不同干燥方式對石榴皮單寧提取液抑菌效果的研究

李 敏，曾宇玲，錢玉梅，趙 芳

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州 234000）

0 引言

石榴（Punica granatum）為桃金娘科番石榴屬落葉灌木或小喬木植物。早在西漢劉歆撰寫《西京雜記》記載“安石榴楟十株”，因此又稱安石榴，由原產地中亞地區(qū)阿富汗等國經絲綢之路引種至中國，迄今已有2 000 多年的栽培歷史。石榴樹對栽培環(huán)境要求低和易管理等優(yōu)點，促使其在我國各地均有種植，尤其安徽、江蘇和河南等省，產地以豐富種質資源、高品質和產量聞名國內外。石榴果實外觀鮮艷，其果肉富含維C、多酚、黃酮和花青素類等營養(yǎng)成分且風味酸甜爽口，再加上民間寓意吉祥，廣受消費者喜愛[1]。通常人們僅取果肉食用，而將占石榴果實20%～30%的果皮部位作為廢棄物扔掉，使石榴資源得不到充分利用，浪費了石榴中的有效成分。大量研究表明，石榴皮中富含多酚、多糖、有機酸和微量元素等化學物質[2-3]，這些物質賦予其抑菌、抗氧化和抗腫瘤活性，是石榴藥理作用的物質基礎[4-5]。

近年來，石榴皮中的單寧作為一種可再生的天然多酚類聚合物，其含量、功能及應用的研究逐漸受到人們的重視，如通過抑制DNA 拓撲異構酶抑制真菌感染，可以作為除藻劑用于海水凈化，也可以作為潛在的釀酒單寧應用于釀酒生產中[6-9]。曲繼鵬等人[10]研究表明，不同干燥處理方式影響石榴皮中生物活性物質的抑菌效果。然而，有關不同干燥處理方式對石榴皮提取液單寧含量及其抑菌效果的影響未見報道。以安徽懷遠石榴皮為材料，對3 種干燥方式預處理石榴皮提取液中單寧含量及其抑菌效果進行研究，將為石榴皮進一步開發(fā)和研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和預處理

從安徽懷遠石榴園中購置市售常見“白花玉石籽”石榴，挑選果皮無損傷和無疤痕新鮮優(yōu)果。將石榴果皮剝下后分別置于室外陽光下（自然曬干）、50 ℃恒溫干燥烘箱（恒溫烘干）和微波爐中（微波干燥）調節(jié)溫度進行干燥處理，以上3 種處理方式均將石榴果皮干燥達到恒質量。

1.2 試劑與器材

試劑：試劑主要為丙酮，國藥試劑提供；氯化銨，國藥試劑提供；乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2），為分析純。

儀器：自動壓力蒸汽滅菌器、高速多功能粉碎機、電熱恒溫鼓風干燥箱、微波爐等。

1.3 試驗方法

1.3.1 石榴皮單寧提取物的制備

采用高速多功能粉碎機將干燥的石榴皮粉碎，收集過60 目篩的石榴皮粉末用于單寧的提取。參照任平等人[11]研究方法對石榴皮單寧進行提取。具體操作如下：稱取石榴皮粉末0.5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，按照料液比為1∶20 加入60%丙酮溶液，并將圓底燒瓶置于80 ℃水浴鍋中浸提，期間進行多次振蕩。浸提3 h 后取出圓底燒瓶室溫放置冷卻，后置于離心管中，以轉速5 000 r/min 離心10 min，取上清液，殘渣按照以上步驟重復提取2 次，最后合并上清液為石榴皮單寧提取液。以上均做3 個生物學重復。

1.3.2 石榴皮單寧提取液含量的測定

參考舒楊雄等人[12]研究方法測定石榴皮中單寧的含量。具體操作如下：將石榴皮單寧提取液置于25 mL 刻度試管中，并于35 ℃恒溫水浴加熱。另外，取濃度為1 mol/L 的乙酸鋅溶液1 mL 和飽和氨水溶液0.7 mL 加入錐形瓶中進行搖勻，一直搖至白色溶液全部溶解后進行冷卻濾過。然后取濾液1 mL置于錐形瓶中，加入NH4Cl-NH3·H2O 緩沖液1.25 mL（pH 值10）、鉻黑T 指示劑溶液0.05 mL 和蒸餾水15 mL，再以0.005 mol/L 的EDTA（Na2）標準溶液進行滴定，當溶液由酒紅色變?yōu)樗{色時即為滴定終點。按照以下公式進行計算。

式中：0.155 6——試驗所得的比例常數(shù)；

V——1 mol/L 醋酸鋅標準溶液的絡合沉淀消耗量，mL；

M——樣品質量，g。

以上均做3 個生物學重復。

1.3.3 石榴皮單寧提取液抑菌效果的研究

（1）供試菌株來源及活化。試驗使用2 種菌株即大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus），均由宿州學院生物與食品工程學院微生物實驗室提供。在無菌操作條件下，用接種環(huán)在供試菌種的斜面上輕挑單個菌落置于液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，然后放入搖床恒溫37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。

（2）石榴皮單寧提取液的抑菌效果研究。采用牛津杯法研究石榴皮單寧提取液的抑菌效果，具體操作如下：用牛津杯法進行抑菌效果的測定。用無菌鑷子夾取已滅菌烘干的牛津杯，放置到已涂布菌液的培養(yǎng)皿表面，分別向每個牛津杯里加入0.2 mL不同單寧質量濃度（4.28，2.14，1.07，0.54，0.27，0.14 mg/mL）石榴皮提取溶液，用60%丙酮溶液為對照。每組做3 個平行，每個培養(yǎng)皿里放3 個牛津杯。置于37 ℃恒溫下培養(yǎng)24 h 后，用直尺測量抑菌圈大小，重復試驗3 次，取平均值，扣除對照抑菌圈值，以菌落形成的最小單寧濃度為最小抑菌濃度（MIC），用MIC 判斷抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 不同干燥方式對石榴皮外觀的影響

分別用自然曬干、烘箱烘干和微波烘干3 種方式對石榴皮進行干燥處理。

不同干燥方式對石榴皮外觀的影響見圖1。

圖1 不同干燥方式對石榴皮外觀的影響

由圖1 可知，石榴皮經自然曬干，顏色較淺，整體褐化程度較低；經鼓風干燥箱烘干的石榴皮，顏色很深，褐化現(xiàn)象嚴重；經微波烘干的石榴皮，顏色較深，雖褐化現(xiàn)象不嚴重，但出現(xiàn)石榴皮焦化現(xiàn)象。試驗結果表明，石榴皮在自然曬干下對外觀影響最小，褐化程度最低。

2.2 不同干燥方式對石榴皮提取液中單寧含量的影響

采用60%丙酮作為提取溶劑，分別對自然曬干、烘箱烘干、微波烘干的干燥方式獲得的石榴皮粉末進行浸漬提取，提取時間3 h。

不同加工方式對石榴皮中單寧含量的測定見表1。

由表1 可知，3 種不同的干燥方式對石榴皮中單寧的提取效果有所不同，在自然曬干條件下，單寧提取含量最高，為21.37%；其次為鼓風干燥箱烘干加工方式，提取單寧含量為20.88%；微波烘干條件下提取單寧含量最低，為19.73%。

表1 不同加工方式對石榴皮中單寧含量的測定 /%

2.3 不同干燥方式的石榴皮中單寧提取液抑菌效果的研究

試驗采用MIC 值判斷不同干燥方式條件下，石榴皮中單寧提取液抑菌的效果。

不同干燥方式的石榴皮中單寧提取液抑菌效果的研究見表2。

表2 不同干燥方式的石榴皮中單寧提取液抑菌效果的研究 /mg·mL-1

由表2 可知，3 種干燥方式預處理石榴皮中的單寧提取液對S.aureus（革蘭氏陽性菌G+）的抑菌MIC 值均為0.27 mg/mL，對大腸桿菌E.coli 抑菌MIC 值為1.07 mg/mL，可以判斷石榴皮單寧提取液對S.aureus 的抑菌效果顯著高于E.coli；對于同種菌株，3 種干燥方式預處理石榴皮的單寧提取液抑菌效果無明顯差異。

3 結論

安徽懷遠地區(qū)產的石榴以品種優(yōu)良聞名國內外，被列為國家地理標志性產品。隨著生活水平的提高，人們對石榴果實消費量逐年增加，急需對廢棄的石榴皮功能性物質采取有效手段進行開發(fā)與應用，以解決資源利用不充分的問題。研究結果表明，石榴皮中單寧的含量較高，與烘箱烘干和微波烘干比較，自然曬干對石榴皮外觀影響較小且單寧提取含量最高（21.37%±0.02%）；3 種干燥處理石榴皮單寧提取液對金黃色葡萄球菌（S.aureus）抑制效果明顯優(yōu)于對大腸桿菌（E.coli）抑制效果，且抑制效果不受干燥方式的影響。因此，可以采用自然曬干方式對石榴皮進行干燥，且有利于石榴皮單寧提取。