基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究毛冬青三萜皂苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠腸損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

王 瑩，陳冰瑩，伍鈺蓉，張穎茵，王 倩，李 瑜，張 蕾*

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究毛冬青三萜皂苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠腸損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

王 瑩1，陳冰瑩1，伍鈺蓉1，張穎茵1，王 倩1，李 瑜2，張 蕾1*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，廣東 廣州 510006

探討毛冬青三萜皂苷（triterpenoid saponin，IPTS）對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠腸損傷的作用及潛在機(jī)制。C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和IPTS低、中、高劑量（88、176、264 mg/kg）組，給予藥物干預(yù)7 d，ip LPS誘導(dǎo)小鼠小腸損傷，造模7 h后，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠回腸組織病理變化；檢測(cè)小鼠血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用qRT-PCR和Western blotting法檢測(cè)回腸組織炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，）mRNA和腸屏障緊密連接蛋白、mRNA及蛋白表達(dá)。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序挖掘IPTS作用于回腸的潛在機(jī)制。與模型組比較，IPTS組小鼠回腸組織完整，氧化應(yīng)激損傷改善（＜0.001），回腸炎癥因子水平降低（＜0.01），腸屏障恢復(fù)（＜0.05、0.01、0.001）。RNA-seq測(cè)序結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組共篩選出2584個(gè)差異表達(dá)基因；與模型組比較，IPTS高劑量組共篩選出259個(gè)差異表達(dá)基因；這些差異表達(dá)基因主要富集在免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）相關(guān)的腸道免疫、花生四烯酸代謝、B細(xì)胞受體、瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道炎癥調(diào)控、亞油酸代謝等信號(hào)通路。IPTS可以改善LPS誘導(dǎo)的小鼠小腸損傷，可能與花生四烯酸代謝、IgA相關(guān)的腸道免疫代謝以及TRP通道炎癥調(diào)控通路密切相關(guān)。

毛冬青三萜皂苷；腸損傷；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；氧化應(yīng)激；炎癥；腸屏障

毛冬青Hook. et Am.是冬青科冬青屬植物，是我國(guó)南方常用中藥，其主要功效為清熱解毒、活血通絡(luò)。中醫(yī)通過辨證論治，廣泛應(yīng)用毛冬青治療心腦血管疾病，其在降低不良反應(yīng)等方面明顯優(yōu)于化學(xué)藥，且療效穩(wěn)定，無(wú)耐藥性和成癮性，患者容易接受[1]。植物化學(xué)和藥效學(xué)研究結(jié)果表明，毛冬青的主要活性成分為三萜皂苷[2]。然而，當(dāng)將毛冬青三萜皂苷（triterpenoid saponin，IPTS）的體內(nèi)過程納入藥理機(jī)制的闡釋中時(shí)，卻有系列問題亟待解決：毛冬青主要藥效物質(zhì)三萜皂苷類成分口服給藥血藥濃度低，即便相對(duì)吸收特性較好的苷元如毛冬青甲素，單體口服給藥的絕對(duì)生物利用度＜3%[3-4]。本課題組前期組織分布研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠ig毛冬青提取液后，IPTS主要分布于胃腸道，僅有少量分布于心臟，腦中更是痕量的分布，因此現(xiàn)有的基于非口服給藥途徑的藥理學(xué)研究結(jié)果尚無(wú)法詮釋其口服用藥抗心腦血管性疾病的作用機(jī)制。

本課題組在研究IPTS抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，IPTS不但可以調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)改善動(dòng)脈粥樣硬化，還能顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血清中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）水平[5]。文獻(xiàn)報(bào)道，動(dòng)脈粥樣硬化疾病常伴隨腸黏膜屏障功能障礙，使其通透性增大，從而導(dǎo)致腸道菌群產(chǎn)生的LPS透過腸屏障進(jìn)入血液循環(huán)中。當(dāng)LPS從腸道轉(zhuǎn)移到循環(huán)中時(shí)，與LPS結(jié)合蛋白形成復(fù)合體，可以與單核細(xì)胞上的CD14結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[6]?；凇澳c-心”軸理論、毛冬青在民間的抗炎用途和其組織分布特點(diǎn)，推測(cè)毛冬青具有抗小腸炎性損傷，維持腸黏膜屏障緊密連接和完整性，進(jìn)而發(fā)揮其抗心腦血管疾病的作用。由于通過高脂飲食制備的動(dòng)脈粥樣硬化模型伴腸道損傷周期長(zhǎng)、成模率低，本研究通過ip LPS建立小鼠小腸損傷的炎癥模型，探討IPTS保護(hù)小腸黏膜屏障的作用，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析，探索其潛在機(jī)制和作用靶點(diǎn)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自珠海百試通生物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（粵）2020-0051。動(dòng)物于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院動(dòng)物房SPF級(jí)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度（24±2）℃、12 h光晝交替，自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)為SYXK（粵）2019-0202，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)ZYD-2021-223）。

1.2 藥材

毛冬青購(gòu)自廣州白云山中藥飲片有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)張丹雁教授鑒定為冬青科冬青屬植物毛冬青Hook. et Am.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

毛冬青皂苷B1對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）由廣州中醫(yī)藥大學(xué)趙鐘祥教授課題組提供；4%多聚甲醛固定液（批號(hào)21211717）購(gòu)自北京Biosharp公司； PBS緩沖液（批號(hào)GA21120122694）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；LPS（批號(hào)12190801）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；生理鹽水（批號(hào)0506A22）購(gòu)自雷根生物公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20211119）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20211120）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑（批號(hào)03877118721）、HiFiScript gDNA Removal RT Master Mix試劑盒（批號(hào)02322）、Magic SYBR Mixture試劑盒（批號(hào)09321）購(gòu)自康為世紀(jì)公司；小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物（批號(hào)I620KA5091）購(gòu)自生工生物工程公司；DEPC水（批號(hào)051821210702）購(gòu)自北京索萊寶公司；GAPDH抗體（批號(hào)AC21110131A）購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；ZO-1抗體（批號(hào)GR3398704-6）、Occludin抗體（批號(hào)GR3383643-14）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)S0001）購(gòu)自Affinity公司；Marker（批號(hào)91226047）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 儀器

LC-LX-HR165A型冷凍離心機(jī)（上海力辰公司）；Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；THM51 119300型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、NC2000型Nanodrop紫外定量?jī)x、ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；SDS-PAGE垂直電泳槽、垂直轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；Illumina Misseq測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）。

2 方法

2.1 IPTS的制備

毛冬青根莖飲片打成粗粉，用10倍量的蒸餾水浸泡24 h，浸泡2次，并定時(shí)攪拌，濾過，棄去濾液，濾過后的粗粉按料液比1∶10加入85%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，收集全部濾液，濃縮，干燥后得到毛冬青提取粉末。以毛冬青皂苷B1為對(duì)照品，采用比色法測(cè)定總?cè)圃碥盏馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（），吸光度為縱坐標(biāo)（），得標(biāo)準(zhǔn)曲線＝369.95－0.052 9（2＝1.000），計(jì)算得三萜皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.6%。

2.2 造模、分組及給藥

C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和IPTS低、中、高劑量（88、176、264 mg/kg）組，每組12只。IPTS溶于0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成質(zhì)量濃度為8.8、17.6、26.4 mg/mL的混懸液，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積的0.5% CMC-Na，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后，模型組和各給藥組ip LPS（10 mg/kg），造模7 h后，記錄小鼠造模前后體質(zhì)量及狀態(tài)變化，計(jì)算小鼠ip LPS前后體質(zhì)量差值。

2.3 IPTS對(duì)腸損傷小鼠血清中MDA水平及SOD活性的影響

造模7 h后，對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，摘眼球取血，室溫靜置1 h后，4 ℃、3800 r/min離心10 min，收集上清液，于?80 ℃保存。按照試劑盒說明書測(cè)定血清中MDA水平及SOD活性。

2.4 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織病理變化的影響

小鼠脫頸椎處死后，在冰上取回腸，用PBS溶于小心沖洗，取0.5 cm置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋后切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察小腸組織病理變化。

2.5 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和腸屏障蛋白ZO-1、Occludin mRNA表達(dá)的影響

取各組小鼠回腸組織20 mg，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-CACTACAGGCTCCG- AGATGAACAAC-3’、下游引物5’-TGTCGTTGCTT- GGTTCTCCTTGTAC-3’；上游引物5’-AGAGGTTGGCTATGGAGGCTGTG-3’、下游引物5’-CCTGCATCGTTGACGGTCTTCC-3’；上游引物5’-AACCCGAAACTGATGCTGTGGATAG-3’、下游引物5’-CGCCCTTGGAATGTATGTGGAGAG-3’；上游引物5’-TTGGCTACGGAGGTG- GCTATGG、下游引物5’-CCTTTGGCTGCTCTTG-GGTCTG-3’；上游引物5’-GGTTGTCTCCT- GCGACTTCA-3’、下游引物5’-TGGTCCAGGGTT- TCTTACTCC-3’。

2.6 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)的影響

取各組小鼠回腸組織30 mg，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，使用冷凍組織研磨儀進(jìn)行勻漿（60 Hz、60 s），勻漿后放于碎冰上靜置20 min，4 ℃、1200 r/min離心5 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入Loading buffer后混勻，沸水煮15 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2.5 h；分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育1 h，加入ECL工作液發(fā)光顯色，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.7 RNA-Seq測(cè)序分析

2.7.1 RNA提取和RNA-Seq測(cè)序 分別取對(duì)照組、模型組、IPTS高劑量組回腸組織100 mg，置于RNase-Free凍存管內(nèi)，于液氮中冷凍，委托（上海）美吉生物公司進(jìn)行RNA提取和RNA-Seq測(cè)序，并使用該公司在線分析平臺(tái)進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)錄測(cè)序具體流程如下：采用TruSeqTMRNA sample preparation Kit試劑盒建立RNA文庫(kù)。首先利用帶有Oligo（dT）的磁珠從1 μg總RNA中富集有poly-A尾的mRNA，再加入fragmentation buffer，將mRNA隨機(jī)斷裂成300 bp左右的小片段，接著采用SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit試劑盒，加入六堿基隨機(jī)引物，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)合成一鏈cDNA，隨后進(jìn)行二鏈合成，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。雙鏈的cDNA結(jié)構(gòu)為黏性末端，加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端，隨后在3’末端加上一個(gè)A堿基，用于連接Y字形的接頭。cDNA經(jīng)過PCR富集后，beads（DNA clean beads）篩選200～300 bp的條帶。經(jīng)TBS380定量后，使用Ilumina HiSeq xten/NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150。

2.7.2 測(cè)序?yàn)V過原始數(shù)據(jù)質(zhì)控對(duì)比 對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行濾過，去除reads中的接頭序列，去除序列末端質(zhì)量值小于20的堿基，去除含N比率超過10%的reads，舍棄去adapter及質(zhì)量修剪后長(zhǎng)度小于20 bp的序列，對(duì)濾過的數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)分析。

2.7.3 基因差異表達(dá)分析 在RNA-Seq分析中，通過定位到基因組區(qū)域的序列數(shù)來(lái)計(jì)算基因的表達(dá)水平。使用RSEM軟件對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，獲得基因的序列數(shù)后，使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq2軟件對(duì)Raw數(shù)進(jìn)行分析，基于一定的標(biāo)準(zhǔn)化處理和篩選條件獲得比較組間表達(dá)差異的基因，最后按照表達(dá)量倍數(shù)差異和表達(dá)差異顯著性進(jìn)行篩選，校正的值（adjust）＜0.05且|log2FC|≥2。

2.7.4 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Goatools軟件，進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)，對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析。采用BH方法對(duì)值進(jìn)行校正，當(dāng)adjust＜0.05時(shí)，認(rèn)為此功能存在顯著富集情況。使用KOBAS進(jìn)行KEGG通路富集分析，計(jì)算原理同GO功能富集分析，滿足adjust＜0.05的KEGG通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的KEGG通路。

2.7.5 IPTS對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸損傷小鼠回腸組織關(guān)鍵基因表達(dá)的影響 通過qRT-PCR驗(yàn)證關(guān)鍵差異基因肌醇-1,4,5-三磷酸受體2（inositol-1,4,5-trisphosphate receptor type 2，）、嘌呤能受體P2Y2（purinergic receptor P2Y2，）、整合素亞基α4（integrin subunit α4，）、、趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，）、細(xì)胞色素P450家族2亞家族C成員55（cytochrome P450 family 2 subfamily C member 55，）、、、、Ⅴ組磷脂酶A2（phospholipase A2 group V，）的表達(dá)。取小鼠回腸組織20 mg，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行qRT-PCR分析，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 IPTS對(duì)腸損傷小鼠體質(zhì)量的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量丟失明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量丟失均明顯降低（＜0.01）。表明小鼠ip LPS會(huì)造成體質(zhì)量下降，IPTS可以緩解LPS造成的小鼠體質(zhì)量下降。

3.2 IPTS對(duì)腸損傷小鼠血清中MDA水平及SOD活性的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中MDA水平顯著升高（＜0.001），SOD活性顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，IPTS高劑量組小鼠血清中MDA水平顯著降低（＜0.001），各給藥組SOD活性均顯著升高（＜0.001）。表明小鼠ip LPS后，體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，IPTS能夠緩解氧化應(yīng)激損傷。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.01，下圖同

3.3 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織病理變化的影響

如圖3所示，對(duì)照組小鼠回腸組織結(jié)構(gòu)正常，絨毛排列緊密，細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)組織學(xué)病變。模型組小鼠回腸絨毛斷裂，腸黏膜上皮細(xì)胞脫落。與模型組比較，IPTS低、中劑量組小鼠回腸絨毛恢復(fù)，僅有小部分脫落；IPTS高劑量組小鼠回腸損傷較輕，腸黏膜結(jié)構(gòu)基本完整，腸絨毛大部分排列整齊。

3.4 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織炎癥因子IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠回腸組織中和的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠回腸組織中mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），IPTS中、高劑量組回腸組織中mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。表明IPTS能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的腸損傷小鼠回腸組織中炎癥因子表達(dá)。

圖2 IPTS對(duì)腸損傷小鼠血清中MDA水平及SOD活性的影響(, n = 6)

箭頭表示小腸絨毛受損

圖4 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)的影響(, n = 6)

3.5 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織腸屏障蛋白ZO-1、OccludinmRNA和蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠回腸組織中屏障蛋白、的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，IPTS高劑量組回腸組織中的mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.001），IPTS中、高劑量組回腸組織中的mRNA表達(dá)水平明顯升高（＜0.05、0.001）。

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠回腸組織中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，IPTS中、高劑量組回腸組織中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01、0.001）。

以上結(jié)果表明，小鼠ip LPS后，回腸組織中腸屏障蛋白和的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低，造成回腸腸屏障損傷；IPTS能夠顯著恢復(fù)其表達(dá)，保護(hù)回腸腸屏障。

圖5 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織ZO-1和OccludinmRNA表達(dá)的影響(, n = 6)

圖6 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)的影響(, n = 6)

3.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估

本研究共完成14個(gè)樣品（對(duì)照組4個(gè)、模型組5個(gè)、IPTS高劑量組5個(gè)）的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。經(jīng)質(zhì)量控制所有樣品的誤差率小于0.025 3%，所有樣品的20均大于97.85%，30均大于93.94%。根據(jù)飽和度曲線可知，所有樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量已滿足定量要求。覆蓋度分布圖說明測(cè)序無(wú)偏向性，測(cè)序所得序列在基因上均勻分布。

3.7 基因差異表達(dá)分析結(jié)果

模型組和對(duì)照組之間有2584個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），與對(duì)照組比較，模型組上調(diào)DEGs 1119個(gè)，下調(diào)DEGs 1465個(gè)；IPTS高劑量組和模型組之間有259個(gè)DEGs，與模型組比較，IPTS高劑量組上調(diào)DEGs 208個(gè)，下調(diào)DEGs 51個(gè)。由差異表達(dá)基因聚類分析圖（圖7）可知，IPTS在一定程度上回調(diào)了小鼠ip LPS后回腸組織DEGs。

3.8 DEGs富集分析

將篩選出的DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集結(jié)果見圖8，模型組與對(duì)照組相比，與分子功能相關(guān)的差異基因主要富集在連接、催化活性；與細(xì)胞成分相關(guān)的主要富集于細(xì)胞部分、細(xì)胞器、細(xì)胞膜；與生物過程相關(guān)的主要富集在細(xì)胞過程、生物調(diào)控。KEGG通路主要富集在IgA生成相關(guān)腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、甾體激素生物合成、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路等。

C-模型組 M-模型組 IH-IPTS高劑量組

圖8 對(duì)照組與模型組DEGs的GO功能 (A)和KEGG通路 (B)富集分析

如圖9所示，IPTS高劑量組與模型組相比，與分子功能相關(guān)的差異基因主要富集在連接、催化活性；與細(xì)胞成分相關(guān)的主要富集于細(xì)胞部分、細(xì)胞器、細(xì)胞膜；與生物過程相關(guān)的主要富集在細(xì)胞過程、生物調(diào)控、代謝過程。KEGG通路主要富集在免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）生成相關(guān)腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、亞油酸代謝、色氨酸代謝、花生四烯酸代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道炎癥調(diào)控通路等。

3.9 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

以為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR對(duì)RNA-Seq分析結(jié)果中TRP通道炎癥調(diào)控、花生四烯酸代謝、IgA相關(guān)的腸道免疫相關(guān)通路的10個(gè)關(guān)鍵基因、、、、、、、、、進(jìn)行mRNA表達(dá)水平的驗(yàn)證。如圖10所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠回腸組織中、、、、、、、、mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，IPTS高劑量組回腸組織中、、、、、、、、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

圖9 模型組與IPTS高劑量組DEGs的GO功能 (A)和KEGG通路 (B)富集分析

圖10 IPTS對(duì)腸損傷小鼠回腸組織中關(guān)鍵基因表達(dá)的影響(, n = 6)

4 討論

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的一種成分，在腸屏障功能障礙中有著重要作用，LPS誘導(dǎo)的模型被廣泛認(rèn)為是評(píng)價(jià)腸道損傷的代表性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚7]。在LPS刺激下，NF-κB信號(hào)通路被激活，釋放大量炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等。腸道炎癥與腸屏障破壞有關(guān)，腸上皮炎癥可通過炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)[8]。腸道機(jī)械屏障是腸屏障中重要的組成部分，由單層的腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間的連接組成。其中，細(xì)胞間的連接方式包括緊密連接、黏附連接等，緊密連接是細(xì)胞間主要的連接方式。與緊密連接相關(guān)的蛋白有ZO蛋白家族、Occludin、Claudins蛋白家族等，這些蛋白的表達(dá)有助于腸屏障功能[9]。本研究結(jié)果顯示，IPTS可以下調(diào)腸損傷小鼠回腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平，上調(diào)回腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達(dá)。

MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，被認(rèn)為是過度氧化應(yīng)激的指標(biāo)。SOD可以催化O2?歧化為H2O2和O2，參與抗氧化系統(tǒng)。小腸過度氧化應(yīng)激反應(yīng)可以破壞脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等重要細(xì)胞成分，進(jìn)而導(dǎo)致腸屏障損傷[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，IPTS降低腸損傷小鼠血清中MDA水平，升高SOD活性，表明IPTS可以抑制機(jī)體過度氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)腸屏障。

本研究對(duì)對(duì)照組、模型組、IPTS高劑量組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，DEGs主要富集在IgA相關(guān)的腸道免疫、花生四烯酸代謝、B細(xì)胞受體、TRP通道炎癥調(diào)控、亞油酸代謝等信號(hào)通路。IgA是黏膜免疫系統(tǒng)中含量最豐富的抗體亞型，分泌型免疫球蛋白A是由二聚體IgA、J鏈和分泌成分組成的聚合物免疫球蛋白，是機(jī)體黏膜局部抗感染免疫的主要抗體[10]。腸上皮中的分泌型免疫球蛋白A可以攔截入侵的病原體，防止病原體對(duì)腸道屏障的滲透，并將病原體從組織中排泄出來(lái)[11]。本研究選取IgA相關(guān)的腸道免疫通路上的、基因進(jìn)行驗(yàn)證。其中，IL-15是一種T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)生發(fā)中心B細(xì)胞增殖、分化和Ig合成[12]。趨化因子受體CXCR4是趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子12（C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12）的特異受體。CXCL12對(duì)淋巴細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化作用[13]。因此，IPTS可能是通過調(diào)節(jié)其表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)小腸免疫系統(tǒng)，維持腸屏障功能。

花生四烯酸是一種ω-6多不飽和脂肪酸?；ㄉ南┧岽x通路上的關(guān)鍵基因，具有將細(xì)胞膜內(nèi)表面酯化的花生四烯酸水解成游離形式的作用，再由然后由環(huán)氧合酶、脂氧合酶和細(xì)胞色素P450酶進(jìn)一步代謝成一系列生物活性介質(zhì)，包括前列腺素、白三烯、二十碳四烯酸等，有助于細(xì)胞炎癥信號(hào)的傳遞，被認(rèn)為是炎癥性疾病和心血管疾病的預(yù)防和治療靶點(diǎn)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，IPTS可能是通過下調(diào)PLA2G5的表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞色素P450家族（CYP2C55、CYP2C65、CYP2C66、CYP2C68）的表達(dá)，抑制小腸炎癥的發(fā)生。

此外，TRP通道是一種陽(yáng)離子選擇性通道，廣泛存在于胃腸道，作為各種刺激的檢測(cè)器和G蛋白偶聯(lián)受體的二級(jí)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TRP通道的激活可以引發(fā)相關(guān)神經(jīng)肽的炎癥并啟動(dòng)免疫反應(yīng)，在控制單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬、產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子等方面發(fā)揮重要作用[16]，是炎癥通路中的重要信號(hào)成分[17]。該通路的關(guān)鍵基因?qū)儆卩堰誓苁荏w家族，能被三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）或其他核苷酸激活。其中，P2Y受體主要為G蛋白偶聯(lián)受體，可以調(diào)節(jié)TRP通道。該通路另一關(guān)鍵基因是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放通道，該基因編碼的蛋白家族成員是細(xì)胞內(nèi)第2信使鈣釋放通道。因此，IPTS可能是通過調(diào)節(jié)P2RY2和ITPR2的表達(dá)，影響TRP通道，進(jìn)一步抑制小腸炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過LPS誘導(dǎo)建立小鼠小腸損傷模型，通過檢測(cè)炎癥因子水平、腸屏障蛋白的表達(dá)等方法證明IPTS具有保護(hù)小腸腸屏障的作用。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序的手段，深入探究潛在機(jī)制，結(jié)果顯示IPTS通過介導(dǎo)IgA相關(guān)的腸道免疫信號(hào)通路、花生四烯酸代謝的信號(hào)通路、TRP通道炎癥調(diào)控通路和B細(xì)胞受體信號(hào)通路等多種途徑發(fā)揮保護(hù)作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism oftriterpenoid saponins on lipopolysaccharide-induced intestinal barrier injury in mice based on transcriptome

WANG Ying1, CHEN Bing-ying1, WU Yu-rong1, ZHANG Ying-yin1, WANG Qian1, LI Yu2, ZHANG Lei1

1. School of Pharmaceutical Science, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 2. School of Nursing, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

To investigate the effect and potential mechanism oftriterpenoid saponins (IPTS) on lipopolysaccharide (LPS)-induced small intestinal injury in mice.C57BL/6 mice were randomly divided into control group, model group and IPTS low-, medium-and high-dose (88, 176, 264 mg/kg) groups. After 7 d of drug intervention, mice were ip LPS to induce small intestine injury. After 7 h of modeling, hematoxylin eosin (HE) staining was used to observe pathology of ileum in mice; Level of malondialdehyde (MDA) and activity of superoxide dismutase (SOD) in serum of mice were detected; qRT-PCR and Western blotting were used to detect inflammatory factor interleukin-1β (), tumor necrosis factor-α () mRNA and intestinal barrier tight junction protein,mRNA and protein expressions in ileum. The potential mechanism of IPTS on ileum was explored by transcriptome sequencing.Compared with model group, ileum in IPTS group was intact, oxidative stress injury was improved (< 0.001), level of ileitis factor was decreased (< 0.01), and intestinal barrier was restored (< 0.05, 0.01, 0.001). RNA-seq sequencing results showed that 2584 differentially expressed genes were screened from model group compared with control group; Compared with model group, 259 differentially expressed genes were screened out in IPTS high-dose group; These differentially expressed genes were mainly enriched in signaling pathway such as immunoglobulin A (IgA) related intestinal immunity, arachidonic acid metabolism, B cell receptor, transient receptor potential (TRP) channel inflammation regulation, linoleic acid metabolism, etc.IPTS can improve LPS induced intestinal injury in mice, which may be closely related to arachidonic acid metabolism, IgA related intestinal immune metabolism and TRP channel inflammatory regulation pathway.

triterpene saponins; intestinal barrier injury; transcriptome; oxidative stress; inflammation; intestinal barrier

R285.5

A

0253 - 2670(2022)22 - 7102 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.013

2022-08-16

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016A020226031）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2018A030313328）；廣東省教育廳創(chuàng)新強(qiáng)校工程項(xiàng)目（2016KTSCX019）

王 瑩（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。Tel: 13128253065 E-mail: 839072446@qq.com

張 蕾，女，碩士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。Tel: 15622182155 E-mail: zhangleic431@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]