油棗中黃酮類(lèi)化合物體外抗凝血活性分析

王爭(zhēng)爭(zhēng)，趙 邑，王如福

（1.山西省生物研究院有限公司/醫(yī)藥生物技術(shù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

油棗至今已超過(guò)1 000 a的栽培歷史，康熙年間被封為貢品[1]。油棗樹(shù)抗旱、抗寒、抗病、耐澇能力較強(qiáng)，適合在北方暖溫帶，海拔1 000 m以下，年均溫度在8℃以上，干旱、半干旱地區(qū)生長(zhǎng)[2]。其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有黃酮、多糖、三萜酸等多種生物活性成分[3]，具有防癌抗癌、防止心血管疾病、抑菌保肝、增強(qiáng)免疫力等功能[4]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外人群心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率不斷提升，而血栓性疾病在其中是最為常見(jiàn)的?，F(xiàn)階段，抗血栓的藥物主要有抗凝血類(lèi)藥物、抗血小板類(lèi)藥物和溶栓類(lèi)藥物3種。由于其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，發(fā)病因素多樣，單一的化學(xué)藥物較難有全面的治療效果，而且經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)。目前，在臨床治療時(shí)，多用肝素和香豆素類(lèi)作為抗凝藥物，但這類(lèi)藥物容易誘發(fā)血小板癥等副作用[5]，而天然藥物通過(guò)多種途徑來(lái)發(fā)揮藥效，不良反應(yīng)發(fā)生率較小，所以，開(kāi)發(fā)天然、無(wú)副作用的抗凝藥物或功能性食品具有非常重要的意義。凝血途徑的篩查指標(biāo)有凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血酶原時(shí)間（APTT）和凝血酶時(shí)間（TT），其中，外源性凝血途徑的篩查指標(biāo)是PT，內(nèi)源性凝血途徑的篩查指標(biāo)是APTT，而TT是用于凝血酶的測(cè)定，檢查血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白能力。APTT和PT可以反映凝血途徑是否正常，所以，通過(guò)對(duì)凝血酶原時(shí)間和活化部分凝血酶原時(shí)間的影響來(lái)篩選抗凝藥物是抗凝藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要途徑[6]。研究表明，植物、中藥材中提取的許多天然產(chǎn)物中具有抗凝血的活性，而這些提取物的成分主要是黃酮類(lèi)化合物、多酚類(lèi)化合物和多糖[7-10]。同時(shí)黃酮類(lèi)化合物的抗凝血活性和抗血栓作用研究也主要集中在植物和中草藥中。王凱紅等[11]通過(guò)測(cè)定APTT及相關(guān)性分析，初步推斷紅花注射液中體外抗凝血活性物質(zhì)可能是黃酮類(lèi)物質(zhì)。舒盼盼等[12]通過(guò)測(cè)定PT、APTT，研究人參屬藥材提取物抗凝血活性的差異性。LI等[13]通過(guò)測(cè)定APTT、PT、TT、FIB，研究月季花中物質(zhì)的凝血作用。張妲等[14]通過(guò)測(cè)定全血凝塊溶解率來(lái)評(píng)價(jià)姜黃素類(lèi)化合物的體外抗血栓作用。目前棗中抗凝血活性研究主要集中在棗多糖，如王娜等[15]對(duì)棗中多糖進(jìn)行抗凝血活性研究，結(jié)果表明，大棗粗多糖能顯著延長(zhǎng)APTT，而對(duì)PT、TT均無(wú)明顯影響。棗中黃酮類(lèi)化合物的研究多集中在抗氧化活性、抗腫瘤方面，對(duì)棗中黃酮類(lèi)化合物體外抗凝血活性和抗血栓作用研究鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)分析比較油棗中黃酮類(lèi)化合物的體外抗凝血活性和抗血栓作用，以期為開(kāi)發(fā)相關(guān)功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

油棗由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所提供；正常人血漿（上海太陽(yáng)生物科技有限公司）；試驗(yàn)動(dòng)物為4個(gè)月的新西蘭大白耳，雄性，3 kg，購(gòu)于北京市昌陽(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)。

PT試劑、APTT試劑：上海太陽(yáng)生物科技有限公司；CaCl2、KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl：北京化工廠有限公司；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；尿激酶：中國(guó)食品藥品檢定研究院；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、牛血清白蛋白（BSA）、凝血酶：北京索萊寶科技有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FREE ZONE真空冷凍干燥機(jī)：LABCONCO；CA-50半自動(dòng)血凝儀：日本Sysmex公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；MS3 D S 25漩渦混勻器：IKA公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華儀器公司；MILLI-Q超純水儀：Millipore公司

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備將油棗洗凈、晾干、去核后置于真空冷凍干燥箱干燥至恒質(zhì)量，冷卻后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)0.25 mm篩后，經(jīng)超聲輔助提取、大孔樹(shù)脂和柱層析分離，最后經(jīng)半制備液相分離純化得到5種黃酮類(lèi)化合物，分別為表兒茶素（Epicatechin）、槲皮素（Quercetin）、異槲皮苷（Isoquercitrin）、金絲桃苷（Hyperoside）、蘆?。≧utin）。稱(chēng)取一定量的黃酮類(lèi)化合物，加入DMSO，分別配制成20、10、5、2.5、1.25 mg/mL樣 品溶液，過(guò)0.45 μm的微孔濾 膜后，進(jìn)行抗凝血活性研究。DMSO為試劑空白對(duì)照組，每個(gè)樣品重復(fù)3次試驗(yàn)。稱(chēng)取一定量的蘆丁，加入5%DMSO，分別配制12.5、25、50 mg/mL樣品溶液，過(guò)0.45 μm的微孔濾膜后，進(jìn)行體外血凝塊溶解率試驗(yàn)研究。

1.3.2 油棗中黃酮類(lèi)化合物對(duì)PT影響的測(cè)定根據(jù)張虹等[16]試驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)。分別取5份48 μL正常人血漿與2 μL質(zhì)量濃度分別為1.25、2.5、5、10、20 mg/mL的5種黃酮類(lèi)化合物樣品加入到血凝測(cè)定杯中，混勻后37℃保溫3 min，取37℃已預(yù)熱5～10 min的PT試劑100 μL，加入至待測(cè)樣品中，用血凝分析儀測(cè)定血漿凝固時(shí)間。每個(gè)樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，試劑空白對(duì)照組為2 μL的DMSO。

1.3.3 油棗中黃酮類(lèi)化合物對(duì)APTT影響的測(cè)定根據(jù)任婧等[17]試驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)。分別取5份48 μL正 常 人 血 漿 與2 μL質(zhì) 量 濃 度 分 別 為1.25、2.5、5、10、20 mg/mL的5種黃酮類(lèi)化合物樣品加入到血凝測(cè)定杯中，混勻后37℃保溫5 min，取37℃已預(yù)熱5～10 min的APTT試劑50 μL和37℃已預(yù)熱5～10 min的0.025 mol/L CaCl2溶 液50 μL加 入至待測(cè)樣品中，用血凝分析儀測(cè)定血漿凝固時(shí)間。每個(gè)樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，試劑空白對(duì)照組為2 μL的DMSO。

1.3.4 油棗中黃酮類(lèi)化合物對(duì)TT影響的測(cè)定配制TT緩沖液：稱(chēng)取0.6 g Tris、0.2 g NaCl、1 g BSA，加超純水溶解，pH值調(diào)至7.5，定容至100 mL。配制TT試劑：用TT緩沖液將1 000 U/mL凝血酶稀釋至5 U/mL，備用。根據(jù)WANG等[18]試驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)。本試驗(yàn)分別取5份96 μL正常人血漿與4 μL質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、40 mg/mL的5種黃酮類(lèi)化合物樣品加入到血凝測(cè)定杯中，混勻后，37℃保溫3 min，加50 μLTT試劑，用血凝分析儀測(cè)定血漿凝固時(shí)間。每個(gè)樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，試劑空白對(duì)照組為4 μL的DMSO。

1.3.5 蘆丁對(duì)體外血凝塊溶解率的測(cè)定根據(jù)張妲等[14]試驗(yàn)方法，略作修改。動(dòng)物通過(guò)心臟采血后，將兔血置于37℃下放置3 h后凝塊，切成1 cm3左右的血凝塊，用生理鹽水處理干凈。將3個(gè)劑量組（12.5、25、50 mg/mL）分別置于試管中，向每個(gè)試管中加入1個(gè)凝血塊，于37℃水浴中處理4、8、24 h，再稱(chēng)取血凝塊的質(zhì)量，計(jì)算血凝塊溶解率。每組重復(fù)3次，同時(shí)做空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（1 000 U/mL尿激酶）。

式中，W1為初始血凝塊質(zhì)量，W2為試驗(yàn)處理后血凝塊質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果中的數(shù)據(jù)表達(dá)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD），結(jié)果采用TBtools軟件繪制熱圖，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 油棗中黃酮類(lèi)化合物對(duì)PT的影響

測(cè)定正常血漿的PT值為（14.10±0.17）s，試劑空白（DMSO）的PT值為（14.80±0.21）s。將不同質(zhì)量濃度的5種黃酮類(lèi)化合物加入到正常血漿中，測(cè)定其PT值，結(jié)果如圖1所示。將20 mg/mL蘆丁作用到正常血漿，其PT值為（17.80±0.34）s；其次為異槲皮苷，其PT值為（17.60±0.26）s；影響最小的金絲桃苷，其PT值為（16.30±0.05）s。當(dāng)5種黃酮類(lèi)化合物作用于正常血漿后，其凝血酶原時(shí)間略有延長(zhǎng)，但在低質(zhì)量濃度時(shí)幾乎沒(méi)有影響。

圖1 黃酮類(lèi)化合物對(duì)PT的影響Fig.1 Effect of flavonoids on PT

2.2 油棗中黃酮類(lèi)化合物對(duì)APTT的影響

測(cè)定正常血漿的APTT值為（33.10±0.27）s，試劑空白（DMSO）的APTT值為（35.80±0.35）s。將不同質(zhì)量濃度的5種黃酮類(lèi)化合物加入到正常血漿中，測(cè)定其APTT值，結(jié)果如圖2所示。5種黃酮類(lèi)化合物作用于正常血漿后，其APTT均有延長(zhǎng)，且呈量效關(guān)系。其中，蘆丁的抗凝血效果最明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，APTT值達(dá)（60.80±1.55）s，表 兒 茶 素 作 用 后，APTT值 達(dá)（58.70±1.58）s；效果相對(duì)差的異槲皮苷在質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，APTT值也達(dá)（54.80±1.47）s，5種黃酮類(lèi)化合物對(duì)APTT的影響由高到低依次為蘆?。颈韮翰杷兀鹃纹に兀窘鸾z桃苷＞異槲皮苷。

圖2 黃酮類(lèi)化合物對(duì)APTT的影響Fig.2 Effect of flavonoids on APTT

2.3 油棗中黃酮類(lèi)化合物對(duì)TT的影響

測(cè)定正常血漿的TT值為（18.40±0.29）s，試劑空白（DMSO）的TT值為（19.30±0.25）s。將不同質(zhì)量濃度的5種黃酮類(lèi)化合物加入到正常血漿中，測(cè)定其TT值，結(jié)果如圖3所示。將40 mg/mL蘆丁作用到正常血漿，其TT值為（23.90±0.44）s；影響最小的異槲皮苷，其TT值為（21.10±0.48）s。5種黃酮類(lèi)化合物作用于正常血漿后，低質(zhì)量濃度時(shí)幾乎無(wú)影響，當(dāng)質(zhì)量濃度為40 mg/mL，蘆丁和表兒茶素對(duì)TT的影響最明顯。

圖3 黃酮類(lèi)化合物對(duì)TT的影響Fig.3 Effect of flavonoids on TT

2.4 油棗中黃酮類(lèi)化合物對(duì)動(dòng)物凝血塊的影響

選取抗凝血效果較為明顯的蘆丁進(jìn)行動(dòng)物體外血凝塊溶解率試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。不同劑量的蘆丁均對(duì)血凝塊有溶解作用，且呈量效關(guān)系，與空白對(duì)照組相比，均差異顯著。高劑量組（50 mg/mL）蘆丁作用于血凝塊4、8、24 h后，測(cè)得血凝塊溶解率分別為22.8%、34.2%、41.3%。與尿激酶對(duì)照組相比，高劑量組在作用24 h后差距不明顯，但在作用初期（4、8 h）溶解率明顯高于尿激酶處理的血凝塊，且差異顯著。

圖4 蘆丁對(duì)動(dòng)物體外血凝塊溶解率的影響Fig.4 Effect of rutin on dissolution rate of animal blood clot in vitro

3 結(jié)論與討論

在預(yù)試驗(yàn)中，比較了DMSO的加入量對(duì)PT、APTT、TT的 影 響，結(jié) 果 表 明，在 測(cè) 定PT和APTT時(shí)，加入4 μL的DMSO，就會(huì)顯著影響測(cè)定結(jié)果，加入2 μL的DMSO幾乎不影響測(cè)定結(jié)果，所以，測(cè)定PT和APTT時(shí)選用2 μL的測(cè)定樣品量；在測(cè)定TT時(shí)，加入6 μL的DMSO，就會(huì)顯著影響測(cè)定結(jié)果，而加入4 μL的DMSO幾乎不影響測(cè)定結(jié)果，所以，測(cè)定TT時(shí)選用4 μL的測(cè)定樣品量。

KUNTI?V等[19]研究蘆丁體外抗凝血活性，結(jié)果表明，蘆丁可延長(zhǎng)APTT，不影響PT和TT結(jié)果。李新等[20]通過(guò)測(cè)定TT、APTT、PT，研究三七粉中活血作用的質(zhì)量標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)槲皮素可延長(zhǎng)APTT。武琦等[21]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，表明槲皮素可抑制凝血酶、凝血因子活性，阻斷纖維蛋白的形成，還可以提升內(nèi)皮一氧化氮水平，舒張血管，緩解血栓形成。PT延長(zhǎng)通常是由于凝血Ⅰ因子、Ⅱ因子、Ⅴ因子、Ⅶ因子、Ⅹ因子、纖維蛋白原缺乏和血液中抗凝物質(zhì)存在。APTT延長(zhǎng)通常是凝血Ⅷ因子、Ⅸ因子、Ⅺ因子等缺乏以及纖維蛋白溶解活力增強(qiáng)，內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的抑制作用越明顯[22-24]。TT延長(zhǎng)通常是血漿纖維蛋白原缺乏、纖溶蛋白溶解系統(tǒng)亢進(jìn)和血液中存在抗凝物質(zhì)；TT縮短通常是血液中有鈣離子存在或血液呈酸性等情況引起的[25-26]。內(nèi)源途徑與外源途徑都不是各自完全獨(dú)立，而是互相聯(lián)系、互相作用的，外源途徑的TF-FⅦa復(fù)合物不僅激活凝血Ⅹ因子，還激活內(nèi)源途徑的凝血Ⅸ因子，同時(shí)凝血Ⅺ因子還可被凝血酶激活；TF-FⅦa復(fù)合物活性是體內(nèi)止血過(guò)程啟動(dòng)的決定性因素[27-29]。

體外抗凝血試驗(yàn)結(jié)果表明，油棗中黃酮類(lèi)化合物主要影響APTT的測(cè)定結(jié)果，APTT延長(zhǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的抑制作用越明顯。說(shuō)明油棗中黃酮類(lèi)化合物具有體外抗凝血活性，而且主要通過(guò)影響內(nèi)源性凝血系統(tǒng)發(fā)揮作用。其原因可能是由于黃酮類(lèi)化合物對(duì)凝血Ⅷ因子、Ⅸ因子、Ⅺ因子或Ⅻ因子的影響造成的，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。體外血凝塊溶解率試驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量的蘆丁均可使動(dòng)物體外血凝塊溶解，說(shuō)明油棗中黃酮類(lèi)化合物具有抑制血栓形成的作用，推測(cè)可能是黃酮類(lèi)化合物引起的纖溶蛋白溶解系統(tǒng)的激活作用，但對(duì)抗血栓作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。