金銀花主要活性成分及內(nèi)生菌研究進(jìn)展

姜茗軒，張紅兵，李 冉，賈振華，3

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué),河北 石家莊 050062;2.河北省科學(xué)院生物研究所,河北 石家莊 050081；3.巨鹿縣應(yīng)用技術(shù)研究院，河北 巨鹿 055250)

金銀花也稱忍冬，最早記載于《名醫(yī)別錄》，是我國的傳統(tǒng)中草藥，廣泛種植于河北、河南、山東、甘肅等地[1]。金銀花根、莖、葉、花、種子可代謝產(chǎn)生酚類、黃酮類、皂苷類等活性物質(zhì)，具有清熱解毒、利膽健脾、保護(hù)肝臟、抗氧化、抗病毒的功效[2-3]。綠原酸和木犀草苷是其主要代謝活性物質(zhì)，也是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的首要指標(biāo)[4]。金銀花的花通常配伍多種中藥中，用于治療呼吸道疾病、痢疾、瘡瘍、頭痛發(fā)熱等多種疾病[5-6]。除作為傳統(tǒng)中藥材外，還可應(yīng)用于食品生產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖及化工產(chǎn)業(yè)。

植物內(nèi)生菌可進(jìn)入植物宿主維管組織，在與宿主長時(shí)間的協(xié)同進(jìn)化過程中，可產(chǎn)生與宿主植物活性成分結(jié)構(gòu)相似或相同的化合物、或激素抗生素等代謝物質(zhì)。這些代謝產(chǎn)物可刺激宿主生成更多的活性產(chǎn)物或其關(guān)鍵酶[7-8]。植物產(chǎn)生有效成分是植物生理狀態(tài)的最佳體現(xiàn)形式，是應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的脅迫手段，而內(nèi)生微生物與植物可共同調(diào)控有效代謝物的產(chǎn)生[9]?；趦?nèi)生菌易培養(yǎng)、有效成分獲得成本低廉等優(yōu)勢(shì)，采用基因克隆技術(shù)對(duì)其合成途徑關(guān)鍵酶基因進(jìn)行克隆、或通過微生物發(fā)酵等技術(shù)生產(chǎn)目的產(chǎn)物，在一定程度上減少了對(duì)藥材的依賴，為藥物生產(chǎn)提供新的途徑[10]。將特定功效的內(nèi)生菌應(yīng)用于生物防治、植物生長及有效成分的生物合成，為無公害生物菌劑的開發(fā)提供寶貴資源。本文對(duì)金銀花主要活性物質(zhì)綠原酸和木犀草苷活性及機(jī)理進(jìn)行總結(jié)，綜述了金銀花內(nèi)生菌篩選、內(nèi)生菌應(yīng)用相關(guān)方面的研究進(jìn)展，以期為藥用植物資源的綜合利用提供參考。

1 金銀花主要活性成分

金銀花分為野生型和人工型，宋代《蘇沈內(nèi)翰良方》是最早記載人工栽培金銀花的書籍[11]。目前，金銀花在不同產(chǎn)區(qū)形成了種類豐富的人工培育品種[11-14]，見表1。綠原酸和木犀草苷作為其主要活性物質(zhì)，其含量及活性程度受產(chǎn)地、光照、生長溫度、pH、土壤條件、農(nóng)藥使用情況、采摘時(shí)間等多方面影響而有所不同。因此，不同產(chǎn)地和品種間活性成分的差異成為廣大學(xué)者的研究熱點(diǎn)。姜建輝等人[15]檢測(cè)了北川引種的金銀花藥材，發(fā)現(xiàn)其綠原酸、木犀草苷含量均高于《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。劉天亮等人[16]對(duì)不同產(chǎn)地金銀花活性成分進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)山東金銀花中綠原酸、木犀草苷含量高于河南、河北地區(qū)。

表1 金銀花特色品種及產(chǎn)地

圖1 綠原酸化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1.1 綠原酸

綠原酸(Chlorogenic acid)又名3-咖啡?？鼘幩幔哂兄参稂S金的美譽(yù)，是金銀花主要的有機(jī)酸類活性物質(zhì)，結(jié)構(gòu)如圖1所示。綠原酸的天然來源主要分布在杜仲的樹皮、向日籽、金銀花花蕾及咖啡豆中[6]。金銀花中綠原酸含量以花中最多，葉次之，莖中最少[17]。綠原酸已被證實(shí)具有抗氧化、抑菌、降脂降糖、抗腫瘤等多種活性及作用機(jī)制[18-24]，見表2。

表2 綠原酸活性及作用機(jī)制

1.2 木犀草苷

木犀草甘(Luteoloside)又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷，是天然黃酮類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2。忍冬科植物的花蕾和葉片部分是木犀草苷的天然生物來源，以金銀花中含量居多，是金銀花質(zhì)量檢測(cè)的兩個(gè)主要指標(biāo)之一。木犀草苷主要功效為抗毒消炎、抗氧化、抗腫瘤及保護(hù)心腦血管，其活性及作用機(jī)制[25-28],見表3。

圖2 木犀草苷化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

表3 木犀草苷活性及作用機(jī)制

2 金銀花內(nèi)生菌及其多樣性

金銀花品系間的差異與其內(nèi)生菌多樣性密切相關(guān)，分離組織部位不同，種群、類型及數(shù)量也有所不同。目前已篩選并鑒定的金銀花內(nèi)生菌見表4，分為細(xì)菌和真菌，涉及14個(gè)屬，但未見內(nèi)生放線菌的相關(guān)報(bào)道。內(nèi)生細(xì)菌均為芽孢桿菌屬，內(nèi)生真菌以鐮孢屬、鏈格孢屬、木霉屬居多。

金銀花內(nèi)生菌大多具有廣譜抑菌活性，孫力軍等人[29]從金銀花組織中篩選出一株內(nèi)生多粘類芽胞桿菌對(duì)藤黃微球菌、酒精酵母、香蕉炭疽病菌、青霉、黑曲霉、黃色鐮刀霉、赤霉均具有抑制效果。李瑾等人[30]篩選出兩株內(nèi)生真菌對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸埃希氏菌具有良好的抑菌效果。劉士平等人[31]篩選出兩株抑菌效果較好的產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的金銀花內(nèi)生鐮孢菌和擬盤多毛孢菌。Zhang等人[32]從中藥植物金銀花中篩選出一株內(nèi)生鐮刀菌，其代謝產(chǎn)物對(duì)綠膿桿菌有高效抑制作用。除抑菌效果外，金銀花內(nèi)生菌還具有特殊酶活性，楊勝遠(yuǎn)等人[33]篩選出一株具有谷氨酸脫羧酶活性的內(nèi)生巨大芽孢桿菌。郭欽等人[34]篩選出一株鏈格孢屬內(nèi)生真菌，其代謝產(chǎn)物具有較高的抗單胺氧化酶活性。呂鳳霞[35]從金銀花等植株中篩選出具有纖溶酶活性多粘芽孢桿菌。金銀花內(nèi)生菌還可以產(chǎn)生其宿主活性成分，劉洋露等人[36]、邱萌霞等人[37]均篩選出產(chǎn)綠原酸的芽孢桿菌。

表4 金銀花內(nèi)生菌篩選現(xiàn)狀

3 金銀花內(nèi)生菌的應(yīng)用

3.1 生物防治

內(nèi)生菌對(duì)病原菌的生物防治涉及抗菌、競爭關(guān)系、誘導(dǎo)免疫等多種機(jī)制，是對(duì)動(dòng)植物病蟲害防治的一種具有高效性、選擇性、環(huán)保性等最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐尾呗浴?/p>

趙銀麗等人[40]將篩選出的一株金銀花內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵并對(duì)給毒后的鯉魚進(jìn)行投喂，發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)鯉魚腸道菌群、增加有益菌、使致病性降低。Cui等人[41]篩選出一株貝萊斯芽孢桿菌，可誘導(dǎo)金銀花葉片生成具有抑制病原菌物質(zhì)合成的相關(guān)酶，減少植物白粉病的發(fā)生。曹鵬飛等人[42]從金銀花等植物中篩選出一株木霉屬真菌，發(fā)現(xiàn)其可破壞楊梅枯萎病病原菌細(xì)胞壁完整性、增加細(xì)胞膜通透性、使病原菌生長受到抑制或致其死亡。Kang等人[43]篩選出一株內(nèi)生鏈霉菌，其產(chǎn)生的金霉素和別金霉素可抑制赤松線蟲的生長繁殖從而起到保護(hù)植株的作用。有研究表明植物內(nèi)生真菌和細(xì)菌可聯(lián)合作用抑制病害生長，提高宿主植物免疫力，內(nèi)生微生物的聯(lián)合作用機(jī)制是未來植物健康管理的重要方向。

3.2 生物發(fā)酵合成綠原酸

金銀花內(nèi)生菌生物發(fā)酵應(yīng)用集中于綠原酸的發(fā)酵生產(chǎn)，劉洋露等人[36]、邱萌霞等人[37]均篩選出可以產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生細(xì)菌，并進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，綠原酸產(chǎn)量最高可達(dá)24.02mg/L。此外，通過添加輔助因子與內(nèi)生菌共同發(fā)酵，提高綠原酸的產(chǎn)量。丁仁芳等人[44]利用內(nèi)生枯草芽孢桿菌和富含氨基酸、蛋白質(zhì)及礦物元素的紅薯葉粗提液共同發(fā)酵，其綠原酸產(chǎn)量每升增加55.22 mg。張楓源等人[45]利用內(nèi)生枯草芽孢桿菌與金銀花蒸餾殘液共同發(fā)酵，優(yōu)化工藝后，綠原酸每升可增產(chǎn)193mg。

3.3 生物催化合成酶

內(nèi)生菌作為生物催化劑可增加生物過程的立體專一性，利用其代謝過程中產(chǎn)生的酶對(duì)外源化合物進(jìn)行催化反應(yīng)，可簡化目標(biāo)物質(zhì)的純化工藝。工程菌是采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)加工出來的新型微生物，具有多功能、高效和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，植物內(nèi)生菌具有豐富的酶活性，可作為其寶貴的基因庫。

王川等人[46]從金銀花中分離出一株代謝產(chǎn)物可以產(chǎn)肉桂酸的內(nèi)生枯草芽孢桿菌，具有產(chǎn)HAL(組氨酸解氨基酶)和PAL(苯丙氨酸解氨基酶)雙功能，克隆HAL基因，催化反應(yīng)成功產(chǎn)生肉桂酸。隨后又對(duì)其細(xì)胞色素P450基因進(jìn)行原核表達(dá)，重組蛋白具有肉桂酸羥基化酶活性，并成功催化底物產(chǎn)生了香豆酸[47]。呂鳳霞[35]篩選出具有纖溶酶活性和體外溶栓效果的內(nèi)生多粘芽孢桿菌，對(duì)其纖溶酶基因克隆與表達(dá)、純化蛋白后活力可達(dá)2096IU/mg，并具有明顯的體外溶栓能力，為植物內(nèi)生菌來源溶栓藥物的開發(fā)提供了新的途徑。

3.4 促進(jìn)植物生長

土壤環(huán)境對(duì)植物的生長具有重大影響，其微生物可與植物相互作用。極端環(huán)境條件下生長的植物往往具有較多特殊活性的有益內(nèi)生菌[48]。劉方春等人[48]從金銀花根部篩選出一株耐鹽堿根際促生蠟樣芽孢桿菌，可使金銀花葉片中細(xì)胞分裂素增多，達(dá)到抗旱促生長的功效。土壤解磷菌可促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收利用，李劍峰等人[49]從石漠生境下金銀花莖部篩選出一株高效解磷菌，促進(jìn)了石漠化環(huán)境下植物的生長。Longfei等人[50]從藥用植物金銀花中篩選出六株可產(chǎn)生鐵載體和吲哚乙酸的菌株，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可促進(jìn)小麥生長。Lucie等人[51]對(duì)忍冬植物內(nèi)生菌促進(jìn)植物生長的潛力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一株可以產(chǎn)生吲哚乙酸、氰化氫、鐵載體，且具有大氣固氮、溶解磷酸鹽的內(nèi)生菌，并可持續(xù)促進(jìn)植物生長、提高植物次級(jí)代謝產(chǎn)物含量。

4 討論

我國金銀花種類豐富，其化學(xué)成分復(fù)雜。對(duì)金銀花中綠原酸提取工作相關(guān)研究較為豐富，在純度及提取液活性機(jī)理方面有待深入探究。木犀草苷作為重要的活性成分之一，首先其提取和分離工藝成本高，污染大，還存在較多困難；其次木犀草苷活性機(jī)理研究不充分，如木犀草苷已被證實(shí)具有緩解小鼠抑樣行為，但對(duì)其活性機(jī)理并沒有明確闡述。未來應(yīng)更大限度的挖掘綠原酸和木犀草苷在動(dòng)植物和人類健康發(fā)展方面應(yīng)用潛力。

內(nèi)生菌對(duì)植物宿主的相互作用包括調(diào)節(jié)宿主的合成代謝、與宿主的共享代謝或?qū)λ拗鞔x成分的轉(zhuǎn)化等方面。內(nèi)生菌代謝產(chǎn)生豐富多樣的活性物質(zhì)，應(yīng)用于產(chǎn)物發(fā)酵、植物生長、生物防治、生物催化等各個(gè)領(lǐng)域，在一定程度上可減少天然藥材的消耗，為新藥的開發(fā)提供新的途徑，同時(shí)可促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。金銀花資源豐富，但其內(nèi)生菌篩選種類還有待加強(qiáng)，相關(guān)研究還處在菌株鑒定及發(fā)酵液活性研究上，對(duì)代謝產(chǎn)物的具體成分鑒定研究較少。直接利用內(nèi)生菌生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，雖然成本低、易操作，但是產(chǎn)量較低，還應(yīng)進(jìn)一步篩選擴(kuò)大資源范圍、尋找高效菌株或?qū)Πl(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化從而提高產(chǎn)量。此外，金銀花內(nèi)生菌相關(guān)作用機(jī)制尚不明確，其內(nèi)生菌基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究可進(jìn)一步揭示其相互調(diào)控機(jī)制，但難度較高，重復(fù)性差。