2+通道，抑制大鼠結(jié)腸縱肌的自發(fā)收縮，進(jìn)而達(dá)到解痙作用[39]。鞣花酸是一種廣泛存在于植物中的天然多酚，大量文獻(xiàn)報(bào)道鞣花酸在清除自由基、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗過(guò)敏、抗衰老以及抗氧化等方面有突出作用[40-41]。鞣花酸對(duì)腸道上皮細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，能夠促進(jìn)腸道內(nèi)容物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，防止腸道中的致病菌在腸道上皮細(xì)胞中定殖[42]，而且其最大優(yōu)點(diǎn)是其作為親營(yíng)養(yǎng)素的一種，不影響腸道菌群，并且沒(méi)有停藥期[43]。此外，鞣花酸還可通過(guò)降低血液炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生改善小腸上皮細(xì)胞炎癥水平[44]。木犀草素是一種具有多種藥理活性的黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌等活性[45-46]。研究表明，木犀草素在調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)和治療慢性炎癥性腸病中起著重要作用，可以減少小腸內(nèi)容物的體積和重量，從而發(fā)揮止瀉作用[47-48]。在10個(gè)主要活性成分中，金毛耳草占2個(gè)，地錦草占3個(gè)，楓香樹(shù)葉占2個(gè)，香薷占5個(gè)，由此推測(cè)金毛耳草、地錦草、楓香樹(shù)葉和香薷可能是腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心中藥。

通過(guò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，篩選得出腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的核心靶點(diǎn)有SRC、PIK3R1、ESR1、FYN、AKT1、PTK2、GSK3B、EGFR、MMP2、MMP9等，體現(xiàn)出了中藥治療的多靶點(diǎn)特點(diǎn)。AKT1作為Akt的亞型，可參與免疫、代謝、生殖等多種生物過(guò)程[49]，研究表明，Akt是治療腸易激綜合征的焦點(diǎn)分子，而AKT1作為Akt的同源基因，推測(cè)其應(yīng)與腸易激綜合征有密切聯(lián)系[50-51]。MMP2和MMP9在炎癥因子表達(dá)等方面起著重要作用，有研究顯示MMP2和MMP9在腸道局部損傷和腸道炎癥中表達(dá)水平顯著升高[52]。

GO功能富集結(jié)果顯示腸炎寧顆粒作用于FD和IBS-D的核心靶點(diǎn)影響生物過(guò)程主要包括大分子代謝過(guò)程的正調(diào)控、對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、動(dòng)物器官發(fā)育、對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、氮化合物代謝過(guò)程的正調(diào)控、對(duì)內(nèi)源性刺激的反應(yīng)、轉(zhuǎn)移酶活性的反應(yīng)、對(duì)氮化合物的反應(yīng)等，表明這些生物過(guò)程可能在FD和IBS-D的發(fā)生和發(fā)展中體現(xiàn)了重要作用。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，內(nèi)分泌抵抗、PI3K/Akt、前列腺癌、癌癥、膀胱癌等通路可能是腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的潛在信號(hào)通路。EGFR可介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路，在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞發(fā)育中起關(guān)鍵作用[53]。PI3K是細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇的激酶，激活后的PI3K通過(guò)質(zhì)膜上產(chǎn)生的第2信使磷脂酰肌醇三磷酸與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白Akt結(jié)合，從Akt轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜并改變其構(gòu)象。研究表明，可通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)腸道黏膜的作用[54]。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，腸炎寧顆粒的10個(gè)主要活性成分與24個(gè)核心靶點(diǎn)平均結(jié)合能為?29.30 kJ/mol，結(jié)合能力最高的為KDR與山柰酚，結(jié)合能為?46.02 kJ/mol；結(jié)合能力最低的為CCND1與山柰酚，結(jié)合能為?15.48 kJ/mol，表明腸炎寧顆粒主要活性成分和核心受體蛋白可穩(wěn)定結(jié)合，其中KDR、SRC、TOP2A、CDK4、SYK與主要活性成分對(duì)接結(jié)果較好，提示其可能為腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D關(guān)鍵靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，腸炎寧顆粒主要活性成分甲基異茜草素、槲皮素、4′,5-二羥基黃酮、山柰酚、鞣花酸、焦性沒(méi)食子酸、金圣草黃素、咖啡酸、木犀草素、芹菜素等可能通過(guò)與SRC、PIK3R1、ESR1、FYN、AKT1、PTK2、GSK3B、EGFR、MMP2、MMP9等蛋白相結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)節(jié)內(nèi)分泌抵抗、PI3K/Akt、前列腺癌、癌癥、膀胱癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗等通路，從而增強(qiáng)腸屏障功能、降低內(nèi)臟敏感、減少炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸道菌群等治療FD和IBS-D。從系統(tǒng)生物學(xué)角度對(duì)腸炎寧顆粒治療FD和IBS-D的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果的分析，符合中醫(yī)運(yùn)用復(fù)方中藥多靶點(diǎn)、多途徑、多系統(tǒng)，整體調(diào)理機(jī)體、防治疾病的特點(diǎn)，但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法存在一定的局限性，本研究作為一種預(yù)測(cè)，是在分子機(jī)制層面并結(jié)合參考文獻(xiàn)進(jìn)行的預(yù)測(cè)探討，后期仍需采用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法進(jìn)一步驗(yàn)證理論分析的準(zhǔn)確性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Changyanning Granules in treatment of functional diarrhea and diarrhea irritable bowel syndrome based on network pharmacology and molecular docking

TIAN Wen-guo1, 2, CHEN Jin-peng2, 3, 4, WANG Chun-fang1, 2, LIU Yi2, 3, 4, GAI Xiao-hong2, 3, 4, LIU Quan-guo5, TIAN Cheng-wang2, 3, 4, CHEN Chang-qing2, 3, 4

1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 3. Tianjin Key Laboratory of Quality Marker of Traditional Medicine, Tianjin 300462, China 4. State Key Laboratory of Drug Delivery and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 5. Hainan Huluwa Pharmaceutical Group Co., Ltd., Haikou 570216, China

To explore the mechanism of Changyanning Granules (腸炎寧顆粒) in treatment of functional diarrhea (FD) and diarrhea irritable bowel syndrome (IBS-D) by using network pharmacology and molecular docking.The ingredients of five medicinal materials from Changyanning Granules were searched by TCMSP database and literature. SwissADME platform was used to screen the active ingredients of Changyanning Granules; SwissTargetPrediction platform was used to predict the targets of active ingredients of Changyanning Granules; GeneCards database was used to predict FD and IBS-D targets; Venny 2.1.0 was used to collect the intersection targets of Changyanning Granules in treating FD and IBS-D; STRING database was used to acquire protein-protein interaction (PPI) network and then import into Cytoscape 3.9.1 software to acquire the core targets; OmicsBean database was used to carry out gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on core targets; “Medicinal material-active ingredient-target” and “key active ingredient-core target-pathway” networks were constructed by Cytoscape 3.9.1 software; Schr?dinger-Maestro was used to perform molecular docking between key active components and core targets.Thirty active ingredients for treating FD and IBS-D were screened from Changyanning Granules, among which 10 key active ingredients were rubiadin, quercetin, 4′,5-dihydroxyflavone, kaempferol, ellagic acid, pyrogallol, chrysoeriol, caffeic acid, luteolin and apigenin. 24 core targets were protein kinase B1 (AKT1), epidermal growth factor receptor (EGFR), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), MMP9, etc. KEGG pathway enrichment analysis found that it mainly involved endocrine resistance, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) signaling pathway, prostate cancer and other pathways. Molecular docking indicated that key active ingredients could spontaneously combine with core targets.Changyanning Granules may reduce visceral sensitivity, reduce inflammatory reaction and regulate intestinal flora through multiple components, multiple targets and multiple pathways, so as to treat FD and IBS-D.

Changyanning Granules; functional diarrhea; diarrhea irritable bowel syndrome; network pharmacology; rubiadin; quercetin; 4′,5-dihydroxyflavone; kaempferol; ellagic acid; pyrogallol; chrysoeriol; caffeic acid; luteolin; apigenin

R285.5

A

0253 - 2670(2022)22 - 7135 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.017

2022-09-06

中-德中藥與植物藥創(chuàng)新研發(fā)國(guó)際合作基地醫(yī)藥國(guó)際合作專(zhuān)項(xiàng)（0610-2140NF020630）

田文國(guó)，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治雠c質(zhì)量標(biāo)志物。E-mail: tian_wen_guo@163.com

田成旺，博士，研究員，主要從事中藥新藥研發(fā)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: tiancw@tjipr.com

陳常青，研究員。E-mail: chencq@tjipr.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]