基于特征圖譜與5種成分含量的經(jīng)典名方桃紅四物湯量值傳遞分析

杜克群，成顏芬，李敏敏，江華娟，馬 川，黃成武，張羽斌，王團結，何 瑤*，傅超美*

基于特征圖譜與5種成分含量的經(jīng)典名方桃紅四物湯量值傳遞分析

杜克群1，成顏芬1，李敏敏1，江華娟1，馬 川1，黃成武2，張羽斌2，王團結3, 4，何 瑤1*，傅超美1*

1. 成都中醫(yī)藥大學藥學院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 貴州益佰制藥股份有限公司，貴州 貴陽 550008 3. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001 4. 中藥制劑過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001

探索桃紅四物湯（Taohong Siwu Decoction，TSD）藥材-飲片-水煎液-基準樣品的全過程質(zhì)量傳遞規(guī)律，為其經(jīng)典名方制劑質(zhì)量控制研究提供基礎。制備15批TSD水煎液、基準樣品，建立水煎液、基準樣品超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）特征圖譜，并采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定5種指標性成分的含量，計算各成分在藥材-飲片-水煎液-基準樣品傳遞過程中的轉移率。15批TSD水煎液和基準樣品的特征圖譜，相似度均＞0.9，共歸屬20個共有峰，經(jīng)與對照品比對指認出11個色譜峰，分別為沒食子酸、地黃苷D、苦杏仁苷、綠原酸、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、毛蕊花糖苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、藁本內(nèi)酯。5種成分在水煎液、基準樣品中的質(zhì)量分數(shù)分別為地黃苷D 0.26～0.46、0.11～0.30 mg/g，阿魏酸0.33～0.51、0.09～0.18 mg/g，芍藥苷1.07～2.43、0.48～1.49 mg/g，苦杏仁苷1.66～2.31、0.60～1.58 mg/g，羥基紅花黃色素A 0.98、0.26～0.44 mg/g。藥材至飲片、飲片至水煎液、水煎液至基準樣品的平均轉移率分別為地黃苷D 101.50%、55.44%、64.11%；阿魏酸94.31%（當歸藥材至飲片）、93.91%（川芎藥材至飲片）、37.24%、35.61%；芍藥苷111.55%、72.80%、63.48%；苦杏仁苷117.34%、91.78%、64.60%；羥基紅花黃色素A 93.64%、60.23%、34.19%。采用UPLC特征圖譜結合5種成分的HPLC含量測定，分析TSD藥材-飲片-水煎液-基準樣品的量值傳遞規(guī)律，為TSD經(jīng)典名方制劑開發(fā)和質(zhì)量控制提供科學基礎。

經(jīng)典名方；桃紅四物湯；基準樣品；特征圖譜；含量測定；量值傳遞；沒食子酸；地黃苷D；苦杏仁苷；綠原酸；芍藥苷；羥基紅花黃色素A；阿魏酸；毛蕊花糖苷；槲皮素；苯甲酰芍藥苷；藁本內(nèi)酯；UPLC；HPLC；質(zhì)量控制

桃紅四物湯（Taohong Siwu Decoction，TSD）是《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》第97號方劑，也是首批公布關鍵信息的7首經(jīng)典名方之一[1]。該方出自清·柴得華所著《婦科冰鑒》，由酒地黃、酒當歸、酒白芍、燀桃仁、川芎及酒紅花組成，功效為養(yǎng)血、活血、逐瘀，主治血虛血瘀證[2]。方中生地滋陰生血、活血祛瘀，酒炙后可增強其活血作用；當歸養(yǎng)血活血，此方中以活血為主，二者共為君藥；其余四味均為臣藥：白芍斂陰養(yǎng)血；川芎活血行滯；加入活血祛瘀的紅花、桃仁，增強全方活血化瘀的作用。基于其傳統(tǒng)功效，TSD在臨床上用于治療月經(jīng)不調(diào)、骨折、深靜脈血栓、黃褐斑、冠心病心絞痛等婦科、骨科、內(nèi)科疾病，應用廣泛且具有顯著療效[3]。

經(jīng)典名方復方制劑研發(fā)是近年來中藥新藥研究的熱點，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布的《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》[4]，提出要重視“基準樣品研究”，并對藥材、飲片、中間體、基準樣品、制劑開展相關性研究。以基準樣品承載古代經(jīng)典名方的有效性、安全性，制劑研究應以制劑質(zhì)量與基準樣品質(zhì)量基本一致為目標。基準樣品量值傳遞研究是目前實現(xiàn)制劑質(zhì)量相關性研究的重要基礎，為全面控制經(jīng)典名方制劑質(zhì)量提供依據(jù)。國內(nèi)研究者采用特征圖譜和多成分含量測定對枳實薤白桂枝湯[5]、桃核承氣湯[6]、當歸四逆湯[7]、竹葉石膏湯[8]等經(jīng)典名方開展了量值傳遞研究，以特征峰和指標性成分的含量對樣品中成分進行表征。本課題組進行TSD經(jīng)典名方制劑研究，前期系統(tǒng)開展了TSD古籍文獻考證、飲片炮制工藝研究[9]、質(zhì)量標志物預測[10-11]、煎煮工藝優(yōu)化[12]等研究。本實驗在此基礎上，制備15批TSD水煎液、基準樣品，建立其UPLC特征圖譜，并以HPLC法測定5個指標性成分地黃苷D、阿魏酸、芍藥苷、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A的含量，全面分析TSD藥材-飲片-水煎液-基準樣品傳遞過程中的量值傳遞規(guī)律，為經(jīng)典名方TSD復方制劑的后續(xù)質(zhì)量控制和研究開發(fā)奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000型高效液相色譜儀（8321033DAD檢測器，7120988四元泵，8738269自動進樣器，6280773柱溫箱）、Thermo Ultimate 3000型超高效液相色譜儀（6092427DAD檢測器，8175463四元泵，8163902自動進樣器，8527201柱溫箱），美國Thermo Fisher公司；FTS-10A型陶瓷煎藥鍋，潮州市一壺百飲電器實業(yè)有限公司；N-1100型旋轉蒸發(fā)儀，上海泉杰儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DZF6020型真空干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司，LC-LX-H185C型臺式高速離心機，上海力辰科技有限公司。

1.2 試劑與試藥

對照品地黃苷D（批號wkq21043009）、羥基紅花黃色素A（批號wkq21070209）、芍藥苷（批號wkq21040203）、阿魏酸（批號wkq21010504）、苦杏仁苷(批號wkq21032412)、沒食子酸（批號wkq20101503）、綠原酸（批號wkq21040904）、毛蕊花糖苷（批號wkq21040708）、槲皮素（批號wkq20061112）、苯甲酰芍藥苷（批號wkq20022409）、藁本內(nèi)酯（批號wkq20012006），各對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98%，符合要求。水為純化水或Milli-Q超純水；甲醇和磷酸為HPLC級，其他試劑均為分析純，購于成都市科隆化學品有限公司。

藥材信息：生地黃購自河南省焦作市武陟縣（批號20073101～20073115），當歸購自青海省西寧市大通縣（批號20091501～20091515），白芍購自四川省德陽市中江縣（批號20100101～20100115），川芎購自四川省都江堰市（批號20073101～20073115），桃仁購自陜西省寶雞市千陽縣（批號20120501～20120515），紅花購自新疆省伊犁州霍城縣（批號20091601～20091615），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學裴瑾教授鑒定，各藥材均符合《中國藥典》2020年版一部相關項下的性狀規(guī)定，鑒定結果地黃為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的干燥塊根，當歸為傘形科當歸屬植物當歸(Oliv.) Diels的干燥根，白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根，川芎為傘形科藁本屬植物川芎Hort.的干燥根莖，桃仁為薔薇科桃屬植物桃(L.) Batsch.的干燥成熟種子，紅花為菊科紅花屬植物紅花L.的干燥花。飲片規(guī)格：按照國家發(fā)布的“TSD關鍵信息”，經(jīng)課題組前期研究確定6味飲片炮制工藝[9]，制備出酒地黃、酒當歸、酒白芍、川芎生品、燀桃仁、酒紅花六味飲片，批次同上。

2 方法與結果

2.1 15批TSD水煎液、基準樣品的制備

2.1.1 水煎液的制備 根據(jù)隨機數(shù)字表法對6味飲片進行隨機組合及排序，15批TSD水煎液對應飲片批次如表1所示。按照關鍵信息公布的處方劑量及課題組前期研究得到的煎煮方法[11]制備：稱取飲片3倍量，即酒地黃33.57 g、酒當歸44.76 g、酒白芍16.8 g、川芎11.19 g、燀桃仁11.34 g、酒紅花11.19 g，置陶瓷鍋中，加10倍量水，放置浸泡30 min，充分潤濕，武火煮沸后，轉文火保持微沸60 min，待藥液冷卻至80 ℃時，采用200目過濾紗布進行濾過，煎煮2次，3層紗布濾過，合并2次濾液，調(diào)整濾液體積至2000 mL，得TSD水煎液（S1～S15）。

表1 15批TSD飲片隨機組合信息

2.1.2 基準樣品的制備 分別取“2.1.1”項水煎液1800 mL，?0.1 MPa，50 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至相對密度約為1.17（50 ℃）的浸膏，再在?0.09 MPa，50 ℃條件下減壓干燥3 d，得TSD基準樣品（J1～J15）。

2.2 TSD水煎液及基準樣品特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 Thermo Hypersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，3%甲醇；5～35 min，3%～33%甲醇；35～40 min，33%～37%甲醇；40～45 min，37%～46%甲醇；45～65 min，46%～90%甲醇；柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長為210 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取地黃苷D、阿魏酸、芍藥苷、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、沒食子酸、綠原酸、毛蕊花糖苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、藁本內(nèi)酯對照品，以甲醇為溶劑，充分溶解后定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度分別為555.0、130.0、545.0、477.5、1370.0、675.0、390.0、480.0、650.0、475.0、575.0 μg/mL的各對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

（1）TSD水煎液供試品溶液：吸取2 mL水煎液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

（2）TSD基準樣品供試品溶液：稱取5 g基準樣品于錐形瓶中，精密加入純水50 mL，密封后超聲30 min。超聲后，補足減失的質(zhì)量，全部轉移至50 mL離心管內(nèi)，10 000 r/min離心（離心半徑為16 cm）10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

（3）單味藥材、飲片供試品溶液[13]：分別稱取各單味藥材、飲片10 g，置于圓底燒瓶中，加入100 mL去離子水，放置浸泡30 min，充分潤濕，武火煮沸后轉文火加熱回流60 min，待藥液冷卻至80 ℃時，趁熱用3層200目尼龍紗布濾過，加熱回流2次，合并2次提取液，冷卻后加去離子水定容體積至200 mL，取2 mL過0.22 μm微孔濾膜，即得。

（4）陰性供試品溶液：按照“2.1.1”項下方法分別制備缺酒地黃、缺酒當歸、缺川芎、缺酒當歸和川芎、缺酒白芍、缺燀桃仁、缺酒紅花的TSD陰性樣品溶液，取2 mL過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 精密度考察 取TSD基準樣品（J1）供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄各色譜峰的保留時間和峰面積，以峰面積較大且傳遞穩(wěn)定的13號峰（阿魏酸）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積，結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.14%，相對峰面積的RSD均小于2.89%，表明儀器的精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性考察 取TSD基準樣品（J1）供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄各色譜峰的保留時間和峰面積，以13號峰（阿魏酸）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積，結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.42%，相對峰面積的RSD均小于2.60%，表明TSD基準樣品供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.6 重復性考察 取TSD基準樣品（J1），采用“2.2.3（2）”項下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄各色譜峰的保留時間和峰面積，以13號峰（阿魏酸）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積，結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.65%，相對峰面積的RSD均小于3.28%，表明該測定方法重復性良好。

2.2.7 指紋圖譜的建立及相似度分析 將15批TSD水煎液（S1～S15）及基準樣品（J1～J15）的特征圖譜以cdf格式分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版），以S1或J1特征圖譜為對照，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.2 min，多點校正后，進行全峰匹配，生成TSD水煎液和基準樣品特征圖譜共有模式（R），結果見圖1、2。水煎液與基準樣品均標定到前19個特征峰，第20號峰（藁本內(nèi)酯）未從水煎液傳遞到基準樣品。通過與對照品比對，指認了其中11個成分，結果見圖3。對15批TSD水煎液及基準樣品特征圖譜進行相似度分析，結果表明，TSD水煎液樣品（S1～S15）特征圖譜與其對照特征圖譜的相似度分別為0.929、0.939、0.966、0.978、0.982、0.963、0.974、0.980、0.987、0.989、0.988、0.977、0.981、0.992、0.960，均＞0.9；15批TSD基準樣品（J1～J15）特征圖譜與其對照特征圖譜的相似度分別為0.942、0.946、0.925、0.959、0.916、0.968、0.979、0.921、0.969、0.970、0.971、0.949、0.972、0.951、0.971，均＞0.9。

圖1 15批TSD水煎液(S1～S15)的UPLC特征圖譜及對照特征圖譜(R)

圖2 15批TSD基準樣品(J1～J15)的UPLC特征圖譜及對照特征圖譜(R)

3-沒食子酸 4-地黃苷D 7-苦杏仁苷 9-綠原酸 10-芍藥苷 12-羥基紅花黃色素A 13-阿魏酸 15-毛蕊花糖苷 17-槲皮素 18-苯甲酰芍藥苷 20-藁本內(nèi)酯

2.2.8 特征圖譜量值傳遞關系分析 將水煎液、基準樣品與陰性樣品、單味藥材和單味飲片的特征圖譜進行比對，對標定的20個特征峰進行歸屬，見圖4、5。結果表明，1、4（地黃苷D）、11、15（毛蕊花糖苷）號峰來源于地黃，2、13（阿魏酸）、20（藁本內(nèi)酯）號峰來源于當歸和川芎，3（沒食子酸）號峰為白芍和紅花共有，6號峰為當歸和白芍共有，7（苦杏仁苷）號峰來源于桃仁，9（綠原酸）號峰為當歸、川芎和紅花共有，8、12（羥基紅花黃色素A）、14、16、17（槲皮素）號峰來源于紅花，10（芍藥苷）、18（苯甲酰芍藥苷）號峰來源于白芍，19號峰來源于川芎。5號峰在除白芍外的5味中藥中均有出現(xiàn)，推測可能為極性相似的一類化合物，有待進一步研究。

圖4 TSD基準樣品(J1)、水煎液(S1)與單味藥材、單味飲片的UPLC圖譜

圖5 TSD基準樣品(J1)、水煎液(S1)與陰性樣品的UPLC圖譜

水煎液與基準樣品是重要的制劑中間體，為了更加明確水煎液到基準樣品的特征圖譜傳遞規(guī)律，比較了水煎液、基準樣品已指認特征峰相對峰面積的差異，相對峰面積可以反映成分含量在藥物中的比例。以峰面積較大且傳遞穩(wěn)定的阿魏酸（S峰）為參照，計算15批TSD水煎液、基準樣品中另10個已指認特征峰的相對峰面積，結果見表2。結果表明，TSD中大部分已指認特征峰可以以穩(wěn)定的比例從水煎液傳遞到基準樣品。

表2 TSD水煎液(S)-基準樣品(J)中已指認特征峰相對峰面積的傳遞

某批次某特征峰的相對峰面積＝某批次某特征峰的峰面積/同一批次S峰的峰面積

2.3 TSD中5種成分的含量測定

2.3.1 色譜條件[14]Thermo Hypersil Gold C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，5%～13%甲醇；10～15 min，13%～22%甲醇；15～20 min，22%甲醇；20～40 min，22%～34%甲醇；40～55 min，34%～46%甲醇；柱溫25 ℃；體積流量1 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長為210 nm。

2.3.2 供試品溶液的制備 分別稱取3倍處方量的各單味藥材及飲片，按照“2.2.3（1）”項下水煎液的制備方法制備各單味藥材、飲片供試品溶液，水煎液、基準樣品供試品溶液的制備方法與“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法一致。

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取地黃苷D、阿魏酸、芍藥苷、苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A對照品，分別用甲醇充分溶解后轉移至5 mL量瓶中，定容至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為1.270、1.054、4.020、3.822、5.200 mg/mL的對照品母液，用甲醇將母液分別稀釋成所需質(zhì)量濃度，對照品與樣品的色譜圖見圖6。

2.3.4 線性關系考察 按照二倍稀釋法將指標性成分對照品母液分別稀釋2、4、8、16、32、64倍，制得系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線并計算回歸方程，結果見表3。

2.3.5 精密度考察 取TSD基準樣品（J1）供試品溶液1份，按照“2.3.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，計算各指標性成分峰面積的RSD值，結果見表3，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 取TSD基準樣品（J1）供試品溶液1份，按照“2.3.1”項下色譜條件，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣，計算各指標性成分峰面積的RSD值，結果見表3，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復性考察 取TSD基準樣品（J1），采用“2.2.3（2）”項下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.3.1”項下色譜條件分別進樣，計算各指標性成分質(zhì)量分數(shù)的RSD值，結果見表3，表明該方法重復性良好。

1-地黃苷D 2-苦杏仁苷 3-羥基紅花黃色素A 4-芍藥苷 5-阿魏酸

2.3.8 加樣回收率考察 精密稱取已知指標成分含量的TSD基準樣品（J1，含地黃苷D 4.90 mg、阿魏酸3.95 mg、芍藥苷20.17 mg、苦杏仁苷23.90 mg、羥基紅花黃色素A 3.21 mg）約5 g，置錐形瓶中，分別按樣品中各成分含量的100%水平加入地黃苷D、阿魏酸、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、苦杏仁苷5種對照品溶液，按“2.2.3（2）”項下方法平行制備6份供試品溶液，采用“2.3.1”項下色譜條件分別進樣，進行含量測定，計算5種指標成分的加樣回收率及RSD值，結果見表3，表明該方法加樣回收率良好。

2.3.9 樣品含量測定及量值傳遞關系分析 按照“2.3.1”項下色譜條件將TSD 15批藥材、飲片、水煎液、基準樣品分別進樣。測定出各樣品的指標性成分含量（換算為生藥中的含量，便于比較、計算轉移率），并按以下公式計算藥材-飲片-水煎液-基準樣品中指標成分的轉移率。結果見表4～6。其中水煎液中阿魏酸的轉移率為水煎液中阿魏酸的質(zhì)量分數(shù)與對應批次當歸、川芎飲片中阿魏酸質(zhì)量分數(shù)之和的比值。

表3 含量測定方法學考察結果

轉移率（藥材-飲片）＝飲片中指標成分含量/對應批次藥材中指標成分含量

轉移率（飲片-水煎液）＝水煎液中指標成分含量×全方飲片量/(對應批次飲片中指標成分含量×單味飲片量)

轉移率（水煎液-基準樣品）＝基準樣品中指標成分含量/對應批次水煎液中指標成分含量

（1）5種成分在藥材-飲片的量值傳遞分析：酒地黃中地黃苷D平均轉移率為101.50%，酒當歸中阿魏酸平均轉移率為94.31%，酒白芍中芍藥苷轉移率平均轉移率為111.55%，川芎飲片中阿魏酸平均轉移率為93.91%，燀桃仁中苦杏仁苷的平均轉移率為117.34%，酒紅花中羥基紅花黃色素A平均轉移率為93.64%。

結果發(fā)現(xiàn)，3個批次的酒白芍飲片中芍藥苷和4個批次的燀桃仁飲片中苦杏仁苷轉移率未在平均值的70%～130%，說明芍藥苷和苦杏仁苷在炮制過程中可能受白芍炒制溫度、炒制時間或者桃仁浸泡時間的影響較大。6味藥材與其對應炮制飲片的成分轉移率結果表明，課題組研究確定的炮制工藝較穩(wěn)定，5種成分含量波動基本在合理范圍內(nèi)。

（2）5種成分在飲片-水煎液的量值傳遞分析：TSD水煎液中地黃苷D的質(zhì)量分數(shù)為0.26～0.46 mg/g，飲片-水煎液平均轉移率為55.44%；阿魏酸的質(zhì)量分數(shù)為0.33～0.51 mg/g，飲片-水煎液平均轉移率為37.24%；芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)為1.07～2.43 mg/g，飲片-水煎液平均轉移率為72.80%；苦杏仁苷的質(zhì)量分數(shù)為1.66～2.31 mg/g，飲片-水煎液平均轉移率為91.78%；羥基紅花黃色素A的質(zhì)量分數(shù)為0.98 mg/g，飲片-水煎液平均轉移率為60.23%。結果發(fā)現(xiàn)，5種成分含量在飲片-水煎液傳遞過程中未出現(xiàn)離散值，表明煎煮過程成分能穩(wěn)定傳遞。

表4 TSD藥材、飲片中指標成分含量及轉移率

表5 TSD飲片、水煎液中指標成分含量及轉移率

表6 TSD水煎液(S)、基準樣品(J)中指標成分含量及轉移率

（3）5種成分在水煎液-基準樣品的量值傳遞分析：TSD基準樣品中地黃苷D的質(zhì)量分數(shù)為0.11～0.30 mg/g，水煎液-基準樣品平均轉移率為64.11%；阿魏酸的質(zhì)量分數(shù)為0.09～0.18 mg/g，水煎液到基準樣品的平均轉移率為35.61%；芍藥苷的質(zhì)量分數(shù)為0.48～1.49 mg/g，水煎液到基準樣品的平均轉移率為63.48%；苦杏仁苷的質(zhì)量分數(shù)為0.60～1.58 mg/g，水煎液到基準樣品的平均轉移率為64.60%；羥基紅花黃色素A的質(zhì)量分數(shù)為0.26～0.44 mg/g，水煎液到基準樣品的平均轉移率為34.19%。

結果發(fā)現(xiàn)，各成分從水煎液轉移到基準樣品時，地黃苷D有3個批次、芍藥苷有2個批次、苦杏仁苷有4個批次的轉移率超出均值的70%～130%。提示水煎液至基準樣品的制備過程對基準樣品的質(zhì)量影響較大，制劑生產(chǎn)時需重點關注。

3 討論

經(jīng)典名方制劑研發(fā)是促進中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的重要舉措，是近年來中藥新藥研發(fā)的熱點[15]。從2008年《中藥注冊管理補充規(guī)定》首次提出經(jīng)典名方以來，國家相繼發(fā)布了多個政策支持經(jīng)典名方制劑研究，經(jīng)典名方復方制劑的研究要求日漸清晰。經(jīng)典名方基準樣品與藥材、飲片、水煎液的相關性研究，是有效控制其質(zhì)量波動范圍，確?；鶞蕵悠放c制劑質(zhì)量一致性的重要途徑[16]。本研究通過TSD藥材-飲片-水煎液-基準樣品的量值傳遞研究，開展了相關性分析并初步確定了水煎液、基準樣品的質(zhì)量波動范圍，為后續(xù)TSD制劑生產(chǎn)奠定了基礎。

在藥材產(chǎn)地選擇方面，2020年11月，國家藥品審評中心發(fā)布《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》，指出“應對藥材進行資源評估”“確定優(yōu)質(zhì)藥材的產(chǎn)地、生長年限、采收期、產(chǎn)地加工等信息”“鼓勵使用優(yōu)質(zhì)藥材為原料進行研究和生產(chǎn)”。課題組前期已針對TSD 6味藥的產(chǎn)地等信息進行了考證，并對3個產(chǎn)地（藥材的產(chǎn)地在道地產(chǎn)區(qū)和/或主產(chǎn)區(qū)中選擇）共18個批次藥材的質(zhì)量進行研究分析，確定了優(yōu)質(zhì)藥材的產(chǎn)地等信息。最后選取購買了15批次確定產(chǎn)地等信息的優(yōu)質(zhì)藥材，開展此次TSD基準樣品量值傳遞研究。

本實驗通過特征圖譜量值傳遞研究發(fā)現(xiàn)，大部分特征峰在藥材、飲片、水煎液與基準樣品間可以較為完整地傳遞。水煎液至基準樣品的傳遞過程中除藁本內(nèi)酯外，各成分相對峰面積的比例關系相似，說明特征圖譜能夠在水煎液-基準樣品過程中較為穩(wěn)定傳遞。藁本內(nèi)酯是當歸、川芎揮發(fā)油中的主要藥效成分，具有擴張血管、抑制血小板聚集和血栓形成、鎮(zhèn)痛等藥理作用[17]。本研究中，在基準樣品中未檢測到藁本內(nèi)酯，說明從水煎液–基準樣品制備過程中，藁本內(nèi)酯大量損失，且高效液相色譜儀有一定的檢測限，故未能檢測出藁本內(nèi)酯。經(jīng)典名方制劑研發(fā)，要求“遵古”，《婦科冰鑒》中記載其制備方法為“水煎溫服”，與大多數(shù)“水煎”的經(jīng)典名方一樣，本研究采用了水煎煮的制備方法，未進行揮發(fā)油或蒸餾液的收集，藁本內(nèi)酯在濃縮和干燥過程中損失較大[18]。因而，后續(xù)研究中，需重點關注藁本內(nèi)酯等揮發(fā)性成分的傳遞特征，必要情況下對制劑工藝進行合理優(yōu)化和調(diào)整。

關于含量測定指標成分的選擇，本文基于課題組前期質(zhì)量標志物的篩選[12]確定地黃苷D、阿魏酸、苦杏仁苷、芍藥苷、羥基紅花黃色素A 5個成分作為含量測定指標成分探索TSD量值傳遞規(guī)律。同時這5個成分也是《中國藥典》2020年版中規(guī)定的含測指標成分[19]。地黃苷D作為《中國藥典》2020年版首次收載的含測指標成分，在地黃的炮制加工過程中較梓醇穩(wěn)定，且含量較高，特征明顯，更適宜作為質(zhì)量控制標準物質(zhì)[20]，現(xiàn)代藥理學研究也表明其具有補血和降血糖等藥理作用，是地黃的藥效成分[21]；阿魏酸是當歸和川芎的有效成分，具有抗氧化和抗血小板凝聚等作用[22]；芍藥苷作為白芍的主要成分，具有補血、調(diào)節(jié)人體免疫功能等作用[23]；桃仁主要藥效成分苦杏仁苷具有抗凝血及鎮(zhèn)痛等作用[24]；羥基紅花黃色素A是紅花功效成分且含量較高，具有抗血小板聚集等藥理作用[25]。

5個成分的量值傳遞研究發(fā)現(xiàn)，部分批次藥材至飲片的成分轉移率超過100%，可能是從藥材到飲片的炮制過程中存在雜質(zhì)、藥材碎屑、水分的減少，計算時未考慮到炮制過程飲片的得率。同時，炮制過程中部分批次藥材至飲片芍藥苷和苦杏仁苷的轉移率出現(xiàn)離散值，提示芍藥苷和苦杏仁苷是炮制過程中應重點關注的成分。芍藥苷、苦杏仁苷均易溶于水，有研究表明浸泡過程對白芍中芍藥苷、桃仁中苦杏仁苷的含量影響較大[26-27]，故2種藥材均不宜久泡。針對本研究購買的15批白芍藥材的性狀情況，不同批次的白芍軟硬程度不一，桃仁種皮剝落難易程度不一，故在相同的浸泡時間下，成分浸出損失的程度不一。此前該炮制工藝已經(jīng)過企業(yè)驗證，炮制出的飲片也經(jīng)過質(zhì)檢部門檢驗合格，此次量值傳遞研究提示在飲片炮制環(huán)節(jié)還應重視浸泡時間、藥材性狀對飲片質(zhì)量的影響，考慮是否根據(jù)實際情況調(diào)整浸泡時間，或將不同批次的藥材勾兌后投料，確保后續(xù)飲片和制劑質(zhì)量的均一和穩(wěn)定。

飲片至水煎液的傳遞過程中，成分的轉移率未出現(xiàn)離散值，說明煎煮過程成分的含量轉移較穩(wěn)定，煎煮過程對成分的影響較小。水煎液–基準樣品指標性成分轉移率結果中，除阿魏酸、羥基紅花黃色素A外，另3個成分均有少量批次的轉移率不在均值的70%～130%，說明其他成分受濃縮、干燥過程有一定影響。一方面可能是TSD君藥地黃含有大量多糖，在水煎液制備成基準樣品的過程中，由于溶液的不斷濃縮，溶液黏度增大，成分分布可能不均勻；另一方面干燥后的浸膏中會析出大量的糖晶，經(jīng)粉碎后仍有細小糖晶微粒，可能也是造成成分分布不均的主要原因。在基準樣品的干燥方法選擇時，課題組考慮到與企業(yè)工業(yè)生產(chǎn)的銜接，采用低溫減壓干燥方法，出現(xiàn)個別批次離散度超出規(guī)定范圍，表明減壓干燥方法能夠基本確?；鶞蕵悠焚|(zhì)量穩(wěn)定性，但是制劑工藝過程中需要嚴格控制相關參數(shù)，并動態(tài)監(jiān)控成分含量。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis on quality and value transmitting of classical formula Taohong Siwu Decoction based on feature chromatogram and content of five components

DU Ke-qun1, CHENG Yan-fen1, LI Min-min1, JIANG Hua-juan1, MA Chuan1, HUANG Cheng-wu2, ZHANG Yu-bin2, WANG Tuan-jie3, 4, HE Yao1, FU Chao-mei1

1. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Standardization of the Ministry of Education, Chengdu 611137, China 2. Guizhou Yibai Pharmaceutical Co., Ltd., Guiyang 550008, China 3. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 4. State Key Laboratory of New-Tech of Traditional Chinese Medicine Preparation Process, Lianyungang 222001, China

Exploring the whole process quality transmission rule of herb-herbal pieces-water decoction-benchmark sample of Taohong Siwu Decoction (TSD, 桃紅四物湯), so as to provide a basis for the quality control of classic formula preparations.A total of 15 batches of TSD water decoction and benchmark sample were prepared, UPLC characteristic chromatograms were established, and the contents of five components were determined by HPLC method, and the transfer rates of each component during the transmission of herb-herbal pieces-water decoction-benchmark samples were calculated.The similarity of 15 batches of water decoction and benchmark sample > 0.9, 20 common peaks were assigned, and 11 peaks were identified by comparison with reference substances, including gallic acid, rehmannioside D, amygdalin, chlorogenic acid, paeoniflorin, hydroxysafflor yellow A, ferulic acid, verbascoside, quercetin, benzoylpaeoniflorin, ligustilide. The mass fraction of the five components in the water decoction and benchmark samples were respectively: rehmannioside D were 0.26—0.46, 0.11—0.30 mg/g, ferulic acid were 0.33—0.51, 0.09—0.18 mg/g, paeoniflorin were 1.07—2.43, 0.48—1.49 mg/g, amygdalin were 1.66—2.31, 0.60—1.58 mg/g, hydroxysafflor yellow A were 0.98, 0.26—0.44 mg/g. The average transfer rates of herb to herbal pieces, herbal pieces to water decoction and water decoction to benchmark sample were respectively: rehmannioside D were 101.50%, 55.44%, 64.11%; ferulic acid were 94.31% [Danggui () to herbal pieces], 93.91% [Chuanxiong () to herbal pieces), 37.24% and 35.61%; paeoniflorin were 111.55%, 72.80% and 63.48%, amygdalin were 117.34%, 91.78% and 64.60%, and hydroxysafflor yellow A were 93.64%, 60.23% and 34.19%.Using UPLC characteristic chromatogram and content determination of five components, to analyze the value transmission rule of TSD herb-herbal pieces-water decoction-benchmark sample, providing scientific basis for the development and quality control of classic formula.

classic formula; Taohong Siwu Decoction; benchmark sample; characteristic chromatogram; content determination; quantity and value transfer; gallic acid; rehmannioside D; amygdalin; chlorogenic acid; paeoniflorin; hydroxysafflor yellow A; ferulic acid; verbascoside; quercetin; benzoylpaeoniflorin; ligustilide; UPLC; HPLC; quality control

R283.6

A

0253 - 2670(2022)22 - 7058 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.009

2022-06-08

四川省科技計劃項目（2021YFS0256）；四川省科技計劃項目（2020YFS0567）；中藥制劑過程新技術國家重點實驗室開放基金資助項目（SKL2020Z0305）

杜克群，碩士研究生，主要從事新制劑、新劑型、新工藝研究。E-mail: 751250966@qq.com

何 瑤，副教授，主要從事新制劑、新劑型、新工藝研究。E-mail: 20660306@qq.com

傅超美，教授，主要從事新制劑、新劑型和中藥炮制工藝與機制研究。E-mail: chaomeifu@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]