黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成分及體外抗氧化活性比較研究

吳紅偉，李東輝，宋沁潔，李國(guó)峰，李咸慰，楊新榮，李越峰, 3*

黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成分及體外抗氧化活性比較研究

吳紅偉1, 2，李東輝1, 2，宋沁潔1, 2，李國(guó)峰1, 2，李咸慰1, 2，楊新榮1, 2，李越峰1, 2, 3*

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000

采用HPLC、UV等方法測(cè)定并比較黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統(tǒng)飲片的指標(biāo)性成分及體外抗氧化活性，為不同加工方式的黃芪飲片質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。采用HPLC、UV等方法對(duì)黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統(tǒng)飲片的7種指標(biāo)性成分（黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、總黃酮、總多糖、水溶性浸出物）進(jìn)行含量測(cè)定，采用熵權(quán)法結(jié)合逼近理想解排序法（technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS）評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地加工方式對(duì)黃芪藥材質(zhì)量的影響，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統(tǒng)飲片進(jìn)行區(qū)分和比較，同時(shí)以DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基清除能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統(tǒng)飲片的體外抗氧化活性進(jìn)行比較。通過熵權(quán)綜合評(píng)分法比較2種不同加工方式對(duì)黃芪飲片質(zhì)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪趁鮮切制飲片綜合評(píng)分均高于黃芪傳統(tǒng)飲片；同時(shí)，黃芪趁鮮切制飲片組與黃芪傳統(tǒng)飲片組在體外抗氧化活性方面，DPPH自由基清除能力的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為5.560、8.168 mg/mL，羥基自由基清除能力的IC50分別為10.994、15.045 mg/mL，ABTS自由基清除能力的IC50分別為8.126、14.546 mg/mL，表明黃芪趁鮮切制飲片體外抗氧化活性強(qiáng)于黃芪傳統(tǒng)飲片。通過熵權(quán)TOPSIS綜合評(píng)分法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法及體外抗氧化活性對(duì)黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統(tǒng)飲片進(jìn)行分析，為不同加工方式的黃芪飲片質(zhì)量控制提供參考。

黃芪；產(chǎn)地加工；體外抗氧化；化學(xué)模式識(shí)別分析；質(zhì)量控制；黃芪甲苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；芒柄花苷；毛蕊異黃酮；總黃酮；總多糖；水溶性浸出物

黃芪為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge.的干燥根。具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力[2]、抗氧化[3]、利尿[4]、保護(hù)肝腎[5]及抗腫瘤[6]等藥理作用。中藥材產(chǎn)地加工是指將采收到的中藥材經(jīng)過初步加工和干燥處理等過程后形成商品藥材的過程，是影響中藥材品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)[7]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)地加工方式對(duì)黃芪品質(zhì)的形成具有重要影響[8-9]?，F(xiàn)代研究表明黃芪主要化學(xué)成分包括黃酮類、多糖類、皂苷類及氨基酸類[10]，而《中國(guó)藥典》2020年版以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷為含測(cè)指標(biāo)性成分對(duì)黃芪進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，對(duì)黃芪藥材及飲片質(zhì)量控制具有一定指導(dǎo)意義，但黃芪除含有以上化學(xué)成分外，還含有黃芪多糖、毛蕊異黃酮等成分，這些成分也為黃芪增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化作用的活性成分，在黃芪的質(zhì)量評(píng)價(jià)中不宜忽視。因此，本研究在《中國(guó)藥典》2020年版的基礎(chǔ)上將芒柄花苷、毛蕊異黃酮、總黃酮、總多糖、水溶性浸出物作為考察指標(biāo)，對(duì)黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片的化學(xué)成分進(jìn)行比較。同時(shí)，基于黃芪甲苷、黃芪多糖、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，故本研究對(duì)黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片的體外抗氧化活性加以比較，進(jìn)一步闡明黃芪趁鮮切制工藝的可行性，為黃芪產(chǎn)地加工工藝提供科學(xué)指導(dǎo)，為不同加工方法所得黃芪飲片質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型系列高效液相色譜儀、ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-S28s型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；HX502T型電子分析天平，慈溪市天東衡器廠；766-6型遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司；LFP-500A型粉碎機(jī)，上海菲力博實(shí)業(yè)公司；3SHB-3型循環(huán)水多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠；L2-5K型離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；UV-power型紫外分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；A1111型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SW22型恒溫水浴振蕩器，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試藥

3批黃芪藥材采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的新鮮根，將黃芪藥材按不同產(chǎn)地加工方式處理，干燥、粉碎后過4號(hào)篩，置于干燥器中，備用。

對(duì)照品黃芪甲苷（批號(hào)PS010428，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)PS000687，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、芒柄花苷（批號(hào)PS000674，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、毛蕊異黃酮（批號(hào)PS010251，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、-葡萄糖（批號(hào)PS020418，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）均購(gòu)自成都普思生物科技有限公司；甲醇（批號(hào)20200302）、甲酸（批號(hào)20171201）；正丁醇（批號(hào)20190801）、氨水（批號(hào)20200706）均購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（批號(hào)S21J11M116469）、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（批號(hào)A02GS143434）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；FeSO4，批號(hào)20191101，購(gòu)自煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；水楊酸，批號(hào)20210212，購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；過硫酸鉀，批號(hào)20201120，購(gòu)自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；水為娃哈哈純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同加工處理方式制備黃芪飲片

2.1.1 黃芪趁鮮切制飲片的制備 黃芪趁鮮切制飲片工藝制備方法采用課題組前期優(yōu)選出來的工藝進(jìn)行制備[8]。將剛采挖的黃芪藥材除去雜質(zhì)及非藥用部位，晾曬至含水量為50%，進(jìn)行發(fā)汗和揉搓處理，發(fā)汗時(shí)長(zhǎng)3 d（普通發(fā)汗法），揉搓次數(shù)2次，每次時(shí)長(zhǎng)5 min，2項(xiàng)操作交替進(jìn)行，清洗、切制，將切制所得飲片置于遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱中，飲片鋪設(shè)厚度約為1.0～1.5 cm，51 ℃條件下干燥，最終得到黃芪趁鮮切制飲片。

2.1.2 黃芪傳統(tǒng)飲片的制備 將黃芪藥材晾曬至一定程度（含水量約為40%），揉搓2次（每次揉搓完成后晾曬1 d），洗去表面雜質(zhì)，切制、曬干，得到黃芪傳統(tǒng)飲片。

2.2 黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片外觀性狀的比較

中藥飲片外觀性狀在一定程度上能反映其內(nèi)在質(zhì)量，本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統(tǒng)飲片性狀均符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，呈類圓形或橢圓形的厚片（2～4 mm），外表皮黃白色至淡棕褐色，可見縱皺紋或縱溝。切面皮部黃白色，木部淡黃色，有放射狀紋理及裂隙，但黃芪趁鮮切制飲片較黃芪傳統(tǒng)飲片外表皮及切面顏色均加深，其原因可能與黃芪趁鮮切制飲片發(fā)汗過程有密切關(guān)系。

2.3 HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（ELSD）法測(cè)定黃芪甲苷含量

2.3.1 色譜條件 色譜柱為HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（40∶60）為流動(dòng)相，等度洗脫；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；蒸發(fā)光檢測(cè)器：漂移管溫40 ℃，載氣體積流量1.5 mL/min。黃芪甲苷對(duì)照品及黃芪樣品的HPLC圖見圖1。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照品 (A) 和黃芪樣品 (B) 的HPLC- ELSD圖

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品25.00 mg于10 mL量瓶中，加甲醇超聲使其完全溶解，制成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取各樣品粉末約4 g，精密稱定，加甲醇40 mL，回流提取1 h，抽濾，重復(fù)以上操作2次，合并濾液，減壓濃縮后加10 mL水溶解，加40 mL水飽和的正丁醇萃取，重復(fù)操作2次，合并萃取液并加入40 mL氨試液萃取，重復(fù)操作2次；將萃取液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，減壓濃縮，加甲醇定容至5 mL量瓶中，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9 mL至2 mL量瓶中并用色譜甲醇定容至刻度。每個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定峰面積，對(duì)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液和峰面積求自然對(duì)數(shù)，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（），峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性方程為＝1.680 7＋2.166 1，2＝0.999 5，表明黃芪甲苷在3.771～11.313 μg線性關(guān)系良好。

2.3.5 方法學(xué)考察 按照《中國(guó)藥典》2020年版[1]方法對(duì)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度、加樣回收率進(jìn)行考察，其RSD值均分別為1.77%、1.35%、1.68%、1.17%，平均加樣回收率為97.00%。

2.3.6 樣品含量測(cè)定 精密稱取各黃芪樣品粉末（過4號(hào)篩）4 g，分別按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷含量。

2.4 HPLC-二極管陣列檢測(cè)器（DAD）法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷含量

2.4.1 色譜條件 色譜柱為HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；流動(dòng)相為乙 腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～20 min，20%～40%乙腈；20～30 min，40%乙腈?；旌蠈?duì)照品及黃芪樣品HPLC圖見圖2。

圖2 混合對(duì)照品 (A) 和黃芪樣品(B) 的HPLC-DAD圖

2.4.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品10.11 mg、毛蕊異黃酮對(duì)照品4.98 mg、芒柄花苷對(duì)照品3.30 mg分別定容至10 、5 、10 mL量瓶中并用色譜甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為1.011、0.996、0.330 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別吸取上述對(duì)照品溶液0.08、0.07、0.15 mL至10 mL量瓶中并用色譜甲醇定容至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取黃芪樣品粉末約2 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇40 mL，加熱回流1 h，抽濾，濾渣加40 mL甲醇回流提取1 h，合并2次所得濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮并用色譜甲醇定容至5 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.4.4 線性關(guān)系考察 分別取“2.4.2”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液，體積為0.05、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液于2 mL量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度；體積為0.03、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL的毛蕊異黃酮對(duì)照品溶液于2 mL量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度；體積為0.1、0.3、0.7、0.9、1.3、1.7 mL的芒柄花苷對(duì)照品溶液于2 mL量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度。按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣量5 μL。以峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷＝19 079－26.369，2＝0.999 7，線性范圍25.28～303.30 μg/mL；毛蕊異黃酮＝26 723－38.364，2＝0.999 7，線性范圍14.94～149.40 μg/mL；芒柄花苷＝14 485－12.39，2＝0.999 8，線性范圍16.50～280.50 μg/mL；結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷在相應(yīng)質(zhì)量濃度間線性關(guān)系良好。

2.4.5 方法學(xué)考察 按照《中國(guó)藥典》2020年版[1]方法對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方法學(xué)考察，得到毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷穩(wěn)定性的RSD在0.97%～1.13%，重復(fù)性的RSD在1.15%～2.38%，精密度的RSD在0.97%～2.16%。平均加樣回收率分別為98.00%、97.00%、97.00%，RSD分別為0.79%、1.89%、1.15%。

2.4.6 樣品含量測(cè)定 精密稱取各黃芪樣品粉末（過4號(hào)篩）2 g，分別按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷含量。

2.5 總多糖含量測(cè)定[11]

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取-葡萄糖對(duì)照品0.042 g，加純水定容至100 mL，搖勻，制得含-葡萄糖0.42 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別取3、4、5、6、7、8 mL上述對(duì)照品溶液定容至50 mL，得到不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，待測(cè)。

2.5.2 供試品溶液的制備 取各樣品粉末約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100 mL回流提取1 h，離心，取沉淀重復(fù)上述操作1次，合并上清液，濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取5 mL，加乙醇26 mL，渦旋使混勻，離心，取沉淀加水溶解并置于250 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，待測(cè)。

2.5.3 顯色及測(cè)定 取不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液及供試品溶液各2 mL置于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，充分混勻，再加入5 mL濃硫酸，混勻，于40 ℃水浴鍋加熱15 min后取出，冷卻，采用紫外分光光度計(jì)于490 nm測(cè)定吸光度（）值。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下不同濃度的對(duì)照品溶液各2 mL置于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，充分混勻，再加入5 mL濃硫酸，混勻，于40 ℃水浴鍋加熱15 min后取出，水浴冷卻，采用紫外分光光度計(jì)于490 nm測(cè)定值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝0.014 8－0.045 9，2＝0.999 5，結(jié)果表明，在25.2～67.2 μg/mL內(nèi)，葡萄糖對(duì)照品的檢測(cè)質(zhì)量濃度與值呈良好的線性關(guān)系。

2.5.5 方法學(xué)考察 按照《中國(guó)藥典》2020年版[1]方法對(duì)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度、加樣回收率進(jìn)行考察，RSD分別為2.93%、2.63%、0.94%、1.60%，平均加樣回收率為95.90%。

2.5.6 樣品含量測(cè)定 精密稱取各黃芪樣品粉末（過4號(hào)篩）2 g，分別按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.5.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定值并計(jì)算總多糖含量。

2.6 總黃酮含量測(cè)定

2.6.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷2.50 mg，加70%乙醇定容至100 mL量瓶中，制成含0.025 mg/mL毛蕊異黃酮葡糖糖苷的對(duì)照品溶液；分別吸取上述對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 mL至10 mL量瓶中并定容至刻度，采用紫外分光光度計(jì)于260 nm下測(cè)定值。

2.6.2 供試品溶液的制備 取黃芪粉末約0.3 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，稱定總質(zhì)量后超聲提?。?00 W、50 Hz）30 min，稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，抽濾，取續(xù)濾液2 mL定容至10 mL量瓶中，于260 nm下測(cè)定值。

2.6.3 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.6.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，采用紫外分光光度計(jì)于260 nm測(cè)定值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），繪制毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝0.051 3＋0.031 3，2＝0.999 8，結(jié)果表明，在2.5～15.0 μg/mL葡萄糖對(duì)照品的檢測(cè)質(zhì)量濃度與值呈良好的線性關(guān)系。

2.6.4 方法學(xué)考察 按照《中國(guó)藥典》2020年版[1]方法對(duì)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度、加樣回收率進(jìn)行考察，RSD分別為2.84%、0.95%、0.12%、0.73%，平均加樣回收率為98.10%。

2.6.5 樣品含量測(cè)定 精密稱取各黃芪樣品粉末（過4號(hào)篩）2 g，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定值并計(jì)算總黃酮含量。

2.7 浸出物含量測(cè)定

依據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版第四部水溶性浸出物測(cè)定法（通則2201）項(xiàng)下冷浸法測(cè)定。

2.8 綜合評(píng)分計(jì)算[12-13]

熵權(quán)法是一種根據(jù)多項(xiàng)指標(biāo)所提供的信息來確定各指標(biāo)權(quán)重的客觀賦權(quán)法。信息熵作為體系混亂程度的度量，指標(biāo)熵值越小，則它所蘊(yùn)涵的信息量越大，在綜合評(píng)價(jià)中所起作用也越大，其權(quán)重也應(yīng)越高，具體計(jì)算方法如下。

①利用公式（1）進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理。

X′＝(X－min)/(max－min) （1）

為第個(gè)指標(biāo)下第組的含量，max為每個(gè)指標(biāo)下測(cè)得的含量最大值，min為每個(gè)指標(biāo)下測(cè)得的含量最小值

②采用公式（2）、（3）定義信息熵（E）。

P為第個(gè)指標(biāo)下第組的概率，且0≤P≤1；E為各指標(biāo)的信息熵，當(dāng)P＝0時(shí)，lnP無意義，故當(dāng)P＝0時(shí)，將lnP修正為0

③利用公式（4）計(jì)算指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)（w）。

w為熵權(quán)系數(shù)，且0≤w≤1

課題組在前期預(yù)試驗(yàn)中[8-9]，應(yīng)用熵權(quán)法計(jì)算得到黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2）、芒柄花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3）、毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4）、總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5）、總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（6）、水溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（7）的w分別為0.157、0.138、0.234、0.117、0.163、0.121、0.069，則綜合評(píng)分（）＝1×0.157＋2×0.138＋3×0.234＋4×0.117＋5×0.163＋6×0.121＋7×0.069。

2.9 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片的比較

將“1.2”項(xiàng)下的3批黃芪藥材采用傳統(tǒng)加工工藝和趁鮮切制加工工藝進(jìn)行產(chǎn)地加工，得到傳統(tǒng)組1～3（T1～T3）和趁鮮切制1～3（Q1～Q3）共6組黃芪飲片，分別按照“2.3”～“2.7”項(xiàng)方法測(cè)定6組黃芪飲片中各指標(biāo)成分含量并計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1～7），按照“2.8”項(xiàng)方法計(jì)算不同試驗(yàn)組別中各指標(biāo)成分的綜合評(píng)分（），結(jié)果見表1。

為進(jìn)一步比較黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片間的差異，尋找不同加工方式對(duì)黃芪化學(xué)成分的影響，本研究采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，以7個(gè)指標(biāo)性成分的含量為變量，對(duì)黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片進(jìn)行分析。

表1 黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片指標(biāo)性成分的綜合評(píng)分比較

2.9.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） 采用SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)3批黃芪趁鮮切制飲片Q1～Q3與3批傳統(tǒng)飲片T1～T3進(jìn)行PCA，得分矩陣圖見圖3，模型參數(shù)2值及預(yù)測(cè)能力參數(shù)2值分別為0.704、0.731。結(jié)果顯示6批黃芪樣品可被分為2組，其中黃芪趁鮮切制飲片（Q1～Q3）為1組，黃芪傳統(tǒng)飲片（T1～T3）為1組，結(jié)果表明黃芪趁鮮切制飲片加工工藝與黃芪傳統(tǒng)加工工藝具有一定差異。

2.9.2 偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA） 為了進(jìn)一步區(qū)分不同加工方式對(duì)黃芪飲片及尋找差異成分，在經(jīng)過PCA基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步采用PLS-DA對(duì)黃芪趁鮮切制飲片Q1～Q3與傳統(tǒng)飲片T1～T3進(jìn)行分析。以7個(gè)指標(biāo)性成分的含量作為輸入變量得到相應(yīng)模型，結(jié)果見圖4、5。建立的PLS-DA模型中，累積解釋能力參數(shù)2和2分別為0.817和0.984，預(yù)測(cè)能力參數(shù)2為0.956，2和2均大于0.5，表明所建模型具有一定的穩(wěn)定性及可靠性，可用于評(píng)價(jià)和區(qū)分不同加工方式所得黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片。同時(shí)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLS-DA得分圖與PCA結(jié)果相似，不同加工方式所得黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片被很好地分為2類。

圖3 黃芪不同加工方式飲片PCA圖

圖4 黃芪不同加工方式飲片PLS-DA圖

圖5 黃芪不同加工方式飲片PLS-DAVIP值

根據(jù)模型中變量權(quán)重要性排序（VIP）預(yù)測(cè)值來篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異成分，在95%的置信區(qū)間，選出VIP＞1.0的變量作為差異化合物，芒柄花苷、總多糖、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的VIP值分別為1.168、1.162、1.158、1.072，因此確定芒柄花苷、總多糖、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷為不同加工方式所得黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片的差異性化合物，可以作為區(qū)分和評(píng)價(jià)黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片的指標(biāo)性成分。

2.10 黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片體外抗氧化活性比較

2.10.1 溶液的制備 精密稱定黃芪傳統(tǒng)飲片組T1、趁鮮切制飲片組Q1樣品粉末1 g，置于圓底燒瓶中，加水100 mL，提取1 h，重復(fù)上述操作1次，合并上清液，濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為100 mg/mL的母液，4 ℃保存。

使用維生素C（VC）作為陽性對(duì)照組，其系列質(zhì)量濃度分別為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、30.000、40.000、50.000 mg/mL。

2.10.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)植物中化合物的自由基清除力[14]。本實(shí)驗(yàn)參考薛志遠(yuǎn)[3]研究方法并在其基礎(chǔ)上稍作修改。精密稱取20 mg DPPH，加甲醇使其溶解并定容至250 mL量瓶中，使其成為0.2 mmol/L反應(yīng)溶液，避光，4 ℃保存，備用。將“2.10.1”項(xiàng)下取提前配制好的母液加水稀釋成相當(dāng)于原生藥材的系列質(zhì)量濃度溶液（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、30.000、40.000、50.000 mg/mL），將不同質(zhì)量濃度的藥材溶液及DPPH反應(yīng)溶液各取2 mL并加入同一試管中混勻，于避光處反應(yīng)30 min，測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)的值，記錄為A，測(cè)定0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL與2 mL甲醇試劑混合后的值，記為c；2 mL提取物與2 mL甲醇溶液混合后的值，記為A；重復(fù)3次[15]。

DPPH自由基清除率＝1－(A－A)/c

如圖6所示，黃芪原生藥材質(zhì)量濃度為0.625 mg/mL時(shí)，黃芪趁鮮切制組與傳統(tǒng)組對(duì)DPPH自由基的清除能力較低，而隨著黃芪原生藥材質(zhì)量濃度的不斷升高，其提取物對(duì)DPPH自由基的清除率具有劑量依賴性，當(dāng)黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統(tǒng)組原生藥材質(zhì)量濃度從0.625 mg/mL上升到10.000 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除能力分別迅速上升到77.18%和70.25%。此后，隨著黃芪原生藥材質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率增加緩慢，黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統(tǒng)組別的IC50分別為5.560、8.168 mg/mL，表明黃芪趁鮮切制組較黃芪傳統(tǒng)組DPPH自由基清除力強(qiáng)。而陽性對(duì)照組質(zhì)量濃度為0.625 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率已經(jīng)達(dá)到93.81%。此后，隨著質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率無明顯變化。

圖6 黃芪總提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.10.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定 羥基自由基對(duì)生物體有較強(qiáng)的毒性，也常用于評(píng)價(jià)植物提取物體外抗氧化活性研究[16]，羥基自由基所致?lián)p害引起廣泛關(guān)注[17]。本實(shí)驗(yàn)參考Chen等[18]的研究方法并稍作修改。羥基自由基反應(yīng)液：1 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）＋2 mL水楊酸-無水乙醇溶液（9 mmol/L）。將“2.10.1”項(xiàng)下提前配置的母液加水稀釋成相當(dāng)于原生藥材的系列質(zhì)量濃度溶液（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、30.000、40.000、50.000 mg/mL），取不同質(zhì)量濃度的藥材溶液2 mL、9 mmol/L H2O2反應(yīng)液1 mL及羥基自由基3 mL加入同一試管中混合均勻后37 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)其在510 nm波長(zhǎng)的值，記錄為A；測(cè)羥基自由基3 mL、9 mmol/L H2O2反應(yīng)液1 mL及2 mL雙蒸餾水混合后的值，記為c；2 mL提取液、羥基自由基3 mL及雙蒸餾水1 mL混合后的值，記為A；重復(fù)3次。

羥自由基清除率＝1－(A－A)/A

如圖7所示，當(dāng)黃芪原生藥材質(zhì)量濃度為0.625～5.000 mg/mL，黃芪趁鮮切制組與傳統(tǒng)組對(duì)羥基自由基的清除能力較低，而隨著黃芪原生藥材質(zhì)量濃度的逐漸增加，其提取物對(duì)羥基自由基的清除率也隨之增加，并呈上升趨勢(shì)，當(dāng)黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統(tǒng)組原生藥材質(zhì)量濃度上升到10.000 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除能力迅速上升到46.242%和40.494%。此后，隨著黃芪原生藥材質(zhì)量濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除率增加緩慢，黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統(tǒng)組的IC50分別為10.994、15.045 mg/mL，表明黃芪趁鮮切制組較黃芪傳統(tǒng)組羥基自由基清除力強(qiáng)。而陽性對(duì)照組質(zhì)量濃度從0.625 mg/mL開始，對(duì)羥基自由基的清除率迅速升高，當(dāng)其質(zhì)量濃度為10.000 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到97.244%。此后，隨著質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)羥基自由基的清除率無明顯變化，其IC50＝3.572 mg/mL。

2.10.4 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 Miller等[19]于1993年首次介紹了通過清除ABTS來評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力的方法，根據(jù)待測(cè)物對(duì)ABTS自由基的清除能力，采用傳統(tǒng)分光光度法進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而對(duì)其抗氧化活性大小進(jìn)行評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)參考Souza等[20]的方法并稍作修改。將5 mL質(zhì)量濃度為2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液與7 mmol/L ABTS溶液充分混勻，在4 ℃、避光條件下靜置12～16 h，3～4 d內(nèi)使用，使用前取1 mL混合液，加入超純水稀釋，使得溶液在734 nm下值為0.7±0.2。將“2.10.1”項(xiàng)下母液加水稀釋成相當(dāng)于原生藥材的系列質(zhì)量濃度溶液（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、30.000、40.000、50.000 mg/mL），取不同質(zhì)量濃度的藥材溶液0.1 mL，加入3.9 mL ABTS反應(yīng)液，搖勻，室溫下避光反應(yīng)7 min，在734 nm處測(cè)定值，記為1；以3.9 mL水代替3.9 mL ABTS反應(yīng)液測(cè)定值，記作2；空白對(duì)照中的樣品溶液用水代替，記為0；VC作陽性對(duì)照[21]。

圖7 黃芪總提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

ABTS自由基清除率＝1－(1－2)/0

如圖8所示，黃芪原生藥材質(zhì)量濃度為0.625 mg/mL時(shí)，黃芪趁鮮切制組與傳統(tǒng)組對(duì)ABTS自由基的清除能力較低。隨著黃芪原生藥材質(zhì)量濃度的不斷升高，其提取物對(duì)ABTS自由基的清除率具有劑量依賴性，黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統(tǒng)組原生藥材質(zhì)量濃度在0.625～20.000 mg/mL，對(duì)ABTS自由基的清除能力上升較快，當(dāng)黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統(tǒng)組原生藥材質(zhì)量濃度大于20.000 mg/mL后，分別迅速上升到77.18%和70.25%。此后，隨著黃芪原生藥材質(zhì)量濃度的增加，對(duì)ABTS自由基的清除率增加緩慢；黃芪趁鮮切制組與黃芪傳統(tǒng)組別的IC50分別為8.126、14.546 mg/mL，表明黃芪趁鮮切制組較黃芪傳統(tǒng)組ABTS自由基的清除力強(qiáng)。而陽性對(duì)照組質(zhì)量濃度為0.065 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除率已經(jīng)達(dá)到95.188%。此后隨著質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)ABTS自由基的清除率無明顯變化。

圖8 黃芪總提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力

3 討論

黃芪藥材產(chǎn)地加工在其品質(zhì)形成過程中發(fā)揮重要作用，本研究以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、總黃酮、總多糖、水溶性浸出物為指標(biāo)，通過熵權(quán)綜合評(píng)分法比較2種不同加工方式對(duì)黃芪飲片質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)黃芪趁鮮切制飲片及傳統(tǒng)飲片在化學(xué)成分上具有一定差異，整體表現(xiàn)為黃芪趁鮮切制飲片質(zhì)量?jī)?yōu)于傳統(tǒng)飲片。但在黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片的化學(xué)成分比較結(jié)果中，黃芪趁鮮切制組與傳統(tǒng)組組內(nèi)同一指標(biāo)出現(xiàn)較大差異，其主要原因在于不同產(chǎn)地黃芪藥材質(zhì)量具有一定差異；此外，由于本研究?jī)H在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，切制過程手工完成，切片厚度也可能是組內(nèi)同一指標(biāo)出現(xiàn)較大差異的另一重要原因。同時(shí)，本研究為了更好地辨識(shí)不同加工方式對(duì)黃芪飲片質(zhì)量的影響，采用PCA和PLS-DA，將黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片分為2類，篩選出了4個(gè)差異化合物，分別是芒柄花苷、總多糖、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷，可作為區(qū)分和鑒別不同加工方式的黃芪飲片質(zhì)量的控制指標(biāo)。同時(shí)，黃芪趁鮮切制飲片與黃芪傳統(tǒng)飲片體外抗氧化結(jié)果表明：DPPH自由基清除能力的IC50分別為5.560、8.168 mg/mL；羥基自由基清除能力的IC50分別為10.994、15.045 mg/mL；ABTS自由基清除能力的IC50分別為8.126、14.546 mg/mL。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，黃芪趁鮮切制工藝能在一定程度上避免其化學(xué)成分的損失，保證黃芪飲片質(zhì)量。

此外，本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪趁鮮切制工藝與傳統(tǒng)工藝加工所得飲片質(zhì)量存在差異，并優(yōu)選出最佳加工工藝參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，本研究從化學(xué)成分和體外抗氧化活性角度對(duì)2種不同加工方法所得飲片質(zhì)量比較，結(jié)果表明黃芪趁鮮切制飲片綜合質(zhì)量?jī)?yōu)于黃芪傳統(tǒng)飲片。因此，黃芪趁鮮切制飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在黃芪傳統(tǒng)飲片的基礎(chǔ)上加以完善，為推廣黃芪趁鮮切制飲片加工工藝及其質(zhì)量控制提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative study on chemical composition andanti-oxidant activity offresh-cut pieces and traditional pieces

WU Hong-wei1, 2, LI Dong-hui1, 2, SONG Qin-jie1, 2, LI Guo-feng1, 2, LI Xian-wei1, 2, YANG Xin-rong1, 2, LI Yue-feng1, 2, 3

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Key Laboratory of Standard and Quality of Chinese Medicine Research of Gansu, Lanzhou 730000, China 3. Gansu Engineering Research Center for Chinese Medicine Pharmaceutical Technology, Lanzhou 730000, China

HPLC, UV and other methods were used to determine and compare the index components andantioxidant activities of fresh-cut pieces and traditional pieces of Huangqi (), providing scientific basis for quality control ofpieces with different processing methods.HPLC, UV and other methods were used to determine the contents of 7 index components (astragaloside IV, calycosin-7-glucoside, ononin, calycosin, total flavonoids, total polysaccharides, water-soluble extract) in fresh-cut and traditional pieces of. The effect of different processing methods on the quality ofwas evaluated by the entropy weight method combined with technique for order preference by similarity to an ideal solution (TOPSIS). In addition, chemometric methods such as principal component analysis (PCA) and partial least squares- discriminant analysis (PLS-DA) were used to differentiate and compare the fresh-cut pieces ofwith the traditional pieces of. At the same time, DPPH free radical, hydroxyl free radical and ABTS radical scavenging ability were used as evaluation indexes to compare theantioxidant activity of fresh-cut pieces ofand traditional pieces of.The entropy weight comprehensive score method was used to compare the effects of two different processing methods on the quality ofdecoction pieces. The results showed that the comprehensive score of fresh-cutdecoction pieces was higher than that of traditionaldecoction pieces.antioxidant activities ofin the fresh-cut group and the traditional group were 5.560, 8.168 mg/mL for IC50of DPPH radical scavenging capacity, the IC50of hydroxyl radical scavenging capacity was 10.994, 15.045 mg/mL, and the IC50of ABTS radical scavenging capacity was 8.126, 14.546 mg/mL, respectively. The above results showed that theantioxidant activity of fresh-cut pieces ofwas stronger than that of traditional slices of.In this study, the entropy weight TOPSIS comprehensive scoring method combined with chemometrics analysis method andantioxidant activity were used to analyze the fresh-cut slices and traditional slices of, so as to provide reference for the quality control ofslices with different processing methods.

; producing area processing;antioxidant; chemical pattern recognition analysis; quality control;astragaloside IV; calycosin-7-glucoside; ononin; calycosin; total flavonoids; total polysaccharides; water-soluble extract

R283.6

A

0253 - 2670(2022)22 - 7039 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.007

2022-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81960713）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82160750）；基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項(xiàng)目（21JR7RA569）；甘肅省教育廳產(chǎn)業(yè)支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2021CYZC-21）；甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心開放課題（ZYGY202003）；國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2020GSMPA-KL15）；甘肅省高等學(xué)校產(chǎn)業(yè)支撐計(jì)劃項(xiàng)目——四種道地隴藥綠色規(guī)范化產(chǎn)業(yè)發(fā)展示范推廣（2020C-09）；民生科技專項(xiàng)（科技特派員專題）——中藥材引種馴化與道地藥材產(chǎn)業(yè)化扶貧示范推廣（20CX9 NA070）；甘肅省科學(xué)技術(shù)廳——科技計(jì)劃（創(chuàng)新基地與人才計(jì)劃）雙一流科研重點(diǎn)項(xiàng)目（GSSYLXM-05）；甘肅省中藥炮制技術(shù)傳承基地項(xiàng)目

吳紅偉，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幖皬?fù)方加工炮制機(jī)制及活性成分研究。Tel: 13519317036 E-mail: 2419161734@qq.com

李越峰，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幖皬?fù)方加工炮制機(jī)制及活性成分研究。E-mail: lyfyxk@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]