陳化六堡茶的主要品質(zhì)化學(xué)成分及其抗氧化活性分析

楊高中，馬士成，張 悅，林 智，呂海鵬

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.梧州市六堡茶研究會，廣西梧州 543000）

六堡茶是選用廣西壯族自治區(qū)蒼梧縣群體種、廣西大中葉種及其分離、選育的品種、品系茶樹的鮮葉為原料，按特定的工藝加工而成的，是我國代表性黑茶產(chǎn)品之一，具有獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)和保健功效[1-2]。研究表明，六堡茶與茯磚茶[3]、普洱茶[4]等其他黑茶類似，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、腸道菌群等保健功效，倍受越來越多消費(fèi)者的關(guān)注和喜愛。ZHU等[5]采用六堡茶提取物干預(yù)治療高血糖小鼠模型，發(fā)現(xiàn)六堡茶提取物能夠通過增加腸道菌群的多樣性（增加有益細(xì)菌的豐度，并減少有害細(xì)菌的豐度），從而緩解高血糖引起的代謝紊亂。吳文亮等[6]研究發(fā)現(xiàn)，陳年六堡茶能有效抑制高脂血癥小鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量等指標(biāo)增加，顯著緩解肝臟中脂肪堆積。長期以來，陳化工藝對黑茶風(fēng)味品質(zhì)和生物活性的影響已經(jīng)成為了黑茶研究中的重要熱點問題。CHENG等[7]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法對不同貯藏年份青磚茶的特征代謝成分進(jìn)行檢測，研究發(fā)現(xiàn)，長達(dá)10 a的儲藏時間有利于改善青磚茶的苦澀味，這主要與黃酮類成分的甲基化、糖基化修飾以及氧化降解有關(guān)。經(jīng)過一定時間的貯存陳化，六堡茶中的生化成分在濕熱及微生物的作用下發(fā)生一些變化，其品質(zhì)可得到較大提高[8]。然而，目前對不同陳化年份六堡茶的抗氧化活性及其主要品質(zhì)化學(xué)成分鮮有報道。

食品的抗氧化活性評價通常采用化學(xué)分析法和生物學(xué)分析法兩類，前者主要包括清除1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基活性、鐵離子還原（Ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法、清除2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）自由基活性以及清除超氧陰離子自由基活性等；后者例如細(xì)胞抗氧化法（Cellular antioxidant activity，CAA）則更具生物相關(guān)性[9]。有研究指出，在抗氧化分析中，宜選用多種方法同時進(jìn)行分析檢測，從而對其進(jìn)行更全面的抗氧化活性評價[10]。

本研究選用不同陳化時間的六堡茶樣品為研究對象，首先檢測分析茶湯中的主要化學(xué)成分的含量水平等，其次分別采用化學(xué)分析法和生物學(xué)方法等評價它們的抗氧化活性，最后再進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在為揭示不同陳化時間對六堡茶產(chǎn)品主要品質(zhì)化學(xué)成分和抗氧化活性的影響提供參考依據(jù)，豐富六堡茶陳化的基礎(chǔ)理論。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料15個具有代表性的六堡茶樣品（編號為LPT1～LPT15），主要由梧州市六堡茶研究會提供，少量樣品采集自市場。根據(jù)樣品的不同陳化時間進(jìn)行分類，將該批次樣品分為3組，即陳化6 a的樣品、陳化8 a左右的樣品以及陳化10 a以上的樣品。

1.1.2 主要試劑表沒食子酸兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表沒食子酸沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、2，2'-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS），購于Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；沒食子酸（GA）標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑藍(lán)、核黃素，購于國藥集團(tuán)；Hank's平衡鹽溶液、DMEM培養(yǎng)基，購于美國Gibco公司；胎牛血清，購于杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素-鏈霉素溶液，購于碧云天生物技術(shù)研究所；2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、人肝癌細(xì)胞系HepG2，購于北京嘉美生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純），購于德國Merck公司；冰乙酸、甲酸、硫酸亞鐵、三氯化鐵、過硫酸鉀、醋酸鈉均為分析純，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；去離子水，采用Milli-Q水凈化系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司），1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Varioskan Flash酶 標(biāo) 儀、Hepa Class 100二 氧 化 碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 陳化六堡茶樣品的感官審評及水浸出物含量分析委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心對樣品進(jìn)行感官審評（GB/T 23776—2018）；茶葉水浸出物含量測定參照GB/T 8305—2013進(jìn)行。

1.3.2 茶湯制備稱取3.0 g茶樣于三角瓶中，加入150 mL的100℃去離子水浸提5 min，脫脂棉過濾；冷卻后過0.45 μm水膜，貯藏于4℃冰箱待測。

1.3.3 陳化六堡茶樣品的主要化學(xué)成分測定茶多酚采用酒石酸亞鐵法測定（參照GB/T 8313—2002）；兒茶素采用高效液相色譜方法測定；茶褐素采用系統(tǒng)比色法測定；黃酮總量采用三氯化鋁比色法測定；游離氨基酸總量采用茚三酮比色法測定（GB/T 8314—2013）。

1.3.4 陳化六堡茶樣品的抗氧化活性分析

1.3.4.1 鐵離子還原法（FRAP法）測定總抗氧化活性參照文獻(xiàn)[11]的方法，采用鐵離子還原法測定總抗氧化活性。以1.0 mmol/L FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品的總抗氧化能力（FRAP值）采用達(dá)到相同吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示，單位為μmol/L。

1.3.4.2 清除DPPH自由基活性測定參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行測定。式中，A對照為對照組的吸光度；A樣品為樣品組的吸光度。

1.3.4.3 清除ABTS自由基活性測定 參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行測定。

1.3.4.4 超氧陰離子自由基活性測定參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

式中，A0為樣品避光反應(yīng)30 min后的吸光度；A1為樣品反應(yīng)30 min后的吸光度；A2為采用去離子水取代樣品反應(yīng)30 min后的吸光度。

1.3.4.5 細(xì)胞抗氧化能力測定參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。茶湯的細(xì)胞抗氧化能力（CAA值）以每100 mg干物質(zhì)等同于槲皮素的微摩爾當(dāng)量表示，單位為

μmol/100 mg。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗所有數(shù)據(jù)的差異顯著性分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行，采用GraphPad prism 9進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳化六堡茶樣品的感官審評結(jié)果及其水浸出物含量分析

陳化六堡茶樣品感官審評結(jié)果及其水浸出物含量分析如表1所示。

從表1可以看出，該批次樣品中，水浸出物含量在33.5%以上的樣品（LPT-3、LPT-6、LPT-7、LPT-8、LPT-14、LPT-15），均表現(xiàn)出外形緊，湯色紅亮或橙黃明亮，滋味和、醇，葉底軟、褐的品質(zhì)特點；水浸出物含量在30.0%～33.5%的樣品（LPT-1、LPT-2、LPT-4、LPT-5），存在外形棕褐、梗多，湯色較亮，滋味醇，葉底暗褐的品質(zhì)特點；水浸出物含量在28.0%～30.0%的樣品（LPT-9、LPT-10、LPT-11），存在外形欠緊實、葉底硬、暗褐的特點。此外，由于LPT-12和LPT-13這2個樣品水浸出物含量較低，低于《地理標(biāo)志產(chǎn)品 六堡茶》（DB45/T 1114—2014）中所規(guī)定的最低要求，故在本研究的后續(xù)分析中剔除了這2個樣品。

2.2 陳化六堡茶樣品中主要化學(xué)成分的含量水平分析

13個陳化六堡茶樣品茶湯中的水浸出物、茶多酚、游離氨基酸總量、黃酮總量、兒茶素總量、兒茶素組分、沒食子酸以及茶褐素的檢測分析結(jié)果如表2所示。水浸出物高低反映了茶葉中可溶性物質(zhì)的多少，本研究中水浸出物含量介于1.502～3.846 mg/mL，其中，六堡茶樣品LPT-6、LPT-7的水浸出物含量具有較高水平，分別達(dá)到了3.846、3.048 mg/mL。本研究中茶多酚含量存在較大差異，總體上介于0.225～1.755 mg/mL，其中含量最大值為LPT-6樣品（1.755 mg/mL）。茶葉中的游離氨基酸對茶葉的品質(zhì)具有重要作用，本研究中游離氨基酸總量介于0.056～0.142 mg/mL，其中，LPT-6樣品具有最高含量（0.142 mg/mL）。13個陳化六堡茶樣品茶湯中黃酮總量差異不大，總體上介于0.066～0.138 mg/mL；而兒茶素總量的差異較大，介于0.015～0.581 mg/mL。茶葉中的兒茶素成分，除LPT-6樣品的EGC和EGCG含量較高外，其他樣品的茶湯中在兒茶素各組分的含量上均差異不大。本研究中酚酸的代表性物質(zhì)沒食子酸含量介于0.003～0.098 mg/mL，其中，LPT-7樣品沒食子酸含量最高（0.098 mg/mL），而LPT-14樣品的沒食子酸含量最低，僅0.003 mg/mL。此外，茶褐素是六堡茶中重要的品質(zhì)化學(xué)成分[15]，本研究中其含量水平介于0.312～0.845 mg/mL?？傮w而言，隨著陳化時間的增加，六堡茶茶湯中水浸出總量、茶多酚、兒茶素總量以及游離氨基酸等主要化學(xué)成分含量呈下降趨勢，而茶褐素含量呈增加趨勢。需要指出的是，本研究中茶湯的提取方式主要參考常規(guī)飲茶的情況開展的，鑒于茶葉沒有粉碎且提取時間較短等因素，檢測結(jié)果中主要化學(xué)成分的含量水平要明顯低于茶葉常規(guī)理化檢測中的含量水平。

表2 陳化六堡茶茶湯中的主要化學(xué)成分的含量比較Tab.2 Comparison of the content of main chemical components in tea infusion of aged Liupao tea mg/mL

2.3 不同陳化時間六堡茶的抗氧化活性分析

從圖1可以看出，隨著陳化時間的延長，六堡茶的FRAP值存在降低的趨勢。陳化6 a的六堡茶樣品的FRAP值介于1.48～3.23 μmol/L，平均值為2.62 μmol/L；統(tǒng)計分析表明，其FRAP值顯著高于另外2組六堡茶樣品（P＜0.05）。陳化8 a左右的六堡茶樣品的FRAP值介于1.69～1.83 μmol/L，平均值為1.74 μmol/L；而陳化10 a以上的六堡茶樣品的FRAP值 介 于1.00～1.58 μmol/L，平 均 值 為1.27 μmol/L；統(tǒng)計分析表明，這2組樣品的FRAP值不存在顯著差異（P＞0.05）。此外，不同陳化時間六堡茶樣品的清除DPPH、ABTS以及超氧陰離子自由基活性均表現(xiàn)出了類似的規(guī)律，即一般隨著陳化時間增加而活性降低。其中，陳化6 a的六堡茶樣品對3種自由基的清除率均為最高，平均值分別為78.39%、56.48%、84.07%，表明其抗氧化活性最強(qiáng)。而陳化10 a以上的六堡茶樣品的3種自由基清除率均為最低，平均值分別為61.02%、30.91%、68.64%，且均顯著低于陳化6 a的樣品（P＜0.05）。

圖1 不同陳化時間六堡茶的抗氧化活性分析Fig.1 Antioxidant activities of Liupao tea with different aging time

CAA值以槲皮素的微摩爾當(dāng)量表示，反映了該物質(zhì)的細(xì)胞抗氧化活性強(qiáng)弱，該數(shù)值越大則表明其細(xì)胞抗氧化活性越強(qiáng)。不同年份六堡茶的細(xì)胞抗氧化活性分析結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，陳化6 a以及8 a左右、10 a以上的六堡茶樣品的槲皮素當(dāng)量平均值分別為2.18、2.62、3.21 μmol/100 mg。統(tǒng)計分析表明，本研究中陳化6 a的六堡茶樣品的CAA活性顯著低于陳化10 a以上的六堡茶樣品的CAA活性（P＜0.05），可見，隨著陳化時間的延長，六堡茶的CAA活性具有一定的增加趨勢。

圖2 不同陳化時間六堡茶的CAA抗氧化活性分析Fig.2 CAA activities of Liupao tea with different aging time

2.4 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明（表3），采用化學(xué)分析法檢測的六堡茶的抗氧化活性與其水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、EGC、EC等化學(xué)成分的含量水平存在較強(qiáng)的相關(guān)性。由表3可知，茶多酚含量與六堡茶的FRAP值、DPPH自由基清除率以及超氧陰離子自由基清除率的相關(guān)性系數(shù)分別達(dá)到了0.757、0.740、0.745，且均達(dá)到極顯著相關(guān)水平（P＜0.01）。此 外，EC與FRAP值、DPPH自由 基 清除 率 以及ABTS自由基清除率在0.01水平上表現(xiàn)出極顯著相關(guān)，而與超氧陰離子自由基清除率在0.05水平上表現(xiàn)顯著相關(guān)；其他兒茶素成分C、EGCG以及ECG等與其抗氧化活性均不存在相關(guān)性關(guān)系。本研究中，沒食子酸的含量與抗氧化活性檢測中FRAP值在0.05水平上表現(xiàn)出顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.637。值得注意的是，茶褐素作為六堡茶中重要的品質(zhì)化學(xué)成分，在本研究中發(fā)現(xiàn)該成分與六堡茶4種化學(xué)分析法檢測的抗氧化活性之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這與ZHOU等[16]的研究結(jié)果基本趨于一致。陳化六堡茶的細(xì)胞抗氧化能力與本研究中主要品質(zhì)化學(xué)成分的含量水平不存在較強(qiáng)的相關(guān)性；其CAA活性與茶褐素的含量呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，但未達(dá)到顯著性水平。

表3 六堡茶主要化學(xué)成分含量與其抗氧化活性的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of the content of the main chemical components of Liupao tea and their antioxidant activity

3 結(jié)論與討論

近年來，關(guān)于六堡茶的化學(xué)成分研究逐漸增多，科研工作者已經(jīng)從六堡茶中分離鑒定出一些新的酚性化合物成分以及棕櫚酸、沒食子酸甲酯、α-菠甾醇等[1，17]。研究表明，六堡茶隨著陳化時間的延長，咖啡堿和茶褐素的含量呈上升趨勢，而水浸出物含量、游離氨基酸總量、茶多酚含量呈減少趨勢，與本研究的結(jié)果基本趨于一致[8]。隨著陳化時間的增加，六堡茶中的單體兒茶素可能進(jìn)一步通過微生物分解的胞外酶氧化聚合成茶色素（如茶黃素、茶紅素和茶褐素）或降解為酚酸（例如沒食子酸、原兒茶酸和咖啡酸），而游離氨基酸組分則被作為氮源被代謝消耗[18]。總體上，陳化條件的差異可能是影響六堡茶感官品質(zhì)和理化成分變化快慢的重要因素之一。

綜合分析本研究中不同陳化時間六堡茶的抗氧化活性差異，可見隨著陳化時間的延長，采用化學(xué)分析法檢測的六堡茶的抗氧化活性（FRAP值、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率）都存在降低的趨勢，這與普洱茶的研究結(jié)果類似[19]。在本研究中，一般是陳化6 a樣品的抗氧化活性最強(qiáng)，陳化8 a左右的樣品次之，而陳化10 a以上的樣品最弱；總體上，3組樣品相比，陳化6 a的樣品與陳化10 a以上的樣品一般都存在顯著性差異（P＜0.05）。茶多酚類化合物是茶葉中重要的抗氧化活性成分，隨著陳化時間的增加，茶多酚含量呈現(xiàn)出下降趨勢，可能是導(dǎo)致不同陳化年份六堡茶的抗氧化活性差異的重要因素。另外，相較于上述4種化學(xué)抗氧化活性分析法，細(xì)胞抗氧化活性的生物相關(guān)性更強(qiáng)，能更好地預(yù)測體內(nèi)的抗氧化活性。采用生物學(xué)方法檢測六堡茶的細(xì)胞抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，隨著陳化時間的延長，其細(xì)胞抗氧化活性具有一定的增加趨勢。以往有研究表明，黑茶茶色素提取物具有細(xì)胞抗氧化活性，其作用機(jī)理可能是通過提高清除細(xì)胞活性氧的酶活力和促進(jìn)合成還原性物質(zhì)來實現(xiàn)的[20]。此外，在六堡茶的陳化過程中，可能產(chǎn)生了一些新的活性成分從而增強(qiáng)了其細(xì)胞抗氧化活性，還有待后續(xù)進(jìn)一步開展研究。受試驗樣品等諸多限制，本研究中未能設(shè)置當(dāng)年的六堡茶樣品以及陳化3 a左右的樣品進(jìn)行檢測（未能取得一定數(shù)量的代表性樣品），因此，不能分析陳化初期階段六堡茶主要化學(xué)成分及其抗氧化活性的變化規(guī)律情況。同時，本研究中所分析的六堡茶樣品也可能受到茶樹品種、采摘季節(jié)、制作工藝、存貯方法等多種不同因素的影響。因此，在后續(xù)研究中，宜選用相同鮮葉原料制作的一批六堡茶樣品，在趨于相同的儲存環(huán)境下，逐年度取樣分析樣品的抗氧化活性變化情況，這對于揭示六堡茶的抗氧化活性變化規(guī)律及其陳化機(jī)制等具有重要意義。

多酚類化合物，如兒茶素（尤其是EGCG），是綠茶、烏龍茶以及白茶等發(fā)揮體外抗氧化活性的重要化學(xué)成分[21]。作為一種微生物發(fā)酵茶，六堡茶中的重要抗氧化成分尚需進(jìn)一步研究。本研究中陳化六堡茶的茶多酚總量、EGC、EC等化學(xué)成分與化學(xué)抗氧化方法存在顯著相關(guān)性。ZHOU等[16]研究表明，普洱茶中的茶多酚、兒茶素和2種黃酮（蘆丁和山柰酚）的多酚成分與其體外抗氧化活性（如FRAP值、DPPH自 由 基清除率 以 及ABTS自 由 基清除率）具有一定的相關(guān)性，這與本研究結(jié)果基本趨于一致。

本研究結(jié)果表明，6 a以及8 a左右和10 a以上等不同陳化時間的六堡茶中主要品質(zhì)化學(xué)成分的含量水平存在較大的差異，其中水浸出物含量、茶多酚、游離氨基酸總量、黃酮總量、兒茶素總量、ECG、EC、EGCG、EGC、C、沒食子酸等化學(xué)成分一般隨著陳化時間的增加有降低的趨勢，而茶褐素有增加的趨勢。不同陳化時間對六堡茶的抗氧化活性也具有重要影響，六堡茶的清除DPPH自由基活性、清除ABTS自由基活性以及清除超氧陰離子自由基活性等一般隨著陳化時間的增加呈降低的趨勢，而細(xì)胞抗氧化能力有增加趨勢。陳化六堡茶的抗氧化活性一般與水浸出物總量、茶多酚總量、EGC、EC等化學(xué)成分的含量水平存在較強(qiáng)的相關(guān)性，六堡茶陳化過程中化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化規(guī)律后續(xù)需要開展進(jìn)一步研究。