CAR-T治療非霍奇金淋巴瘤的抵抗機制與挽救策略

顏欣 韓為東

近年來，嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法已經(jīng)成為多次標準治療失敗惡性血液系統(tǒng)腫瘤患者的新的挽救治療方法。到目前為止，CAR-T已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于治療包括B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)和彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)在內(nèi)的多種血液系統(tǒng)腫瘤。盡管CAR-T取得突破性進展，但仍有部分患者對這種治療產(chǎn)生了原發(fā)或繼發(fā)抵抗[1-2]。除了腫瘤外部的因素包括T細胞耗竭、T細胞長期存活減少和免疫抑制腫瘤微環(huán)境等可導致CAR-T療法失敗之外，近期越來越多的學者開始關(guān)注腫瘤細胞對于CAR-T治療不敏感(腫瘤細胞固有抵抗)的原因。為此，我們總結(jié)了近年來CAR-T治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)的腫瘤細胞固有抵抗機制并討論相應(yīng)的挽救策略。

一、靶抗原的丟失

靶抗原丟失是目前研究最廣泛和明確的腫瘤細胞逃逸CAR-T治療的機制[3]。對于DLBCL,約有1/3復(fù)發(fā)患者可出現(xiàn)CD19丟失或下調(diào)[3-6]。目前已報道的解釋抗原陰性復(fù)發(fā)的機制包括預(yù)先存在的抗原陰性腫瘤細胞、突變或剪接變異、影響靶抗原表達的成熟/運輸、表位掩蔽和譜系轉(zhuǎn)換等[7]。最近，Heard等[8]在細胞和小鼠水平發(fā)現(xiàn)B細胞NHL(B-NHL)中高爾基體駐留的膜內(nèi)蛋白酶信號肽酶樣3(SPPL3)的表達是CAR-T治療抵抗的重要調(diào)節(jié)因子。SPPL3的缺失可導致CD19糖基化過度，直接抑制CAR-T抗腫瘤細胞毒性。同時，SPPL3的過表達可能由于CD19蛋白被扣留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能到達膜表面，從而出現(xiàn)抗原丟失，進而導致腫瘤細胞抵抗CAR-T治療。

在CD19陰性或低表達復(fù)發(fā)的情況下，B-NHL細胞可以保留其他B細胞的標志物，如CD22、CD20或CD70a。因此開發(fā)靶向兩種或多種抗原的CAR-T可用于預(yù)防和治療靶抗原陰性逃逸[9]。本項目組前期采用串聯(lián)結(jié)構(gòu)CD19-CD20雙靶點CAR-T治療87例復(fù)發(fā)難治性B-NHL，臨床試驗結(jié)果顯示完全緩解(CR)率可達70%，同時中位無進展生存期(PFS)達27.7個月，抗原陰性復(fù)發(fā)比例僅為5.7%(5/87)[10-11]。以不依賴抗原的方式殺死腫瘤細胞或提高靶抗原的表達也有助于解決抗原陰性復(fù)發(fā)。增加CD40L組成表達的CAR-T不僅可通過直接細胞毒性殺傷CD40+腫瘤細胞，還可與抗原提呈細胞的CD40結(jié)合，從而增加抗原呈遞作用，以招募更多的內(nèi)源性效應(yīng)細胞發(fā)揮非靶抗原依賴的T細胞受體(TCR)介導的細胞殺傷作用[12]。小分子γ分泌酶抑制劑和苔蘚蟲素1也在臨床前研究中被發(fā)現(xiàn)可提高癌細胞的靶抗原表達[13-14]。

二、干擾素(IFN)-γ信號通路異常

已有相關(guān)報道缺失IFN-γ信號與黑色素瘤細胞抵抗免疫檢查點抑制劑有關(guān)[15]。本項目組通過全基因組CRISPR/Cas9文庫發(fā)現(xiàn)多種調(diào)控IFN-γ信號通路基因(包括JAK1、JAK2、STAT1、IFNGR1或IFNGR2)缺失的腫瘤細胞可逃逸CAR-T治療[16]。除此之外，其他多個團隊也發(fā)現(xiàn)IFN-γ信號通路異?？捎绊慍AR-T療效。Larson等[17]通過全基因組CRISPR/Cas9文庫發(fā)現(xiàn)IFN-γ信號通路基因(包括IFNGR1、JAK1或JAK2)的缺失使膠質(zhì)母細胞瘤和其他實體腫瘤對CAR-T的殺傷更具抵抗性。Haynes等[18]發(fā)現(xiàn)與野生型CAR-T相比，IFN-γ缺陷型CAR-T對結(jié)腸癌小鼠移植瘤的腫瘤控制效果較差。Arenas等[19]發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞JAK2的下調(diào)可導致腫瘤細胞對靶向HER2的CAR-T產(chǎn)生繼發(fā)性抵抗。Jain等[20]發(fā)現(xiàn)在DLBCL腫瘤中IFN-γ信號與包括程序性死亡配體1(PD-L1)在內(nèi)的多個檢查點配體的表達相關(guān)，且腫瘤患者的IFN-γ信號較高與CAR-T擴增下降相關(guān)。

增加CAR-T分泌IFN-γ可能有助于提高CAR-T療效，Avanzi等[21]設(shè)計了分泌IL-18的TRUCKs CAR-T，其既可增加IFN-γ的分泌，還可調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的IFN-γ信號通路，以增強內(nèi)源性抗腫瘤的免疫反應(yīng)。

三、凋亡信號異常

在CAR-T殺傷腫瘤細胞時，腫瘤細胞自身執(zhí)行凋亡異?？蓪е翪AR-T療法的失敗。CAR-T依賴3種途徑殺死靶細胞：一種是T細胞通過分泌顆粒酶和穿孔素來觸發(fā)線粒體參與的內(nèi)源性凋亡通路[22]；另一種是死亡受體啟動的外源性凋亡通路，又稱為死亡受體凋亡通路；此外還有細胞因子依賴途徑[23]。

為了系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞抵抗CAR-T治療的腫瘤固有因素，近期本項目組通過全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選技術(shù)，以人B淋巴白血病細胞(Nalm6)為模型，進行低效靶比、長時間的Nalm6細胞與CD19 CAR-T共培養(yǎng)，挖掘參與B-NHL抵抗CAR-T治療的關(guān)鍵功能基因[16]。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞NOXA基因缺失可導致腫瘤細胞逃逸CAR-T療法。NOXA蛋白被稱為誘導細胞凋亡的增敏劑，是一種促細胞凋亡的B淋巴細胞瘤(BCL)-2家族蛋白[24]。本項目組在體內(nèi)和體外水平發(fā)現(xiàn)B-NHL中NOXA缺失可阻礙CAR-T誘導靶細胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡，從而導致腫瘤細胞抵抗CAR-T治療[16]?；仡櫺苑治鼋Y(jié)果提示，NOXA在約38%的NHL患者腫瘤中表達缺失或低下[免疫組織化學(IHC)評分<4分]，約70%NOXA低表達的NHL患者在6個月內(nèi)發(fā)生疾病進展，而僅有15%NOXA高表達患者在6個月內(nèi)發(fā)生疾病進展[16]。更重要的是，本項目組在細胞及動物水平也發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑可上調(diào)腫瘤細胞NOXA的蛋白水平，從而逆轉(zhuǎn)患者對CAR-T治療的抵抗。這一研究成果提示NHL患者腫瘤樣本的NOXA表達可用于預(yù)測CAR-T療效并對患者分層治療，NOXA低表達患者可嘗試HDAC抑制劑聯(lián)合CAR-T療法。

在CAR-T接觸靶細胞后，CAR參與誘導Fas配體(FasL)和腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TRAIL)表達的上調(diào)，使CAR-T能夠利用死亡受體途徑以抗原依賴性和非依賴性的方式殺死腫瘤細胞。Upadhyay等[25]在細胞及動物水平發(fā)現(xiàn)使用抗FasL抗體或Fas缺陷靶細胞來破壞死亡受體途徑后可導致CAR-T引發(fā)的腫瘤細胞抗原依賴性凋亡和非抗原依賴性的旁觀者凋亡減少；同時還發(fā)現(xiàn)，在ZUMA-1臨床試驗中，腫瘤樣本Fas高表達的NHL患者在輸注CAR-T后經(jīng)歷了更持久的臨床應(yīng)答和更長的生存時間；更重要的是，他們發(fā)現(xiàn)凋亡抑制因子(IAP)和抗凋亡髓系細胞白血病1(MCL1)蛋白的抑制劑可提高靶細胞和旁觀者腫瘤細胞對CAR-T介導的Fas依賴性殺傷的敏感性，可作為聯(lián)合CAR-T療法的候選藥物。

Singh等[26]通過CRISPR文庫篩選發(fā)現(xiàn)死亡受體凋亡通路受損是B-ALL患者原發(fā)抵抗CAR-T療法的新機制。在體外實驗通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除腫瘤細胞促凋亡基因FADD、BID、CASP8和TNFRSF10B后，腫瘤細胞可抵抗CAR-T殺傷。相反，敲除抗凋亡基因(如CFLAR、TRAF2和BIRC2)可提高腫瘤細胞對CAR-T殺傷的敏感性。他們發(fā)現(xiàn)在靶抗原持續(xù)存在時，死亡受體信號受損的腫瘤細胞可導致CAR-T發(fā)生進展性功能障礙。通過對兩項臨床試驗中CAR-T治療B-ALL患者骨髓標本的轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，死亡受體信號評分下降患者體內(nèi)CAR-T擴增減少，輸注CAR-T后總生存期(OS)縮短。Dufva等[27]通過對高通量藥物篩選和全基因組CRISPR文庫篩選也發(fā)現(xiàn)FADD和TNFRSF10B缺失可導致腫瘤細胞抵抗CAR-T療法，同時還發(fā)現(xiàn)IAP抑制劑(birinapant，AT-406和LCL-161)可顯著增強CAR-T毒性。

TP53基因改變是復(fù)發(fā)難治性侵襲性B-NHL患者預(yù)后不佳的因素之一[28]。Shouval等[29]通過對輸注CAR-T患者的腫瘤組織進行靶向二代測序，發(fā)現(xiàn)37%的B-NHL患者可發(fā)生TP53異常[突變和(或)拷貝數(shù)改變]，同時TP53異常與較低的CR、OS率相關(guān)。TP53異?；颊?年OS率為44%，遠低于野生型患者(76%)。TP53異常導致腫瘤細胞抵抗CAR-T治療機制可能與IFN-γ信號和凋亡信號通路受損及浸潤的CAR-T減少有關(guān)。最近，Wei等[30]研究發(fā)現(xiàn)抗CD19和抗CD22 CAR(CAR19/22) T細胞雞尾酒療法對于TP53異常復(fù)發(fā)難治性B-NHL有效，同時將CAR-T治療與自體干細胞移植相結(jié)合可進一步改善這些患者的長期預(yù)后，最佳客觀緩解率(ORR)可達92.9%，2年P(guān)FS和OS率分別為77.5%和89.3%。

四、黏附分子表達異常

最近，本項目組通過全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選發(fā)現(xiàn)B-NHL細胞CD81和CD58的缺失可介導腫瘤細胞逃逸CAR-T治療[31]。CD81的缺失可阻止CD19成熟和運輸至細胞膜上，已被證實是抵抗靶向CD19治療的機制之一[32]。CD58是人類T細胞CD2分子的配體，在天然細胞毒性T淋巴細胞(CTL細胞)中，CD58與CD2的相互作用可促進T細胞和抗原提呈細胞之間形成免疫突觸，增強TCR與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原肽的結(jié)合，為T細胞增殖、細胞因子的產(chǎn)生和激活提供了必要的共刺激信號[33]。

本項目組觀察到兩種B-NHL細胞系的CD58缺失對多種CAR-T治療產(chǎn)生抵抗。此外，我們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中CD58缺失導致其與CAR-T接觸不良，形成受損的免疫突觸，CAR信號激活減弱，從而導致CAR-T功能障礙，主要表現(xiàn)為CAR-T增殖減慢、脫顆粒減少、細胞因子分泌減少、細胞不良反應(yīng)降低及CAR-T死亡增多等。最近，Romain等[34]和Majzner等[35]均發(fā)現(xiàn)在接受CD19 CAR-T治療的復(fù)發(fā)難治性B-NHL患者中，治療前腫瘤樣本中CD58高表達患者顯示出對CAR-T治療的高CR率和高生存率。B-NHL患者CD58的基因突變具有種族差異影響，在西方國家的B-NHL患者中，CD58基因的遺傳缺失率約為20%，蛋白表達下降的發(fā)生率約為67%[36]；然而我國B-NHL患者CD58基因突變率僅約5%～10%[37-38]，遠低于西方人群。

Majzner等[35]提出CD58-CD2相互作用的受損可通過整合CD2共刺激結(jié)構(gòu)域的二代CAR-T進行挽救，然而這種新型CAR-T僅在細胞實驗和小鼠實驗中表現(xiàn)出增強的療效，尚未在患者中測試。CD58的表達可受遺傳和表觀調(diào)控[36]，選擇合適的表觀遺傳調(diào)節(jié)劑提高CD58的表達可能有助于逆轉(zhuǎn)CAR-T治療抵抗。

五、抑制性配體的表達

抑制性配體PD-L1和PD-L2可由腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中其他細胞表達，這些配體在與其受體[即程序性死亡受體1(PD-1)]結(jié)合時可阻止CAR-T活化，從而導致免疫逃逸。Neelapu等[39]發(fā)現(xiàn)在ZUMA-1試驗中，Axi-Cel治療后21例B-NHL患者出現(xiàn)疾病進展，其中13例表達PD-L1，提示B-NHL患者PD-L1高表達可作為CAR-T療效差的預(yù)測標志物。近期，本項目組分析了5例復(fù)發(fā)難治性B-NHL患者在CAR-T輸注后復(fù)發(fā)或進展后給予抗PD-1治療，其中3例出現(xiàn)應(yīng)答[2例CR,1例部分緩解(PR)],2例患者出現(xiàn)疾病進展。腫瘤標本免疫組織化學檢測顯示，PD-1/PD-L1在抗PD-1治療有應(yīng)答反應(yīng)患者中的表達水平高于無應(yīng)答反應(yīng)患者。因此，本項目組提出，對于CAR-T治療失敗后復(fù)發(fā)難治性B-NHL患者，如果腫瘤細胞表達PD-L1，腫瘤浸潤性T細胞中PD-1水平較高，則釋放對免疫檢查點的抑制可能有助于增效CAR-T治療[40]。

六、總結(jié)

發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞抵抗CAR-T治療的機制對于開發(fā)提高CAR-T療效的策略具有關(guān)鍵的指導意義。靶抗原的丟失是研究最廣泛的CAR-T治療抵抗機制，現(xiàn)在已開發(fā)包括多靶點抗原的CAR-T來克服和預(yù)防由于靶抗原的丟失帶來的治療抵抗問題。最近，腫瘤細胞逃逸CAR-T殺傷的其他機制，如IFN-γ信號通路異常、凋亡信號的異常、黏附分子的缺失及抑制性配體的表達增高也逐漸被發(fā)現(xiàn)，盡管針對這些新發(fā)現(xiàn)的抵抗機制都有相應(yīng)的策略進行規(guī)避，但這些策略大多數(shù)都處于臨床前階段，仍需要應(yīng)用于更多的患者并進行評價。最后，隨著CAR-T廣泛的商品化應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)患者對于CAR-T的抵抗機制有助于精準預(yù)測CAR-T療效并設(shè)計合適的產(chǎn)品提高其療效。