山西老陳醋調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血脂及腸道菌群的機制

李瑛琪，侯嘉怡，李 軒，杜 鵬，宋 佳，聶志強，王 敏

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

人類腸道擁有機體最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道 細菌總數(shù)達百萬億，約為人體細胞數(shù)量的10倍，因此，腸道菌群被認(rèn)為是人體另一個“代謝器官”，在調(diào)節(jié)宿主脂質(zhì)代謝、能量穩(wěn)態(tài)、脂肪沉積和黏膜屏障完整性方面至關(guān)重要[1]。大量研究表明，腸道菌群的穩(wěn)定性在機體免疫系統(tǒng)及營養(yǎng)代謝過程中起著至關(guān)重要的作用，且與人類健康密切相關(guān)，其動態(tài)平衡受到飲食和生活環(huán)境等因素的影響[2]。當(dāng)腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)失衡時，會導(dǎo)致如肥胖、高血壓、高血脂、腸道炎癥等多種慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。脂質(zhì)代謝失調(diào)將導(dǎo)致宿主腸道微生物群落多樣性降低、細菌種類比例改變以及從飲食中獲取能量的能力更強[4]。而合理的飲食干預(yù)可改變腸道微生物的組成和豐度，減輕體質(zhì)量，對長期高脂飲食引起的腸道菌群失調(diào)產(chǎn)生積極影響[[5]。因此，通過膳食對機體腸道菌群進行正向干預(yù)，已用于預(yù)防和治療機體代謝疾病。

山西老陳醋（Shanxi aged vinegar，SAV）是采用中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵方法釀造的四大名醋之一，由于其釀造原料多樣，整個釀造過程又有豐富的微生物參與，故山西老陳醋富含多酚、黃酮、多糖、有機酸、四甲基吡嗪等多種功能性成分。多項研究表明，山西老陳醋具有抗氧化、降血脂、解酒護肝、降血壓等功效[6-8]。目前，國內(nèi)外關(guān)于山西老陳醋降血脂的作用機制及其對腸道菌群的影響研究較少。

本研究探討了山西老陳醋在調(diào)控腸道菌群方面與脂質(zhì)代謝關(guān)系的潛在作用機制，通過考察山西老陳醋干預(yù)對大鼠體質(zhì)量、膽固醇和甘油三酯等脂質(zhì)代謝指標(biāo)，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等氧化指標(biāo)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和白介素等肝功酶及炎性指標(biāo)，腸道菌群乳桿菌屬（Lactobacillus）和 擬 桿 菌 屬（Bacteroides）等 的 影響，探究上述指標(biāo)對高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝的作用機制，旨在為開發(fā)傳統(tǒng)食醋的營養(yǎng)價值提供方向。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料本試驗所用山西老陳醋（東湖8 a）來自山西老陳醋集團有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器總膽固醇（Total Cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（Triglyceride，TG）試劑盒、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSHPx）試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）試劑盒、白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）試劑盒、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）試劑盒、白細胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）試劑盒、腫 瘤 壞 死 因 子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。酶標(biāo)儀（SMZ140），廈門麥克奧迪公司；高速離心機（TGL-16G），上海安亭飛鴿儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 山西老陳醋中主要成分的測定

1.2.1.1 總酸測定參考國標(biāo)《GB 12456—2021

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測定》進行總酸的測定。吸取5.0 mL食醋置于100 mL容量瓶中，加入超純水定容后混勻。吸取20.0 mL稀釋液，置于200 mL小燒杯中，加水60 mL，用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到pH值8.2，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。同時按上述操作，用同體積蒸餾水代替試液作空白試驗，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

X1=（V1-V2）×c×0.06/（V×5/100）×100（1）

式中，X1表示試樣中總酸的含量（以乙酸計，g/100 mL）；V1表示測定用試樣稀釋液消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL）；V2表示試劑空白消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL）；V表示試劑體積（mL）；c表示氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度（mol/L）；0.06表示與1.00 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（c（NaOH）=0.1 mol/L）相當(dāng)?shù)囊宜岬馁|(zhì)量（g）。

1.2.1.2 不揮發(fā)酸測定參考國標(biāo)《GB/T 19777—2013地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》進行不揮發(fā)酸的測定。取2 mL醋液移入單沸式蒸餾裝置的蒸餾管中，加入8 mL超純水，連接好裝置，打開排氣管，加熱至燒瓶中的水沸騰2 min后，關(guān)閉排氣口進行蒸餾，待餾出液至180 mL時，打開排氣口，關(guān)閉電源。將剩余液移入燒杯中，用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH值8.2，記錄消耗的體積。同時按上述操作，用同體積蒸餾水代替試液作空白試驗，記錄消耗NaOH氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

式中，X2表示樣品中不揮發(fā)酸的含量（以乳酸計，g/100 mL）；V表示滴定樣品時消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（c（NaOH)=0.100 0 mol/L）的體積（mL）；V0表示空白試驗消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定溶液的體積（mL）；c表示氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定溶液濃度（mol/L）；0.09表示與1.00 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（c（NaOH)=0.1 mol/L）相當(dāng)?shù)娜樗岬馁|(zhì)量（g）。

1.2.1.3 多酚測定多酚含量的測定依據(jù)文獻[9]的方法進行。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：吸取沒食子酸工作液（1 000 μg/mL）和水各1.0 mL于刻度試管中，然后加入5.0 mL的福林酚溶液混勻，反應(yīng)5 min，加入4.0 mL 7.5%的Na2CO3溶液，定容至刻度后搖勻。室溫靜置60 min后，用分光光度計在765 nm波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出回歸方程。

含量測定：將樣品進行10倍稀釋，取1.0 mL按照上述方法進行測定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算溶液中的多酚含量。

1.2.1.4 黃酮測定黃酮含量測定依據(jù)文獻[10]的方法操作。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取蘆丁對照溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于50.0 mL容量瓶中，加乙醇至總體積為15.0 mL，依次加入1.0 mL Al（NO3)3溶液和1.0 mL CH3COOK溶液，加水至刻度后搖勻并靜置1 h。然后以30%乙醇溶液作為空白對照，于415 nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

含量測定：取醋樣1.0 mL置于50.0 mL容量瓶中，按照上述方法操作測定其吸光度值，然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮含量。

1.2.1.5 總糖測定總糖測定主要參照文獻[11]的試驗方法。吸取1.0 mL醋樣加入20 mL試管后，加1.0 mL苯酚溶液，快速加入5.0 mL硫酸，充分渦旋混勻后靜置10 min，然后將試管置于30℃水浴鍋中加熱20 min，取出后在490 nm處測定吸光度值，然后與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比計算總糖含量。

1.2.1.6 還原糖測定根據(jù)《GB/T 19777—2013地理標(biāo)志產(chǎn)品-山西老陳醋》進行還原糖含量測定。

空白滴定：精確吸取菲林甲、乙溶液各5.0 mL放入150 mL錐形瓶中后加入蒸餾水10.0 mL。再用滴定管加入0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液9.0 mL。搖勻后在電爐上加熱，混合液在2 min內(nèi)沸騰，沸騰30 s后，勻速滴入0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至藍色消失，溶液變成黃色后到達終點。并記錄沸騰前后消耗的葡萄糖體積。

樣品滴定：分別吸取5.0 mL菲林甲溶液和5.0 mL菲林乙溶液放入150 mL錐形瓶中，加入蒸餾水10.0 mL及1 mL 10%樣品稀釋液，搖勻后在電爐上加熱，控制在1～2 min內(nèi)沸騰，沸騰30 s后勻速滴加0.1%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至藍色消失，溶液變成黃色后到達終點。記錄下沸騰前后共消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，同時進行平行測定，計算還原糖的含量。

1.2.1.7 有機酸含量測定樣品前處理：取2.0 mL紅曲米醋加入離心管中，12 000 r/min下離心5 min，取上清過0.22 μm濾膜。

紫 外-HPLC檢 測 條 件[12]。色 譜 柱（Aminex HPX-87H lon Exclusion Column（7.8×300 mm））參數(shù)：柱溫30℃，流速0.6 mL/min，紫外檢測器波長215 nm，流動相5 mmol/mL H2SO4，運行時間30 min。

1.2.2 實驗動物與飼料所用試驗動物為6周齡雄性斯普拉格-杜勒大鼠（SD大鼠），體質(zhì)量為（180±10）g，購于中國食品藥品監(jiān)督管理研究院（動物許可證號：SCXK（北京）2014—0013）。

飼料購自北京可協(xié)利飼料有限公司。對照組飼料營養(yǎng)成分為碳水化合物59%、蛋白質(zhì)21.1%、纖維4.9%、脂肪4.2%、灰分8%、磷1%和鈣1.8%，高脂飲食營養(yǎng)成分為傳統(tǒng)飼料中添加膽固醇2%、豬油10%、膽鹽0.2%、蛋黃粉10%和糖5%。

1.2.3 動物高脂模型的建立與給藥SD大鼠采用常規(guī)日糧配方飼養(yǎng)，自由采食，自由飲水，預(yù)飼期為7 d，采用晝/夜為12 h/12 h飼養(yǎng)周期交替進行[8]。正式試驗期為8周。按體質(zhì)量和血清總膽固醇含量（TC）隨機分為2組：空白組和高脂飲食試驗組。試驗期內(nèi)空白組飼喂常規(guī)飼料，試驗組飼喂高脂飼料。當(dāng)試驗組血清指標(biāo)TC、TG、HDL-C水平均高于空白組且存在顯著差異時，表明高脂血癥模型建立成功。

高脂血癥模型建立好后，根據(jù)體質(zhì)量和血脂指標(biāo)，將高血脂癥大鼠隨機分為7組（n=6），保證各試驗組體質(zhì)量和血清脂質(zhì)指標(biāo)無顯著差異。具體分組為空白組（Vehicle）、模型組（Model）、陽性對照組（Positive control，PC，洛伐他汀，2 mg/（kg·d））、醋酸陰性對照組（Negative control，NC，醋酸溶液pH=5.5，2 mg/（kg·d）），山 西 老 陳 醋 高 劑 量 組（High dose，HD，16 mg/（kg·d）），山西老陳醋中劑量組（Middle dose，MD，8 mg/（kg·d）），山西老陳醋低劑量組（Low dose，LD，4 mg/（kg·d））。繼續(xù)飼喂4周?？瞻捉M常規(guī)飲食喂養(yǎng)，其余組高脂飲食喂養(yǎng)。除空白組外，另外6組每天灌胃一次。

1.2.4 SD大鼠體質(zhì)量的測定試驗開始時，記錄所有大鼠的體質(zhì)量。飼養(yǎng)至8～12周時，每周定期測定大鼠的體質(zhì)量并記錄。

1.2.5 樣本的采集與測定高脂模型構(gòu)建后，采血前禁食不禁水，采集眼眶血用于測定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。每周測定各組血清中的血脂指標(biāo)。末次灌胃結(jié)束后大鼠禁食禁水16 h，次日腹腔注射水合氯醛麻醉，斷頭處死，心臟取血，靜置30 min后，4 000 r/min離心10 min，收集上清，根據(jù)試劑盒要求測定血清中的相關(guān)常規(guī)生化指標(biāo)。采集大腸內(nèi)容物樣本，-80℃儲存，用于16S RNA測序。

1.2.6 16S rRNA高通量測序稱取約0.5 g各組大鼠新鮮糞便樣本，采用CTAB法提取總DNA，采用16S rDNA高通量測序技術(shù)對大鼠腸道內(nèi)容物中腸道菌群進行基因測序和生物信息學(xué)分析。使用TIANGEN試劑盒提取細菌DNA，具體步驟見參考文獻[13-16]。提取后用1%瓊脂糖凝膠檢測所提各組腸道微生物DNA的濃度和純度，然后利用無菌水稀釋至1 ng/μL。以DNA為模板，依據(jù)16S rDNA V4區(qū)序列，使用通用引物（515 F和806 R）進行PCR擴增。具體擴增引物序列為，515-F：5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'，806-R：5'-GG ACTACNNGGGTATCTAAT-3'。根 據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混池，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物濃度和片段大小，對目的條帶使用膠回收試劑盒切膠回收后測序。細菌16S rDNA樣品均在蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司（蘇州）的Illumina平臺（插入大小為300 bp，讀取長度為125 bp）上進行雙端測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個樣品數(shù)據(jù)采集重復(fù)3次，使用SPSS 20.0軟件進行方差分析和Tukey's相關(guān)性分析；使用Origin 9.1和GraphPad Prism 8作圖。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

使用UPRASE軟件進行序列分析。根據(jù)核糖體數(shù)據(jù)庫項目，通過UPARSE將序列讀數(shù)分類為可操作分類單位（OTU），其相似性截止值為97%。根據(jù)OTU的豐度計算細菌的Alpha多樣性（Shannon，Simpson和Chao1）。使用HemI 1.0和R（Version：3.1.1）繪制不同樣本中每個分類等級（門、科、屬、種）或OTU的熱圖和標(biāo)簽號。根據(jù)OTU水平上腸道菌群的相對豐度，使用SIMCA-14.1軟件（UMETRICS，瑞典）繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西老陳醋的主要成分

山西老陳醋的主要成分包括有機酸、糖、多酚和黃酮類等物質(zhì)，對山西老陳醋主要成分的含量進行測定，結(jié)果如表1所示。

表1 山西老陳醋的主要成分Tab.1 The main components of Shanxi aged vinegar

2.2 山西老陳醋對高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響

高脂大鼠模型的建立與給藥周期為12周，每周稱量并記錄一次體質(zhì)量，體質(zhì)量數(shù)據(jù)如表2所示。其中，第0周為初始體質(zhì)量，第8周為建模成功并2次分組后各組體質(zhì)量，第9～12周為各組飲食干預(yù)過程中各組體質(zhì)量。

由表2可知，第8周時，模型組和各日糧干預(yù)組體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于空白組8%～11%（P＜0.05）。隨著高脂日糧的持續(xù)攝入和各組不同日糧的干預(yù)，不同組別大鼠的體質(zhì)量變化呈現(xiàn)不同的趨勢。試驗結(jié)束時，各組12周齡體質(zhì)量呈現(xiàn)較大差異，山西老陳醋高劑量組和陽性對照PC組體質(zhì)量顯著低于模型組（P＜0.05），分別低9.9%和9.3%。相較于Vehicle組，HD組和PC組體質(zhì)量分別增加7.7%和8.4%，與第8周時體質(zhì)量相比，增加8.4%和8.2%，即HD和PC組體質(zhì)量增長趨勢與Vehicle組相近，說明HD和PC組的日糧干預(yù)很好地控制了高血脂癥大鼠體質(zhì)量的快速增長。另一方面，Model組與LD組無顯著差異，說明該組體質(zhì)量增長趨勢與Model組相近（第8～12周，體質(zhì)量增長30.0%）；MD組顯著低于Model組（P＜0.05），體質(zhì)量增長趨勢低于Model組（第8～12周，體質(zhì)量增長26.6%）；HD組極顯著低于Model組（P＜0.001），體質(zhì)量增長趨勢低于Model組（第8～12周，體質(zhì)量增長19.9%）。說明不同劑量山西老陳醋對高血脂癥大鼠的體質(zhì)量有不同的影響，存在劑量依賴性。

表2 山西老陳醋對高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響（n＝6）Tab.2 Effects of Shanxi aged vinegar on body weight of hyperlipidemic rats（n＝6）

2.3 山西老陳醋對高血脂癥大鼠血清脂質(zhì)代謝的影響

山西老陳醋對大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的影響如圖1所示。

圖1 山西老陳醋對大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平的影響Fig.1 Effects of Shanxi aged vinegar on serum levels of TC，TG，HDL-C and LDL-C in rats

血液中TC、TG、HDL-C和LDL-C水平與正常個體水平的差異是判定高血脂癥的重要指標(biāo)。由圖1可知，試驗結(jié)束后，與Vehicle組相比，Model組 大 鼠 血 清 中TC（P＜0.01）、TG（P＜0.001）、HDL-C（P＜0.001）和LDL-C（P＜0.01）水平均存在顯著性差異，說明高脂飲食的連續(xù)喂養(yǎng)誘導(dǎo)了大鼠血脂代謝紊亂。經(jīng)過連續(xù)4周的飲食干預(yù)，與Model組相比，各組TC、TG、HDL-C和LDL-C血清水平存在一定的差異。其中，HD和PC組的TC、TG和LDL-C水平均顯著低于Model組（P＜0.001、P＜0.05），HD和PC組的HDL-C水平均顯著高于Model組（P＜0.001）。說明高劑量的山西老陳醋可有效恢復(fù)脂質(zhì)代謝紊亂引起的血脂指標(biāo)紊亂。

2.4 山西老陳醋對高脂血癥大鼠腸道菌群多樣性的影響

長期高脂膳食往往會造成腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變。本研究通過對比Vehicle、Model、PC、NC和HD組高血脂癥大鼠腸道菌群的差異，探究山西老陳醋的飲食干預(yù)對高脂血癥大鼠的影響。

2.4.1 山西老陳醋對高脂血癥大鼠腸道菌群的α多樣性的影響通過腸道菌群ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)以反映各組腸道菌群α多樣性的差異[17]，結(jié)果如圖2所示，Model組的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著低于Vehicle組（P＜0.05），表明高脂飲食的長期攝入會顯著降低大鼠腸道菌群的豐富度；而HD組的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著高于Model組（P＜0.01），說明山西老陳醋的飲食干預(yù)可正向增加腸道菌群物種豐富度，并進一步抵消長期攝入高脂飲食對腸道菌群的負面影響。同時，與Model組相比，HD組的Shannon指數(shù)（P＜0.01）和Simpson指數(shù)（P＜0.05）存在顯著性差異。進一步說明山西老陳醋可以提高腸道菌群的多樣性。

圖2 山西老陳醋對腸道菌群α多樣性的影響Fig.2 Effect of gut microbiota α diversity induced by Shanxi aged vinegar

2.4.2 山西老陳醋對高脂血癥大鼠腸道菌群β多樣性的影響β多樣性分析可以通過PCA主成分分析顯示出不同組大鼠樣本間腸道菌群的多樣性差異。如圖3所示，Vehicle組與Model組腸道菌群群落在第1主成分方向顯著分開，表明高脂日糧的攝入會引起大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化；而HD組與Model組微生物群落差異較大，而與Vehicle組較為接近，表明山西老陳醋的飲食干預(yù)能夠?qū)Ω哐Y大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)異常產(chǎn)生較好的恢復(fù)作用，能使異常的腸道菌群群落恢復(fù)到正常的水平。

圖3 山西老陳醋對腸道菌群PCA的β多樣性的影響Fig.3 Effect of β-diversity of gut microbiota PCA induced by Shanxi aged vinegar

2.5 山西老陳醋對高脂血癥大鼠腸道菌群物種組成的影響

為進一步考察山西老陳醋對高血脂癥大鼠腸道菌群的影響，對Vehicle、Model、NC、PC、HD組大鼠的腸道微生物菌群組成進行統(tǒng)計分析。

2.5.1 山西老陳醋對高脂血癥大鼠腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)的影響如圖4所示，在門水平上，大鼠腸道菌群相對豐度大于1%的門有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）以及其他菌門（Others）。其中，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門序列累計最高可占到總序列的99%以上。Model組與Vehicle組差異比較結(jié)果顯示，長期攝入高脂飲食能夠顯著增加厚壁菌門（P＜0.05）、變形菌門（P＜0.01）的相對豐度，顯著降低擬桿菌門（P＜0.01）、放線菌門（P＜0.01）的相對豐度，且厚壁菌門與放線菌門的比例顯著增高（P＜0.01）。有文獻報道，F(xiàn)/B值（厚壁菌門/擬桿菌門）的增高會加劇機體患糖尿病和肥胖癥的風(fēng)險，比值降低能夠預(yù)防肥胖，而變形菌門（Proteobacteria）豐度的增高和放線菌門（Actinobacteria）豐度的降低與肝硬化的發(fā)生息息相關(guān)[18-19]。連續(xù)4周進行山西老陳醋的日糧干預(yù)，HD組對高血脂癥大鼠腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。與Model組相比，厚壁菌門（Firmicutes）（P＞0.05）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（P＜0.01）、變形菌門（Proteobacteria）（P＜0.001）和放線菌門（Actinobacteria）（P＜0.01）的豐度和F/B值（P＜0.01）均存在不同程度的差異影響，說明山西老陳醋能夠很好的抵消長期高脂飲食對機體血脂代謝的負面影響。

圖4 山西老陳醋對大鼠腸道微生物門水平結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)作用Fig.4 Regulating effect of Shanxi aged vinegar on structure of gut microbiota in rats at phylum level

2.5.2山西老陳醋對高脂血癥大鼠腸道菌群屬水平結(jié)構(gòu)的影響除上述Firmicutes、Bacteroidetes等在門水平變化以及相關(guān)指數(shù)F/B值外，還可調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠糞便腸道菌群屬水平上的變化。如圖5所示，大鼠屬水平涉及到的主要微生物有乳桿菌屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、普雷沃菌屬（Prevotella）、阿克曼氏菌屬（Akkermansia）、擬桿菌屬（Bacteroides）、異桿菌屬（Allobaculum）、脫 硫 弧 菌屬（Desulfovibrio）、顫 螺 菌 屬（Oscillibacter）等。

圖5 山西老陳醋對大鼠腸道屬水平結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)作用Fig.5 Regulating effect of Shanxi aged vinegar on structure of gut in rats at genera level

其中，Model組乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度低于Vehicle組，且呈極顯著差異（P＜0.001），表明高脂飲食的攝入可顯著降低乳桿菌屬（Lactobacillus）的豐度，而山西老陳醋的攝入可緩解這一趨勢。Model組與Vehicle組差異結(jié)果顯示，高脂飲食的攝入會顯著降低阿克曼氏菌屬（Akkermansia）的相對豐度（P＜0.05），而山西老陳醋的攝入可顯著提高高脂飲食導(dǎo)致的阿克曼氏菌屬（Akkermansia）的相對豐度（P＜0.01）。

另外，Model組與Vehicle組差異結(jié)果顯示，高脂飲食的攝入會顯著升高瘤胃球菌屬（Ruminococcus）的相對豐度（P＜0.01），而山西老陳醋的攝入可緩解此升高趨勢，呈現(xiàn)顯著下降作用（P＜0.05）。Model組與Vehicle組差異結(jié)果顯示，高脂飲食的攝入會顯著增加擬桿菌屬（Bacteroides）的相對豐度（P＜0.01），而山西老陳醋干預(yù)后擬桿菌屬（Bacteroides）的相對豐度顯著降低（P＜0.01）。同時高脂飲食的攝入會導(dǎo)致脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）等與肥胖相關(guān)致病菌的相對豐度的升高（P＜0.01），而山西老陳醋干預(yù)后其相對豐度有所降低（P＜0.05），表明山西老陳醋的干預(yù)可以調(diào)節(jié)高脂血癥引起腸道菌群屬水平的變化。

2.6 山西老陳醋對高血脂癥大鼠氧化應(yīng)激及肝功酶的影響

對各組大鼠血清中SOD、GSH-Px、MDA、AST和ALT的 檢 測 結(jié) 果 如 圖6所 示，Model組 血清中SOD和GSH-Px水平顯著低于Vehicle組（P＜0.001），MDA顯著高于Vehicle組（P＜0.01），同時，AST（P＜0.01）和ALT（P＜0.05）水平顯著高于Vehicle組，進一步證實了長期攝入高脂日糧在誘發(fā)機體氧化應(yīng)激紊亂的同時，會對機體肝臟造成一定的損傷。與Model組相比，HD組血清SOD（P＜0.001）、GSH-Px（P＜0.01）、MDA（P＜0.05）、AST（P＜0.01）和ALT（P＜0.01）水平均存在顯著性差異，同時與Vehicle組各指標(biāo)均無顯著性差異（P＜0.05），說明山西老陳醋連續(xù)4周的日糧干預(yù)，能夠顯著提升機體抗氧化指標(biāo)、降低氧化應(yīng)激水平并增加血液中肝功酶的含量，表明山西老陳醋具有顯著的抗氧化活性及肝損傷保護作用。

圖6 山西老陳醋對大鼠血清抗氧化成分SOD、GSH-Px和MDA以及肝功酶AST和ALT水平的影響Fig.6 Effects of Shanxi aged vinegar on the levels of the serum antioxidant components SOD，GSH-Px，and MDA，and liver enzymes AST and ALT in rats

2.7 山西老陳醋對高血脂癥大鼠血清炎癥因子的影響

炎癥是高脂血癥的另一個關(guān)鍵因素。圖7顯示了各組IL-2、IL-6、IL-12、TNF-ɑ血清水平檢測結(jié)果，其中，Model組與Vehicle組相比，血清中IL-

圖7 山西老陳醋對大鼠血清炎癥因子水平的影響Fig.7 Effects of Shanxi aged vinegar on the level of serum inflammatory factors in rats

2（P＜0.001）、IL-6（P＜0.001）、IL-12（P＜0.01）、TNF-ɑ（P＜0.01）炎癥因子水平均顯著增高，表明長期高脂飲食的攝入會誘導(dǎo)機體炎性反應(yīng)，與文獻報道結(jié)果一致[20]；與Model組相比，HD組炎癥因子水平均顯著降低（P＜0.001、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01），說明高劑量山西老陳醋能夠很好地降低機體炎性反應(yīng)水平；與Model組相比，LD組和MD組血清炎癥因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-ɑ均有不同程度降低，但LD組各指標(biāo)均無顯著性差異（P＞0.05），表明山西老陳醋對機體炎性反應(yīng)的影響，在一定范圍內(nèi)存在劑量依賴關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，山西老陳醋是一種健康食品，每天食用一定量的山西老陳醋能夠有效抑制大鼠長期高脂飲食帶來的體質(zhì)量過快增長，有效改善高血脂癥大鼠的脂質(zhì)代謝指標(biāo)，同時增加高血脂癥大鼠腸道菌群的多樣性與豐富度，有效改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成，抑制長期高脂飲食對大鼠腸道菌群的負面效應(yīng)。有研究報道，乳桿菌屬（Lactobacillus）作為益生菌，能減輕試驗動物由飲食引起的體質(zhì)量增加和肥胖[21]。此外，乳桿菌屬可發(fā)酵食物中的糖類物質(zhì)產(chǎn)生乳酸，既能降低腸道環(huán)境pH值、抑制致病菌的生長，又能刺激免疫系統(tǒng)的發(fā)育和完善，增強宿主免疫力[22-23]。瘤胃球菌屬（Ruminococcus）與代謝紊亂存在關(guān)聯(lián)，在正常宿主腸道內(nèi)的相對豐度較高[24]；一些擬桿菌屬（Bacteroides）具有致病性，可引起腸道炎癥[25]，與本研究結(jié)果一致。山西老陳醋通過降低擬桿菌屬（Bacteroides）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）等促炎致病菌屬的豐度，增加乳桿菌屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、阿克曼氏菌屬（Akkermansia）等有益菌的豐度，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝失調(diào)。

有研究證實，長期攝入高脂飲食會在體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，使機體呈現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，并對肝臟造成一定程度的損傷[26-27]。一些研究報道，長期高脂肪飲食會誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，引起血清中炎癥因子水平升高[28]。山西老陳醋能夠緩解長期高脂飲食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用并有效防止肝損傷，同時顯著降低高脂血癥引起的炎癥反應(yīng)。本研究在進一步明確山西老陳醋具有改善機體脂質(zhì)代謝能力的基礎(chǔ)上，從腸道菌群、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等多方面進行全面分析，深入探討了山西老陳醋調(diào)節(jié)血脂代謝的作用機制。

本研究表明，山西老陳醋可改善由長期高脂飲食引起的脂質(zhì)代謝失調(diào)并調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂。綜上所述，山西老陳醋可能是一種具有抗氧化、抗炎癥、可恢復(fù)腸道正常微生物群落生態(tài)和治療代謝性疾病的產(chǎn)品，為未來開發(fā)新型營養(yǎng)健康的功能食品提供了新的思路。在目前工作的基礎(chǔ)上，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變是否會進一步影響腸道內(nèi)代謝物質(zhì)，進而對腸道功能產(chǎn)生不同影響，最終導(dǎo)致肥胖、高脂血癥等慢性代謝疾病的發(fā)生，還有待進一步研究。