傳統(tǒng)工藝山西陳醋釀造微生物溯源分析

寇 蓉，馮國(guó)楊，李 晨，范曉軍

（1.太原理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西杏花村汾酒集團(tuán)有限責(zé)任公司，山西 汾陽(yáng) 032205；3.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；4.太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030600）

傳統(tǒng)山西陳醋釀造過(guò)程是在開(kāi)放的環(huán)境中進(jìn)行[1-2]，盡管原料高粱需要進(jìn)行蒸煮處理，但在操作過(guò)程中極易從操作工具、車間空氣、車間地面等環(huán)境中引入微生物，這些微生物在富含營(yíng)養(yǎng)的醋醅基質(zhì)中生長(zhǎng)代謝和繁衍，在一定程度上影響著食醋風(fēng)味和釀造的穩(wěn)定性[3]。先前的研究主要對(duì)食醋釀造發(fā)酵劑進(jìn)行了大量研究[4-6]，而在生產(chǎn)實(shí)踐中不同車間釀造的食醋品質(zhì)往往存在差異，這表明車間環(huán)境中的微生物可能會(huì)參與到食醋的釀造過(guò)程中，進(jìn)而影響食醋的品質(zhì)。此外，火醅作為醋酸發(fā)酵的引子[7]，其對(duì)食醋釀造微生物的影響仍缺乏針對(duì)性研究。山西陳醋釀造過(guò)程中在醋酸發(fā)酵階段加入生料麩皮，既增加了醋醅的疏松度，促進(jìn)氧氣的傳遞[8]，也為醋酸發(fā)酵提供了重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。生料麩皮的添加是否同時(shí)會(huì)向釀造系統(tǒng)中引入某些微生物，這一問(wèn)題值得深入探討。

微生物溯源方法的建立使復(fù)雜微生物系統(tǒng)的菌群來(lái)源分析成為可能，也促進(jìn)了研究者對(duì)食品釀造過(guò)程中微生物來(lái)源的解析。如WANG等[9]采用SourceTracker確定了大曲和環(huán)境微生物對(duì)我國(guó)谷物發(fā)酵白酒中微生物群落的貢獻(xiàn)，其中，發(fā)酵過(guò)程中的好氧菌和兼性厭氧菌主要來(lái)源于大曲，而厭氧菌主要來(lái)源于窖泥。2019年提出的快速期望最大化微生物源跟蹤（FEAST）方法比SourceTracker方法具有更高的精度和更快的速度[10]，該方法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于土壤[11]、醫(yī)學(xué)[12-15]、污泥[16]等領(lǐng)域微生物的溯源分析。

本研究以山西陳醋釀造發(fā)酵劑、車間環(huán)境微生物、輔料麩皮和發(fā)酵醅為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，并采用FEAST方法解析了發(fā)酵劑、車間環(huán)境、操作工具、末期酒醅、輔料麩皮和火醅中的微生物對(duì)食醋釀造過(guò)程微生物組成的貢獻(xiàn)，對(duì)深入認(rèn)識(shí)食醋釀造過(guò)程和發(fā)酵過(guò)程控制都具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料發(fā)酵劑、車間環(huán)境和操作工具微生物樣品、輔料麩皮和發(fā)酵醅樣品均取自山西清徐縣某醋廠。大曲（Daqu）、快曲（Kuaiqu）和麩皮（Bran）分別取自曲房和輔料室，Quick Take 30空氣微生物采樣器放置于發(fā)酵車間內(nèi)工作7 d，用于采集車間空氣中的微生物（Air）。工具表面（Tools）（如鐵锨、笤帚等）、車間地面（InG）和室外地面（OutG）的微生物采用浸有0.1 mol/L PBS緩沖液的無(wú)菌棉擦拭獲取[17]。發(fā)酵醅樣品取同一批次淀粉糖化（starch saccharification，Sac）發(fā)酵第2天樣品（編號(hào)Sac2）、酒精發(fā)酵（alcohol fermentation，AF）第12天樣品（編號(hào)AF12）、醋酸發(fā)酵（acetic acid fermentation，AAF）第1天樣品（編號(hào)AAF1）和前批次醋酸發(fā)酵第3天樣品（編號(hào)AAF3）。糖化和酒精發(fā)酵階段樣品取自發(fā)酵池的頂部、中部和底部，混合后得到測(cè)試樣；醋酸發(fā)酵階段樣品在距離發(fā)酵池表面30 cm的深度進(jìn)行東西南北中五點(diǎn)采集，混合均勻后作為醋酸發(fā)酵階段的測(cè)試樣。樣品用無(wú)菌密封袋封裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無(wú)水乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、50×TAE緩沖液、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）裂 解液、溶菌酶：上海生工生物工程股份有限公司；DNA聚合酶、緩沖液：美國(guó)NEB公司；GeneJET膠回收試劑盒：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫(kù)試劑盒：美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京市水光明醫(yī)療儀器有限公司；Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；NanoVue plus超微量紫外分光光度 計(jì)：英 國(guó)Cytiva公 司；T100梯 度PCR儀：美 國(guó)Bio-Rad公司；Novaseq6000高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；Quick Take 30空氣微生物采樣器：美國(guó)SKC公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組提取與檢測(cè)采用CTAB法[18]對(duì)醋醅樣本的微生物宏基因組進(jìn)行提取，操作如下：（1）吸取1 000 μL CTAB裂解液至2.0 mL EP管里，加入20 μL溶菌酶，將適量的樣品加入裂解液中，65℃水?。〞r(shí)間為2～3 h），期間顛倒混勻數(shù)次，以使樣品充分裂解。（2）離心取950 μL上清，加入與上清等體積的酚（pH值8.0）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。（3）取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min。（4）吸取上清至1.5 mL離心管里，加入上清液3/4體積的異丙醇，上下?lián)u晃，-20℃沉淀。（5）12 000 r/min離心10 min，倒出液體。用1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗滌2次，剩余的少量液體可再次離心收集，然后用槍頭吸出。（6）超凈工作臺(tái)吹干或者室溫晾干。（7）加入51 μL ddH2O溶解DNA樣品。（8）加RNase A 1 μL消化核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），37℃放置15 min。之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性并用超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度與純度。

1.3.2 PCR擴(kuò)增與高通量測(cè)序用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）、806R（5'-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和 引 物ITS3-2024F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）、ITS4-2409R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3'）分 別 擴(kuò) 增 細(xì) 菌16S rRNA基 因V4區(qū) 和 真 菌ITS2區(qū)。PCR擴(kuò) 增 體 系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，引物各1.5 μL，基因組DNA（genomic DNA,gDNA）10 μL，H2O 2 μL。PCR擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，高通量測(cè)序委托北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.3.3 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析測(cè)序原始序列通過(guò)序列拼接、過(guò)濾、質(zhì)量控制、去除嵌合體，最終獲得有效序列[19-22]。利用Uparse算法（Uparse v7.0.1001）以97%的一致性將所有樣本的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）[23]。使用Mothur軟件與SILVA（v138.1）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)細(xì)菌OTUs序列進(jìn)行物種注釋分析，應(yīng)用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）與Unite（v8.2）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真菌OTUs序列進(jìn)行物種注釋分析，并分別在門、綱、目、科、屬水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。對(duì)以上各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，用于后續(xù)Alpha多樣性分析。

1.3.4 FEAST溯源分析FEAST溯源分析通過(guò)網(wǎng)站（https://github.com/cozygene/FEAST）提供的R語(yǔ)言在RStudio程序中運(yùn)行完成。傳統(tǒng)工藝山西陳醋是通過(guò)高溫蒸料糊化后加入發(fā)酵劑進(jìn)行糖化和酒精發(fā)酵，酒精發(fā)酵結(jié)束后將酒醅與輔料麩皮混合，并將前批次醋酸發(fā)酵第3天的醋醅（俗稱火醅）作為種子發(fā)酵劑引入到新批次的醋酸發(fā)酵階段。因此，本研究也將火醅微生物納入到醋酸發(fā)酵第1天的微生物來(lái)源分析當(dāng)中。此外，釀造車間環(huán)境中的微生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的積淀，其菌群組成對(duì)食醋發(fā)酵過(guò)程也有著重要的影響。本研究針對(duì)山西陳醋釀造微生物的溯源分析分2個(gè)部分，其一以發(fā)酵劑（大曲和快曲）和車間環(huán)境微生物（車間空氣、車間地面、工具表面、室外地面）種群為源端，糖化發(fā)酵第2天微生物種群為接受端進(jìn)行溯源分析；其二以酒精發(fā)酵第12天的酒醅、輔料麩皮、車間環(huán)境微生物（車間空氣、車間地面、工具表面、室外地面）和火醅種群為源端，醋酸發(fā)酵第1天微生物種群為接受端進(jìn)行溯源分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Observed-OTUs、Shannon、Chao1及Coverage指 數(shù)。利 用Origin 8.5軟件繪制稀釋曲線和門水平、屬水平物種相對(duì)豐度柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)分析

基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)酵劑、車間環(huán)境微生物樣品、輔料麩皮和發(fā)酵醅樣品中細(xì)菌和真菌的有效序列和OTUs進(jìn)行研究，結(jié)果如表1所示。

表1 樣品中細(xì)菌和真菌的序列信息Tab.1 Sequence information of bacteria and fungi in samples

11個(gè)樣品共產(chǎn)生706 931條細(xì)菌有效序列、673 733條真菌有效序列。將有效序列以97%的一致性聚類成為OTUs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空氣中細(xì)菌OTU最多，有1 487個(gè)；麩皮中真菌OTU最多，有462個(gè)；糖化發(fā)酵第2天樣品中細(xì)菌OTU最少，有464個(gè)；大曲中真菌OTU最少，有60個(gè)。所有樣品中細(xì)菌OTUs均大于真菌OTUs，說(shuō)明發(fā)酵劑、車間環(huán)境微生物樣品、輔料麩皮和發(fā)酵醅樣品中細(xì)菌群落多樣性遠(yuǎn)高于真菌群落，大曲中的微生物種類更為鮮明和集中。

2.2 醋醅樣品Alpha多樣性分析

稀釋曲線直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性，山西陳醋釀造發(fā)酵劑、車間環(huán)境微生物、輔料麩皮以及發(fā)酵醅的微生物測(cè)序稀釋曲線如圖1所示。山西陳醋釀造發(fā)酵劑、車間環(huán)境微生物、輔料麩皮以及發(fā)酵醅樣品中微生物的Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果如表2所示。

表2 樣品中細(xì)菌和真菌群落Alpha多樣性指數(shù)Tab.2 Alpha diversity indexes of bacterial and fungal community in samples

圖1 樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of bacteria（a）and fungi（b）in samples

由圖1可知，所有樣品的稀釋曲線漸近平坦并且Coverage指數(shù)均＞0.99，表明測(cè)序可以反映各樣本中絕大多數(shù)微生物群落特征和多樣性信息。

Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別為多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)。其中，Shannon指數(shù)用于表征微生物群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度。微生物群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數(shù)越大。Chao1指數(shù)用于估計(jì)微生物群落中包含的物種總數(shù)，微生物群落豐富度越高，Chao1指數(shù)越大。由表2可知，所有樣本細(xì)菌群落的多樣性和豐富度均大于真菌群落。在瀘州酒中溫大曲和山西老陳醋大曲中也檢測(cè)到細(xì)菌群落的豐富度和多樣性高于真菌群落[24-25]?？諝庵屑?xì)菌群落的多樣性和豐富度最高，真菌群落的豐富度最高，在清香類型白酒發(fā)酵車間微生物的研究中也檢測(cè)到空氣中細(xì)菌群落的多樣性高于其他環(huán)境樣品[17]。這些空氣中豐富的微生物為食醋釀造提供了充足的微生物資源，也是地域生態(tài)特征的重要體現(xiàn)。此外，麩皮中真菌群落的多樣性最高；大曲中真菌群落的多樣性和豐富度最低；快曲中細(xì)菌群落的多樣性最低；Sac2中真菌群落的豐富度最低。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

基于門水平發(fā)酵劑、車間環(huán)境微生物、輔料麩皮以及發(fā)酵醅中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如如圖2所示。由圖2可知，大曲和麩皮中變形菌門（Proteobacteria）是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，其余樣本中硬壁菌門（Firmicutes）是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。王佳麗[25]對(duì)山西老陳醋大曲的研究結(jié)果顯示，硬壁菌門（Firmicutes）是主要的細(xì)菌門；王雪山[17]對(duì)清香類型白酒使用的中溫大曲研究發(fā)現(xiàn)，成品曲硬壁菌門（Firmicutes）占主導(dǎo)，新曲中變形菌門（Proteobacteria）占主導(dǎo)地位，這些研究結(jié)果產(chǎn)生差異的原因可能是取樣季節(jié)、大曲儲(chǔ)存時(shí)間以及大曲發(fā)酵過(guò)程中水活度、酸度、溫度等發(fā)酵微環(huán)境因素對(duì)微生物的自然篩選作用導(dǎo)致的[26]。麩皮中擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是優(yōu)勢(shì)真菌門，其余樣本中子囊菌門（Ascomycota）是優(yōu)勢(shì)真菌門。

圖2 基于門水平各樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）群落結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Community structure analysis of bacterial（a）and fungal（b）in samples based on phylum level

基于屬水平山西陳醋釀造發(fā)酵劑、車間環(huán)境微生物、輔料麩皮以及發(fā)酵醅樣本中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，車間環(huán)境（工具表面、車間地面、車間空氣和室外地面）、醋酸發(fā)酵第1天樣品和火醅樣本中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是主要的細(xì)菌屬。糖化發(fā)酵第2天樣品和酒精發(fā)酵第12天樣品中主要的細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和Limosilactobacillus。大曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其相對(duì)豐度僅為3.68%?？烨袃?yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為魏斯氏菌屬（Weissella），相對(duì)豐度達(dá)69.59%。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）是麩皮中主要的細(xì) 菌屬。

圖3 基于屬水平各樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）群落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Community structure analysis of bacterial（a）and fungal（b）in samples based on genus level

大曲中復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度達(dá)99.06%，這與Alpha多樣性指數(shù)的結(jié)果一致?？烨星箤伲ˋspergillus）和根霉屬（Rhizopus）是主要的真菌屬。糖化發(fā)酵第2天樣品、酒精發(fā)酵第12天樣品和火醅樣品中復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和酵母菌屬（Saccharomyces）是主要的真菌屬；醋酸發(fā)酵第1天樣品中主要的真菌屬為復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和布氏白粉菌屬（Blumeria）。節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）和絲孢菌屬（Trichosporon）是麩皮樣品中主要的真菌屬；布氏白粉菌屬（Blumeria）和酵母菌屬（Saccharomyces）是工具表面樣品中主要的真菌屬；畢赤酵母屬（Pichia）和復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）是室外地面樣品中主要的真菌屬；復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和Cercospora是室內(nèi)地面樣品中主要的真菌屬；酵母菌屬（Saccharomyces）和復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）是空氣樣品中主要的真菌屬。

2.4 食醋釀造微生物溯源分析

糖化發(fā)酵第2天樣品和醋酸發(fā)酵第1天樣品中細(xì)菌和真菌群落的溯源分析如圖4所示。從圖4可以看出，在糖化發(fā)酵第2天樣本中細(xì)菌群落中有6.18%來(lái)自車間地面，3.66%來(lái)自工具表面，1.17%來(lái)自車間空氣；真菌群落中有86.66%來(lái)自大曲。醋酸發(fā)酵第1天樣本中細(xì)菌群落有13.94%來(lái)自工具表面，9.43%來(lái)自火醅，8.91%來(lái)自酒精發(fā)酵第12天的酒醅；真菌群落中有52.39%來(lái)自工具表面，31.40%來(lái)自車間空氣，8.46%來(lái)自酒精發(fā)酵第12天的酒醅。

圖4 糖化發(fā)酵第2天樣品（a）和醋酸發(fā)酵第1天樣品（b）中微生物溯源分析Fig.4 Microbial source tracking of samples on the second day of saccharification fermentation（a）and the first day of acetic acid fermentation（b）

傳統(tǒng)山西陳醋采用循環(huán)接種工藝，即在醋酸發(fā)酵階段開(kāi)始，將火醅作為醋酸發(fā)酵第1天的種子發(fā)酵劑，本研究結(jié)果也顯示，在醋酸發(fā)酵第1天，有9.43%的細(xì)菌群落和4.02%的真菌群落來(lái)源于火醅，在保寧醋發(fā)酵過(guò)程中也表明回糟的引入極大地豐富了發(fā)酵初期醋醅中微生物的種類[27]。

盡管Alpha多樣性指數(shù)顯示，大曲中真菌群落的多樣性和豐富度最低，但是大曲對(duì)糖化發(fā)酵第2天樣品中真菌群落的貢獻(xiàn)達(dá)86.66%，這表明大曲中含量突出的菌種在食醋釀造中發(fā)揮了巨大的潛能。

3 結(jié)論與討論

本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)和FEAST方法研究了山西陳醋釀造發(fā)酵劑、車間環(huán)境微生物、輔料麩皮以及發(fā)酵醅微生物的群落組成結(jié)構(gòu)和多樣性以及釀造微生物的來(lái)源。結(jié)果表明，所有樣本中細(xì)菌群落的多樣性和豐富度大于真菌群落。大曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和真菌屬分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），而快曲中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和真菌屬分別為魏斯氏菌屬（Weissella）和曲霉屬（Aspergillus）。車間環(huán)境（工具表面、車間地面、室外地面和車間空氣）、醋酸發(fā)酵第1天樣品和火醅樣本中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是主要的細(xì)菌屬。FEAST結(jié)果顯示，糖化發(fā)酵第2天樣本中細(xì)菌群落主要來(lái)自車間地面和工具表面；真菌群落主要來(lái)自大曲。王雪山[17]在對(duì)新廠區(qū)和老廠區(qū)清香類型白酒發(fā)酵微生物溯源分析發(fā)現(xiàn)，大曲對(duì)老廠區(qū)和新廠區(qū)發(fā)酵0 d酒醅中真菌群落的貢獻(xiàn)大于細(xì)菌群落。這表明釀造微生態(tài)對(duì)外加微生物具有選擇性，真菌群落更易在糖化發(fā)酵第2天的發(fā)酵稀醪中生存，這可能與其相對(duì)致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。醋酸發(fā)酵第1天樣本中細(xì)菌群落主要來(lái)自工具表面、火醅和酒精發(fā)酵第12天的酒醅；真菌群落主要來(lái)自工具表面、車間空氣和酒精發(fā)酵第12天的酒醅。本研究首次對(duì)山西陳醋發(fā)酵微生物的來(lái)源進(jìn)行了系統(tǒng)解析，獲得了山西陳醋釀造生態(tài)中主要的微生物源端對(duì)陳醋發(fā)酵微生物群落的貢獻(xiàn)，為山西陳醋釀造過(guò)程調(diào)控提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

本研究?jī)H討論了單個(gè)季節(jié)環(huán)境微生態(tài)數(shù)據(jù)以及山西陳醋發(fā)酵微生物的來(lái)源，而環(huán)境微生態(tài)易受季節(jié)變化的影響，進(jìn)而影響食醋釀造過(guò)程。因此，以后應(yīng)開(kāi)展不同季節(jié)環(huán)境微生態(tài)對(duì)食醋發(fā)酵過(guò)程的影響方面的研究。