益生菌安全性與功能性評價方法研究進(jìn)展

張國華，田慧穎，何國慶

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

益生菌的英文是Probiotics，最早來源于希臘語的pro bios，意思是For life，即終生、益生的意思[1]。Probiotics在1953年首次被提出，它是一種包含了抗生素和抑菌物質(zhì)的有益食品的結(jié)合體[2]。1965年，LILLY等[3]研究認(rèn)為，Probiotics是由微生物產(chǎn)生的生長促進(jìn)因子。羅伊·富勒于1989年第1次在益生菌的概念中引進(jìn)了微生物的活性和有益作用[4]。2001年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）/世界衛(wèi)生組織（WHO）共同提出了益生菌的科學(xué)定義：益生菌是指在攝入足夠多的情況下，對人體健康有益的微生物。2014年，國際益生菌與益生元聯(lián)盟發(fā)表共識，就益生菌的概念提出了三大基本特性，即足夠數(shù)量、活菌狀態(tài)、有益健康功能[5]。

目前，益生菌主要有以下幾類：（1）乳酸菌，包括乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌；（2）不產(chǎn)乳酸型細(xì)菌，包括芽胞桿菌、丙酸菌；（3）非病原性酵母，包括酵母菌；（4）無芽胞和無鞭毛的一類桿菌或球桿菌[6]。

日本科學(xué)家代田稔于1930年從人體腸道中分離出一種能夠耐胃酸的乳酸桿菌，將其命名為干酪乳桿菌代田株（Lactobacillus caseistrain shirota）。之后，日本生產(chǎn)的乳酸菌飲品養(yǎng)樂多標(biāo)志著益生菌進(jìn)入了工業(yè)化生產(chǎn)階段[7]。隨著益生菌在乳制品、休閑食品、發(fā)酵果蔬制品等產(chǎn)品上廣泛的應(yīng)用，它的安全問題以及健康功效是否可靠變成了消費者關(guān)注的重點。人們一般認(rèn)為，乳桿菌與雙歧桿菌這2個一直用于保健品的益生菌是安全的，但隨著科學(xué)發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)原則上一切微生物都能成為人體中潛在的致病菌。Philippe研究認(rèn)為，益生菌對人體的危害主要有進(jìn)入血液引起全身感染、產(chǎn)生有毒代謝物、食用后產(chǎn)生免疫刺激以及耐藥基因的轉(zhuǎn)移[8]。但目前國內(nèi)對益生菌的安全性和功能性評價的研究仍處于落后狀態(tài)。

近年來大量研究顯示，益生菌對人體的健康發(fā)揮了巨大作用。益生菌可以調(diào)節(jié)人體腸道正常菌群、維持體內(nèi)微生態(tài)平衡、促進(jìn)食物消化和潤腸通便等。文章將主要介紹目前我國益生菌的安全性及功能性評價的方法，以期對未來益生菌的發(fā)展提供幫助。

1 對益生菌進(jìn)行安全性與功能性評價的必要

首先，益生菌的定義就要求了益生菌的安全性與功效性。2020年，中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會益生菌分會發(fā)布了《益生菌的科學(xué)共識（2020年版）》，指出益生菌3個核心特征為足夠數(shù)量、活菌狀態(tài)和有益健康功能[9]。在國家市場監(jiān)督管理總局公開的《益生菌類保健食品申報與審評規(guī)定（征求意見稿）》中第二條也明確指出：益生菌系指活的微生物，當(dāng)攝取足夠數(shù)量時，對宿主健康有益[10]。益生菌的保健食品是一種以益生菌為主要功能成分的微生物產(chǎn)品，當(dāng)攝入足夠數(shù)量時，可以對人體健康起有益作用。益生菌類的保健食品必須保證食用安全，不得對人體產(chǎn)生任何急性、亞急性或者慢性的危害[11]。

其次，一些益生菌的安全性與功效性都不盡相同?！兑嫔惐＝∈称飞陥笈c審評規(guī)定（征求意見稿）》中第三條指出：生產(chǎn)益生菌類保健食品所用菌種（株）的生物學(xué)、遺傳學(xué)、功效學(xué)特性應(yīng)明確和穩(wěn)定，菌種（株）及其代謝產(chǎn)物必須無毒無害。國家衛(wèi)生行政部門發(fā)布的可用于食品的菌種（株）可用于益生菌類保健食品，菌種（株）除符合安全性的要求外，還應(yīng)具有充足的研究數(shù)據(jù)和科學(xué)共識支持其具有保健功能[10]。

因此，對益生菌的安全性與功能性進(jìn)行評價很有必要，否則會極大地限制益生菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，甚至可能產(chǎn)生一定的安全風(fēng)險。

2 益生菌安全性評價方法

《食品用益生菌安全性評價指導(dǎo)原則》對益生菌的評價，主要包括4個方面：（1）菌種鑒定到株；（2）功能評價；（3）安全性評價；（4）對益生菌產(chǎn)品標(biāo)簽信息的規(guī)范要求[12]。

FAO/WHO認(rèn)為，益生菌的安全評估應(yīng)從評估其對抗生素的耐藥性開始。同時也要對它的代謝產(chǎn)物進(jìn)行評估，評估人體試驗產(chǎn)生的不良副作用；以及在市場上出售后，有必要對發(fā)生的不良反應(yīng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。若所用的益生菌菌株所屬的菌種具有溶血活性，那么被評估的菌株就需要進(jìn)行溶血試驗。另外，F(xiàn)AO/WHO專家小組強烈建議，應(yīng)評估益生菌菌株對免疫功能低下的模型動物是否具有感染性[12]。

目前，我國對益生菌菌種（株）安全評價主要圍繞菌種鑒定、動物致病性試驗、產(chǎn)毒試驗、耐藥性試驗4個方面。

2.1 菌種鑒定

通過分類鑒定，確定益生菌的菌種，是評價其安全性的重要依據(jù)，也是評價其安全性的首要步驟。通過對評價菌株的菌屬特征的了解，研究人員可以對其進(jìn)行初步判斷和預(yù)測。

對于菌種鑒定，各國和組織都有相應(yīng)的法律法規(guī)。如歐洲食品安全局制定的“安全合理假設(shè)”（QPS）中，將精確識別益生菌作為評價微生物安全性的依據(jù)和先決條件[13]。FAO/WHO則認(rèn)為，菌株應(yīng)先進(jìn)行表型試驗，然后采用DNA/DNA雜交、16S RNA序列測定以及其他可靠的方法進(jìn)行遺傳學(xué)鑒別，并采用DNA脈沖場梯度凝膠電泳法（PFGE）對該菌株進(jìn)行鑒別，經(jīng)過多種方法結(jié)合，菌種鑒定的可靠性和精確性會大幅提高[14]。

我國標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于雙歧桿菌檢驗（GB 4789.34—2016）、乳酸菌檢驗（GB 4789.35—2016）的菌種鑒定，主要以生理生化鑒定作為菌種鑒定依據(jù)，新的指導(dǎo)原則里也提出要采用分子生物手段進(jìn)行菌種鑒定到菌株水平。目前，全基因組測序已成為國際上菌種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。通過全基因組測序，可以提供菌株是否含有致病基因、環(huán)境抗性基因、耐藥基因、產(chǎn)毒基因等信息。在我國《保健食品原料用菌種安全性檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（2020年版）》中，菌種鑒定除了常規(guī)生理生化特性試驗，還增加了全基因組測序。用于保健食品的益生菌菌株需要提供基于表型及基因測序技術(shù)鑒定到種水平的資料，同時作為保健食品的功效成分（活菌），還應(yīng)提供鑒定到株水平的資料[15]。

2.2 動物致病性試驗

為了科學(xué)和管理，益生菌菌株在廣泛投入生產(chǎn)之前需要評估其安全性，一般是進(jìn)行體內(nèi)試驗。通過體內(nèi)模型，可以評估益生菌的毒性以及可能對宿主造成嚴(yán)重的疾病和免疫缺陷。研究人員通過建立不同的動物模型，可以更好地研究益生菌的作用機制，及其對人體健康和安全方面的影響。在研究益生菌的過程中，經(jīng)常采用有脊椎的動物進(jìn)行體內(nèi)試驗，最常用的是小鼠和大鼠。在獸醫(yī)界，其他動物和魚類也被用來進(jìn)行益生菌的體內(nèi)研究[16]。

致病性（pathogenicity）是指被試細(xì)菌對宿主的致病能力，由其種屬特征決定。不同細(xì)菌的致病性存在著一定的差別，這與細(xì)菌自身的侵襲力和它們的代謝產(chǎn)物有關(guān)。自2000年起，全國食品安全風(fēng)險評價中心共檢測了200多株益生菌，經(jīng)灌胃試驗發(fā)現(xiàn)，它們并無致病性，經(jīng)對小鼠進(jìn)行腹腔注射試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌數(shù)達(dá)到1.0×109cfu/mL時，個別菌株可致病。這也表明，當(dāng)前市場上的益生菌菌株都是安全的。

參照美國的有關(guān)規(guī)定，在動物致病性試驗中，既要進(jìn)行灌胃，還要進(jìn)行腹腔注射，觀察期為21 d，灌胃量是腹腔注射量的10倍。我國的《保健食品用菌種致病性評價程序（征求意見稿，2020）》也提出了相似的評價方法[17]。

2.3 產(chǎn)毒試驗

對于一些可能會產(chǎn)生毒性的微生物，必須在不同的環(huán)境中（單品種固體、多品種固體復(fù)合、不同成分的液體組合）進(jìn)行產(chǎn)毒試驗，并根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法或國際組織/相關(guān)國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進(jìn)行代謝產(chǎn)物含量的測定[18]。從我國批準(zhǔn)的可用作保健食品的菌種清單來看，紅曲霉屬應(yīng)進(jìn)行桔青霉素產(chǎn)毒試驗[17]。

可作為保健食品生產(chǎn)用的菌種，試驗結(jié)果需要出現(xiàn)以下結(jié)果1個以上：第一，3個以上國家批準(zhǔn)作為食品或保健食品用菌種且具有長期（30 a以上）的使用歷史；第二，全基因序列分析結(jié)果顯示，不存在已知的毒力相關(guān)基因或毒素合成關(guān)鍵基因；第三，動物試驗顯示無致病性；第四，產(chǎn)毒試驗結(jié)果顯示在受試的基質(zhì)中均不產(chǎn)生有毒活性代謝產(chǎn)物[17]。

如果全基因序列分析發(fā)現(xiàn)存在已知毒力基因、動物試驗結(jié)果顯示有致病性以及產(chǎn)毒試驗發(fā)現(xiàn)菌種可產(chǎn)生有毒代謝物，則此菌株被認(rèn)為有致病風(fēng)險，不可以生產(chǎn)保健食品[17]。

2.4 耐藥性試驗

在安全評價中，益生菌的耐藥問題最為突出。對于益生菌而言，適當(dāng)?shù)哪退幮允怯幸娴?，不會因為接觸到抗生素而受到壓制，并且許多益生菌和乳酸菌自身就具有一定的抗性基因。一些乳桿菌屬的菌株天然對氨芐西林、萬古霉素、環(huán)丙沙星等具有抗性，但尚未發(fā)現(xiàn)能將其移植到其他菌株中。歐洲食品安全局（EFSA）明確指出，益生菌不能攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥基因。今后，就益生菌的耐藥問題而言，研究應(yīng)著重于研究其有無可轉(zhuǎn)移的耐藥基因的存在[19]。

3 益生菌功能性評價方法

研究表明，益生菌具有調(diào)節(jié)菌群平衡的作用，可以益生保健。許多研究顯示，益生菌具有調(diào)節(jié)人體腸道正常菌群、維持體內(nèi)微生態(tài)平衡、促進(jìn)食物消化和潤腸通便等功能。益生菌還具有降低膽固醇、改善肝功能、緩解乳糖不耐癥、抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長繁殖、刺激組織發(fā)育等方面的功效[20]。由此可見，隨著科技的進(jìn)步，人們對益生菌的認(rèn)識和擴大，益生菌為人類健康作出了無可取代的貢獻(xiàn)。

《食品益生菌評價指南》中，F(xiàn)AO/WHO對益生菌的功能進(jìn)行了評估（Functional characterization），其中包含了對胃酸抗性、對膽汁酸的抗性；對腸道上皮細(xì)胞的黏附性；對有害致病菌的拮抗性；降低致病菌的黏附性；關(guān)于膽汁酸鹽的水解能力等。

目前，《允許保健食品聲稱的保健功能目錄 非營養(yǎng)素補充劑（2020年版）（征求意見稿）》中有24項保健功能。其中與益生菌關(guān)系最為密切的功能主要是提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群功能和潤腸通便[21]。

3.1 有助于增強免疫力

免疫力是指人體在對外防御和對內(nèi)部環(huán)境保持穩(wěn)定的一種能力，受飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣和心理壓力等多種因素影響。目前，有很多研究均表明，益生菌可以增強人的免疫力。評價一株益生菌是否可以對機體的免疫力造成影響，研究人員一般使用正?；蛎庖吖δ艿拖碌哪Ｐ蛣游镞M(jìn)行試驗，必做測試指標(biāo)主要有體質(zhì)量、臟器/體質(zhì)量、胸腺/體質(zhì)量、脾臟/體質(zhì)量等，還需要研究被測動物的細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞活性，具體包括小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗、抗體生成細(xì)胞檢測，血清溶血素測定、小鼠碳廓清試驗以及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗。如果測試結(jié)果顯示在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性4個方面任2個方面結(jié)果陽性，就可以判定此益生菌菌株可以增強機體的免疫力[22]。

3.2 有助于調(diào)節(jié)腸道菌群

腸道是人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌組織，腸道菌群是在腸道內(nèi)生存的各種各樣的細(xì)菌群落，與腸道的健康息息相關(guān)。腸道菌群一般受飲食習(xí)慣、衛(wèi)生習(xí)慣和成長環(huán)境等多種因素影響，可將食物分解為短鏈脂肪酸、次級膽汁酸、氨基酸代謝物等[23]。這些代謝物可直接或間接影響宿主的生理和病理過程，對機體的健康有很大的影響。腸道微生物群紊亂會影響機體的平衡，干擾機體的新陳代謝，破壞腸道上皮細(xì)胞，引起炎癥，從而導(dǎo)致疾病[24]。普通人群可以通過補充益生菌來增加腸道有益菌的數(shù)量，來維持腸道菌群平衡、預(yù)防便秘、痢疾、抑制病原菌、抑制大腸桿菌產(chǎn)生的腸毒素、改善乳糖吸收、減輕乳糖不耐受、改善和保持腸道功能、參與新陳代謝、調(diào)整免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌等[25]。

益生菌對胃炎也有很好的療效。胃酸、胃脹、胃痛等疾病在我國已成為一種普遍疾病，統(tǒng)計顯示，超過90%的慢性胃病都是由幽門螺旋桿菌引起的，而益生菌如乳酸桿菌，對幽門螺旋桿菌有很好的抑制作用。

評價益生菌是否有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功能，需要通過動物試驗和人體試食試驗判斷，主要測試指標(biāo)如表1所示。

表1 動物試驗和人體試食試驗的主要測試指標(biāo)Tab.1 The main test indexes of animal tests and human feeding tests

在動物試驗中，與對照組相比，雙歧桿菌、乳桿菌（或其他益生菌）的數(shù)量明顯增加，腸球菌、腸桿菌數(shù)量無明顯變化，梭菌數(shù)量減少或無明顯變化，可以確定該益生菌菌株可以調(diào)節(jié)腸道菌群?；蛘唠p歧桿菌、乳桿菌（或其他益生菌）的數(shù)量明顯增加，梭菌數(shù)量減少或無明顯變化，腸球菌、腸桿菌數(shù)量明顯增加且增加的幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌（或其他益生菌）增加的幅度，可判定該受試菌株有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功能[26]。

在人體試食試驗中，與對照組相比，如果雙歧桿菌、乳桿菌（或其他益生菌）數(shù)量明顯增加，梭菌數(shù)量減少或無明顯變化，腸球菌、腸桿菌、擬桿菌數(shù)量無明顯變化，則可以確定該益生菌菌株能夠調(diào)節(jié)腸道菌群。或者雙歧桿菌、乳桿菌（或其他益生菌）數(shù)量明顯增加，梭菌數(shù)量減少或無明顯變化，腸球菌、腸桿菌、擬桿菌數(shù)量明顯增加，但增加的幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌（或其他益生菌）增加的幅度，可判定該受試菌株可以調(diào)節(jié)腸道菌群。

3.3 有助于潤腸通便

人體的排便功能受飲食、運動、飲水等因素的影響，科學(xué)研究表明，通過補充益生菌，可以促進(jìn)腸道的排便。為了評估益生菌對潤腸通便的作用，必須進(jìn)行動物試驗。研究人員需要對試驗動物的體質(zhì)量、排便時間、糞便質(zhì)量、糞便顆粒數(shù)、糞便性狀等進(jìn)行研究。在動物試驗之后，還要進(jìn)行人體試食試驗，并對受試人的癥狀體征、糞便特征、排便次數(shù)、排便情況等數(shù)據(jù)進(jìn)行研究。

在動物試驗中，糞便質(zhì)量、糞便顆粒數(shù)較對照組呈上升趨勢，小腸運動試驗及排便時間數(shù)據(jù)更佳，這說明該菌株對試驗動物的潤腸通便有著顯著的作用。在人體試食試驗中，受試者大便次數(shù)顯著增多，糞便的性質(zhì)及排便情況也有著顯著地改善，這可以判斷出該受試菌株對潤腸通便起到了改善作用[27]。

4 展望

眾所周知，益生菌是一種對人體有益的微生物。在國內(nèi)外的市場上，益生菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展呈現(xiàn)出非常好的趨勢，并且隨著我國經(jīng)濟的不斷發(fā)展、生活水平的顯著提高，消費者的保健意識也隨之提高，我國的益生菌保健產(chǎn)品將會成為21世紀(jì)一股新的潮流。然而對于益生菌的評估，各國的做法不盡相同，且沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。此外，對益生菌安全性、功效性的研究與科學(xué)評估是一個長期、嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)的過程，應(yīng)加強大眾的科普宣傳，科學(xué)地使用益生菌的相關(guān)產(chǎn)品。新開發(fā)的益生菌菌株在產(chǎn)業(yè)化前，必須對其安全性進(jìn)行全面有效的評估。隨著益生菌的安全性與功能性評估方法的不斷完善，其評估技術(shù)也將逐步規(guī)范化，最終為我國益生菌產(chǎn)業(yè)的健康有序發(fā)展作出積極的貢獻(xiàn)。