Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化巖黃連堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處方工藝及體外藥效評(píng)價(jià)

蘇曉丹，麥琬婷，鐘華帥，曾勇珠，陸建媚，覃裕翠，黃秋潔，葉 勇, 3*

·藥劑與工藝·

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化巖黃連堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處方工藝及體外藥效評(píng)價(jià)

蘇曉丹1，麥琬婷1，鐘華帥1，曾勇珠1，陸建媚1，覃裕翠1，黃秋潔2*，葉 勇1, 3*

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001 3. 廣西生物活性分子研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化巖黃連堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（dehydrocavidine nanostructured lipid carriers，DC-NLCs）處方，并進(jìn)行體外藥效研究。采用溶劑蒸發(fā)法制備DC-NLCs。以包封率、載藥量和ζ電位為考察指標(biāo)，采用單因素考察和Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化DC-NLCs的處方。對(duì)DC-NLCs進(jìn)行表征，并考察體外藥效作用。最佳處方為投藥量為10.0 mg、固-液脂質(zhì)比為1∶8、卵磷脂用量為85.0 mg、表面活性劑為1%聚山梨酯-80。DC-NLCs測(cè)得包封率為（85.29±0.01）%，載藥量為（6.27±0.00）%，ζ電位為（?17.90±1.09）mV、粒徑為（188.50±11.77）nm，體外釋藥具有明顯的緩釋特征。體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，DC-NLCs體外抑制肝纖維化的效果顯著。Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法所建立的模型能較好地用于DC-NLCs處方優(yōu)化，準(zhǔn)確度高，預(yù)測(cè)效果較好，且優(yōu)化制備的DC-NLCs具有顯著的抑制肝纖維化作用。

巖黃連堿；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體；Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；緩釋；MTT法；藥效評(píng)價(jià)；溶劑蒸發(fā)法；肝纖維化

巖黃連又名石生黃堇、巖胡、土黃連，為罌粟科紫堇屬多年生草本植物巖黃連Bunting的全草[1]，主要分布于廣西、貴州、云南等我國(guó)西南部地區(qū)。巖黃連作為廣西壯族傳統(tǒng)特色護(hù)肝藥物，常用于瘡疔腫毒、肝炎、肝硬化、肝癌[2-3]等疾病治療。

巖黃連堿是從巖黃連[4]中提取分離出來的1種季銨類生物堿。研究表明，巖黃連堿具有促進(jìn)膠原溶解[5]、調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)基因[5]、減少氧化應(yīng)激[6]、減少肝臟丙二醛的形成[7]、提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性[5]等藥理作用。目前以巖黃連堿作為主要質(zhì)量控制指標(biāo)的制劑有巖黃連注射液、巖黃連片劑[8]、巖黃連直腸栓[9]、巖黃連總堿膠囊[10]等，用于肝炎、肝硬化、肝癌等疾病的治療。然而，由于巖黃連堿存在溶解度差[11]、體外抗氧化活性能力低[12]藥物遞送率低等缺點(diǎn)，從而限制了其相關(guān)制劑的研發(fā)及臨床應(yīng)用。因此，通過現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)改善巖黃連堿溶解度及體外活性問題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLCs）是新一代脂質(zhì)納米粒，也稱納米脂質(zhì)載體[13]。NLCs存在液態(tài)油或混合基質(zhì)打亂了固體脂質(zhì)規(guī)整的晶型結(jié)構(gòu)，以結(jié)晶缺陷型、無定形、液脂/固脂/水3者復(fù)合態(tài)等結(jié)構(gòu)存在，可裝載更多藥物分子，提高包封率和載藥量[14]，且具有改善藥物溶解度和緩控釋作用[15]，能有效提高難溶性藥物在體內(nèi)病灶的靶向性、吸收程度并延長(zhǎng)藥效作用時(shí)間[16]。

基于此本研究利用單因素考察結(jié)合Box- Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法[17-18]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以包封率、載藥量、ζ電位為考察指標(biāo)，選擇巖黃連堿用量、固態(tài)與液態(tài)（固-液）脂質(zhì)比、卵磷脂用量為主要影響因素，優(yōu)化巖黃連堿-NLCs（dehydrocavidine- NLCs，DC-NLCs）的處方，并進(jìn)行質(zhì)量表征與體外藥效評(píng)價(jià)，以期為巖黃連堿新制劑的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和有價(jià)值的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀器，二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；XS205DU型分析天平，梅特勒-托利多集團(tuán)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆明市超聲儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；Nano-ZS90型粒度分析儀，英國(guó)馬爾文公司；TG16-MS型高速離心機(jī)，賽默飛世爾有限公司；THZ-92C型臺(tái)式恒溫振蕩器，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；H-7650型透射電子顯微鏡（TEM），日本Htachi公司；Smart Lab-9kW型轉(zhuǎn)靶X-射線粉末衍射儀（XRD），瑞士梅特勒托利多公司；Nicolet IS20型傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀，賽默飛世爾科技公司；超濾離心管，截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000，美國(guó)Millipore公司；Aynergy H1型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 試藥

巖黃連堿原料藥，批號(hào)RP20201009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，購(gòu)自成都麥德生科技有限公司；巖黃連堿對(duì)照品，批號(hào)111667-200401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；單硬脂酸甘油酯，批號(hào)L28N10S104297，購(gòu)自源葉生物科技有限公司；油酸，批號(hào)k1929018，購(gòu)自阿拉丁醫(yī)藥科技有限公司；聚山梨酯-80，批號(hào)70090050，購(gòu)自Biosharp藥用輔料有限公司；磷酸，批號(hào)20201001，購(gòu)自重慶川東華東有限公司；三乙胺，批號(hào)20210217，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯HS，批號(hào)73059868E0，購(gòu)自德國(guó)巴斯夫化工有限公司；PBS緩沖液（批號(hào)20211210）、5-甲巰基-1-四氮唑（批號(hào)917Q054）、胰酶（批號(hào)20220221），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，批號(hào)WH0022X191，購(gòu)自普諾賽生命科技有限公司；泊洛沙姆，批號(hào)GNC33221B，德國(guó)BASF有限公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），批號(hào)?P01137?，派普泰克技術(shù)有限公司；LX-2細(xì)胞，廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院林興課題組贈(zèng)送。

2 方法與結(jié)果

2.1 DC-NLCs的制備工藝

稱取處方量的巖黃連堿原料藥、單硬脂酸甘油酯、油酸和卵磷脂置于燒杯中，加入無水乙醇4 mL，水浴加熱溶解得到澄清透明的有機(jī)相。將有機(jī)相緩慢滴入于70 ℃水浴的1%聚山梨酯-80中，以轉(zhuǎn)速為850 r/min磁力攪拌50 min后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，得DC-NLCs混懸液。

空白NLCs制備方法同DC-NLCs一致，但不加入巖黃連堿原料藥。

2.2 HPLC法測(cè)定巖黃連堿含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱為6L Sciences ODS2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸三乙胺水溶液（30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)為346 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃。進(jìn)樣后，巖黃連堿出峰位置在6.8 min左右（圖1），專屬性較高，理論塔板數(shù)以巖黃連堿計(jì)不低于12 000。

圖1 巖黃連堿對(duì)照品(A)和DC-NLCs (B)

2.2.2 線性關(guān)系考察 稱取巖黃連堿對(duì)照品2.5 mg至5 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度得500 μg/mL的巖黃連堿為母液。用巖黃連堿母液配制1、2、5、10、50、100、500 μg/mL系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析。以巖黃連堿的峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝37.816＋31.496，＝0.999 8，可見，巖黃連堿在1～500 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品溶液制備 取DC-NLCs混懸液100 μL至5 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度后超聲（功率600 W）15 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得DC-NLCs供試品溶液。

2.2.4 精密度考察 取低、中、高質(zhì)量濃度（50、200、350 μg/mL）巖黃連堿溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄巖黃連堿色譜峰的峰面積，計(jì)算得巖黃連堿峰面積的RSD分別為0.22%、0.41%、0.09%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性考察 取DC-NLCs供試品溶液，分別于制備后0、4、8、16、24 h進(jìn)樣，記錄巖黃連堿色譜峰的峰面積，計(jì)算得巖黃連堿峰面積RSD為1.23%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性考察 取DC-NLCs混懸液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，制備6份DC-NLCs供試品溶液，進(jìn)樣，記錄巖黃連堿色譜峰的峰面積，計(jì)算得巖黃連堿質(zhì)量濃度的RSD為1.15%，表明重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率考察 取DC-NLCs混懸液100 μL至10 mL量瓶中，分別加入500 μL巖黃連堿低、中、高質(zhì)量濃度3組，每組3份。甲醇定容至刻度線后，取400 μL至超濾管中，以10 000 r/min離心（離心半徑7.5 cm）30 min。取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得巖黃連堿的平均加樣回收率為105.18%，RSD分別為1.33%，表明該方法加樣回收率較高。

2.3 包封率、載藥量、粒徑及ζ電位的測(cè)定

取DC-NLCs混懸液100 μL至5 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度后超聲15 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣測(cè)定巖黃連堿總量（2）。另取DC-NLCs混懸液400 μL至超濾管中（截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000），10 000 r/min離心（離心半徑7.5 cm）30 min，取續(xù)濾液于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度線，進(jìn)HPLC測(cè)定巖黃連堿游離藥量（1）。按照文獻(xiàn)方法分別計(jì)算包封率和載藥量。

包封率＝(2－1)/2（1）

載藥量＝(2－1)/(2＋3) （2）

1為游離藥物的量，2為系統(tǒng)中藥物的總量，3為系統(tǒng)中輔料的量

取DC-NLCs混懸液0.4 mL，蒸餾水稀釋35倍后，置于粒度分析儀中，分別測(cè)定粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）及ζ電位。

2.4 單因素考察DC-NLCs處方及制備工藝

2.4.1 巖黃連堿用量的考察 取處方量的單硬脂酸甘油酯、油酸、卵磷脂、巖黃連堿，在固-液脂質(zhì)比為1∶8，聚山梨酯-80用量為1.0%，水浴溫度為70℃的條件下，考察巖黃連堿用量對(duì)DC-NLCs包封率、載藥量、粒徑等指標(biāo)的影響，結(jié)果見表1。隨著巖黃連堿用量的增加，包封率總體呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，這可能是在固-液脂質(zhì)用量不變的情況下，其包載藥物的能力有限造成的。粒徑及PDI值均呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì)，而載藥量呈增加趨勢(shì)，但ζ電位絕對(duì)值均大于20 mV。可見巖黃連堿用量對(duì)DC-NLCs的指標(biāo)影響較大，當(dāng)巖黃連堿用量為8 mg時(shí)包封率和載藥量相對(duì)較高，粒徑、PDI和ζ電位絕對(duì)值大小也相對(duì)理想。

表1 巖黃連堿用量對(duì)DC-NLCs指標(biāo)影響的考察(, n = 3)

2.4.2 固-液脂質(zhì)比的考察 固定巖黃連堿用量為2 mg，取單硬脂酸甘油酯8 mg、油酸64 mg和處方量的卵磷脂置于燒杯，聚山梨酯-80用量為1.0%，水浴溫度為70 ℃，以轉(zhuǎn)速為850 r/min磁力攪拌50 min?？疾觳煌?液脂質(zhì)比對(duì)DC-NLCs包封率、載藥量、粒徑等指標(biāo)的影響，結(jié)果見表2。當(dāng)固-液脂質(zhì)比分別為1∶1、1∶4、1∶8、4∶1、8∶1時(shí)，包封率、載藥量和ζ電位絕對(duì)值先上升后下降，而粒徑和PDI值先下降后再上升。可見，固-液脂質(zhì)比對(duì)DC-NLCs的影響較大，當(dāng)固-液脂質(zhì)比為1∶8時(shí)各指標(biāo)相對(duì)較好。

2.4.3 卵磷脂用量的考察 固定巖黃連堿用量為2 mg，取單硬脂酸甘油酯8 mg、油酸64 mg和25、45、65、85、105、125 mg的卵磷脂置于燒杯，聚山梨酯-80用量為1.0%，水浴溫度為70 ℃，以轉(zhuǎn)速為850 r/min磁力攪拌50 min?？疾觳煌蚜字昧繉?duì)DC-NLCs包封率、載藥量、粒徑等指標(biāo)的影響，結(jié)果見表3。當(dāng)卵磷脂用量逐漸增加時(shí)，包封率和載藥量先上升后下降。當(dāng)卵磷脂用量為65 mg時(shí)，包封率、載藥量和ζ電位較好。

2.4.4 攪拌時(shí)間的考察 固定巖黃連堿用量為2 mg，取單硬脂酸甘油酯8 mg、油酸64 mg和處方量的卵磷脂置于燒杯，聚山梨酯-80用量為1.0%，水浴溫度為70 ℃，以轉(zhuǎn)速為850 r/min，考察攪拌時(shí)間為10、30、50、70 min對(duì)DC-NLCs包封率、載藥量、粒徑等指標(biāo)的影響，結(jié)果見表4。當(dāng)攪拌時(shí)間逐漸增加時(shí)，載藥量先上升后下降的趨勢(shì)，包封率呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。當(dāng)攪拌時(shí)間為50 min時(shí)，包封率、載藥量和ζ電位較好。

表2 固-液脂質(zhì)比對(duì)DC-NLCs指標(biāo)影響的考察(, n = 3)

表3 卵磷脂用量對(duì)DC-NLCs指標(biāo)影響的考察(, n = 3)

2.4.5 水浴溫度的考察 固定巖黃連堿用量為2 mg，取單硬脂酸甘油酯8 mg、油酸64 mg和處方量的卵磷脂置于燒杯，聚山梨酯-80用量為1.0%，考察水浴溫度為50、60、65、70、85 ℃，以轉(zhuǎn)速為850 r/min磁力攪拌50 min。考察不同攪拌溫度對(duì)DC-NLCs包封率、載藥量、粒徑等指標(biāo)的影響，結(jié)果見表5。當(dāng)水浴溫度逐漸增加時(shí)，包封率和載藥量大致先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)水浴溫度為70 ℃時(shí)，包封率、載藥量和ζ電位較好。

2.4.6 表面活性劑種類的考察 固定巖黃連堿用量為2 mg，取單硬脂酸甘油酯8 mg、油酸64 mg和處方量的卵磷脂置于燒杯，分別加入1%聚山梨酯-80、1%泊洛沙姆、1% 15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯HS，以轉(zhuǎn)速為850 r/min磁力攪拌50 min?？疾觳煌砻婊钚詣?duì)DC-NLCs包封率、載藥量、粒徑等指標(biāo)的影響，結(jié)果見表6。當(dāng)表面活性劑為1%聚山梨酯-80時(shí)包封率、載藥量、粒徑、ζ電位、PDI較好。

表4 攪拌時(shí)間對(duì)DC-NLCs指標(biāo)影響的考察(, n = 3)

表5 水浴溫度對(duì)DC-NLCs指標(biāo)影響的考察(, n = 3)

表6 表面活性劑種類對(duì)DC-NLCs指標(biāo)影響的考察(, n = 3)

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.5.1 優(yōu)化方案設(shè)計(jì) 包封率、載藥量、PDI、ζ電位是NLCs的重要指標(biāo)，故選擇該4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。根據(jù)前期單因素考察，發(fā)現(xiàn)投藥量（1）、固-液脂質(zhì)比（2）和卵磷脂用量（3）對(duì)DC-NLCs包封率（1）、載藥量（2）和ζ電位（3）的影響較大，各個(gè)因素的水平見表7。將包封率、載藥量和ζ電位歸一化為OD（overall desirability）值[19]，作為Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的響應(yīng)指標(biāo)。

2.5.2 模型及方差分析 采用Design-Expert V 8.0.6軟件以綜合指標(biāo)OD值對(duì)1、2、3進(jìn)行擬 合，綜合考慮模型的擬合度及簡(jiǎn)潔性，采用2次多項(xiàng)式進(jìn)行擬合，得OD的2次多元回歸方程為1＝0.47－0.301－0.0112＋0.0123＋0.1412－0.1213＋0.26923＋0.02212－0.08622－0.09532（2＝0.929 0，＜0.000 1）。

由2與值和可知，該預(yù)測(cè)模型擬合情況較好；且方程的失擬項(xiàng)值均大于0.05，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此方程預(yù)測(cè)結(jié)果可靠性較高，可反映實(shí)際情況。對(duì)方程中各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，OD值方差分析見表8，其中1、12、23有顯著或極顯著差異（＜0.05、0.01）。

表7 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及試驗(yàn)結(jié)果

2.5.3 效應(yīng)面評(píng)估與預(yù)測(cè) 采用Design Expert V 8.0.6繪制因變量對(duì)自變量的三維曲面圖。分別固定投藥量（1）、固-液脂質(zhì)比（2）和卵磷脂用量（3）因素中之一，得到另外2個(gè)因素的交互作用對(duì)綜合指標(biāo)OD值影響的結(jié)果見圖2。得出DC-NLCs最佳處方為投藥量為10.00 mg，固-液脂質(zhì)比為1∶8，卵磷脂用量為65 mg，OD值為0.929 0，模型預(yù)測(cè)該處方的包封率為87.24%，載藥量為5.53%，ζ電位?16.50 mV。按照此處方平行制備3批DC-NLCs，結(jié)果見表9。測(cè)得其包封率為（85.29±0.01）%，載藥量為（6.27±0.00）%，ζ電位為（?17.90±1.09）mV分別與預(yù)測(cè)值較為接近，結(jié)果表明該方程預(yù)測(cè)結(jié)果較好。另測(cè)得DC-NLCs的粒徑為（188.50±11.77）nm，見圖3，結(jié)果表明DC-NLCs的粒徑較?。挥蓤D4可見，DC-NLCs和空白NLCs溶液有明顯的丁達(dá)爾效應(yīng)，但原料藥巖黃連堿溶液則沒有，進(jìn)一步表明納米脂質(zhì)載體的成功制備；由圖5可見，DC-NLCs的外觀形態(tài)圓整。

表8 方差分析結(jié)果

圖2 X2、X3對(duì)OD值的效應(yīng)面圖

表9 DC-NLCs的包封率、載藥量、粒徑、ζ電位、PDI

2.6 體外釋放

取適量純化后的DC-NLCs至透析袋中扎緊兩端，釋放介質(zhì)分別為30 mL的pH值為5.0、6.8、7.4的磷酸鹽緩沖液，溫度和轉(zhuǎn)速分別為（37±1）℃和100 r/min。分別在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、24.0、48.0 h分別取樣1 mL，并分別補(bǔ)液1 mL。各樣品均過0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)HPLC測(cè)定，結(jié)果見圖6?？梢姡瑤r黃連堿原料藥在2.0 h內(nèi)釋藥較快，累積釋放率為97.52%，基本釋放完全。而DC-NLCs在前3 h釋放相較快，在4.0～48.0 h則表現(xiàn)出明顯的緩釋作用。

圖3 DC-NLCs的粒徑分布

圖4 巖黃連堿、DC-NLCs、空白NLCs溶液的外觀

圖5 DC-NLCs的TEM圖

2.7 DC-NLCs的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.7.1 FT-IR分析 分別取適量純化的DC-NLCs凍干粉（所有樣品純化后均使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干成粉末）、空白NLCs凍干粉、巖黃連堿原料藥、空白NLCs凍干粉和巖黃連堿原料藥置于研缽中，加入適量溴化鉀研磨均勻后倒入模具中壓片。壓片完畢后分別進(jìn)行FT-IR測(cè)定，結(jié)果見圖7。巖黃連堿、巖黃連堿原料藥和空白NLCs凍干粉的物理混合物在1650 cm?1都有C-N的特征吸收峰，而空白NLCs、DC-NLCs在1650 cm?1沒有IR吸收，2700～3100 cm?1是甲基、亞甲基及次甲基的伸縮振動(dòng)，1650～1750 cm?1是羰基的特征吸收。結(jié)果表明，DC-NLCs成功制備。

圖6 DC-NLCs和巖黃連堿在不同溶液中的累積釋放率(, n = 3)

圖7 空白NLCs (a)、巖黃連堿＋空白NLCs (b)、DC-NLCs (c)、巖黃連堿(d)的FT-IR圖譜

2.7.2 差示掃描量熱（DSC）分析 分別稱取適量巖黃連堿原料藥、空白NLCs凍干粉、DC-NLCs凍干粉、DC-NLCs凍干粉和巖黃連堿原料藥物理混合物置于鋁制樣品盤中壓制后，在DSC的樣品室中，以空鋁缽為參比進(jìn)行測(cè)試。設(shè)置儀器參數(shù)為加熱速率10 ℃/min，掃描范圍30～300 ℃，結(jié)果見圖8。DC-NLCs和空白NLCs在175 ℃中有明顯的放熱峰，而沒有出現(xiàn)巖黃連堿在275 ℃的吸熱峰，這表明DC-NLCs成功制備。

圖8 巖黃連堿＋空白NLCs (a)、空白NLCs (b)、DC-NLCs (c)、巖黃連堿(d) 的DSC圖

2.7.3 X射線衍射（XRD）分析 分別稱取適量巖黃連堿原料藥、空白NLCs凍干粉、DC-NLCs凍干粉、DC-NLCs凍干粉和巖黃連堿原料藥物理混合物，將樣品粉末制成平整的試片，進(jìn)行XRD測(cè)定。測(cè)定條件：Ni-濾液器，Cu-K α射線，輻射波長(zhǎng)為0.154 056 nm，掃描范圍5°～45°，掃描速度5°/min、采樣時(shí)間l s，步長(zhǎng)0.05°進(jìn)行掃描，分別繪制XRD圖，結(jié)果見圖9。巖黃連堿自身有很多衍射峰，而制備成DC-NLCs后，所有的衍射峰都減弱了，且與空白NLCs具有相同的衍射的情況；由巖黃連堿與＋空白NLCs凍干粉的物理混合物比較可見，在相同位置中都出現(xiàn)了相同的衍射峰。結(jié)果表明，DC- NLCs制備成功。

2.8 DC-NLCs對(duì)肝纖維化細(xì)胞體外藥效研究

2.8.1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制活性 將LX-2細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，并使每孔含有細(xì)胞懸液100 μL。將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞單層平鋪孔底，棄去原培養(yǎng)基。再加入100 μL制備好5 ng/mL的TGF-β1繼續(xù)刺激24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入質(zhì)量濃度為1.2、2.4、4.8、9.6、19.2 μg/mL的巖黃連堿或DC-NLCs，選取未加入藥物作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，結(jié)果見圖10和表10。由圖10可見，未活化的LX-2細(xì)胞成梭形，經(jīng)過TGF-β1活化后，明顯出現(xiàn)星狀化；表10結(jié)果表明，與巖黃連堿相比，DC-NLCs在1.2、2.4、4.8、9.6、19.2 μg/mL對(duì)LX-2細(xì)胞的抑制率具有顯著性差異（＜0.01），且4.8 μg/mL的DC-NLCs在24 h后對(duì)細(xì)胞的抑制率達(dá)到50.57%。

圖9 空白NLCs (a)、DC-NLCs (b)、巖黃連堿＋空白NLCs (c)、巖黃連堿(d)的XRD圖

圖10 未活化(A) 和活化(B)的LX-2細(xì)胞

表10 巖黃連堿和DC-NLCs對(duì)LX-2細(xì)胞的抑制率

與巖黃連堿組比較：**＜0.01

**< 0.01dehydrocavidine group

2.8.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將30%～40%密度的LX-2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。再加入100 μL制備好5 ng/mL TGF-β1繼續(xù)刺激24 h后，棄去培養(yǎng)基24 h后，用10 μL無菌槍頭在每孔培養(yǎng)板底劃線條粗細(xì)均勻的豎線后，吸去培養(yǎng)基，200 μL PBS洗2次，再加入100 μL質(zhì)量濃度為4.8 μg/mL的巖黃連堿或DC-NLCs。在倒置顯微鏡下拍照，拍照結(jié)束后，置于培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，繼續(xù)拍照。計(jì)算遷移率，結(jié)果見圖11和表11。結(jié)果表明，DC-NLCs可明顯抑制LX-2細(xì)胞的遷移。

遷移率＝(0 h劃痕寬度－48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度

圖11 DC-NLCs對(duì)LX-2細(xì)胞的遷移影響

表11 DC-NLCs對(duì)LX-2細(xì)胞的遷移率

3 討論

巖黃連堿作為一種具有藥理活性的季銨堿化合物，越來越多研究表明巖黃連堿具有較好的肝纖維化治療潛力。然而巖黃連堿的水溶性差、半衰期短、生物利用度低等缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。NLCs是將固體脂質(zhì)與液體脂質(zhì)混合，并加入含有表面活性劑或表面活性劑混合物的水相，以形成與藥物結(jié)合的第二代脂質(zhì)納米顆粒[20]。由于固體和液體脂類的分子大小和構(gòu)象形狀不同，使載藥基質(zhì)不能形成完美晶格，產(chǎn)生了空隙。這增加了溶解性、滲透性、降低了代謝、p-糖蛋白外排，從而增加了溶性差藥物的生物利用度[21]。因此，在本研究中，利用單因素考察結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法成功優(yōu)化了DC-NLCs處方，并評(píng)估了其在提高藥物成藥性能以及對(duì)體外細(xì)胞藥效作用的影響。

在確定處方選用液態(tài)脂質(zhì)油酸，固態(tài)脂質(zhì)單硬脂酸甘油酯的前期，分別固定液態(tài)和固態(tài)脂質(zhì)，以包封率、粒徑等為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行了大量的處方篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單硬脂酸甘油酯和油酸制得的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率相對(duì)較高，且粒徑相對(duì)較小。因此，處方輔料選用單硬脂酸甘油酯和油酸。同時(shí)，研究油酸總量對(duì)DC-NLCs中藥物包封效率的影響。結(jié)果表明，DC-NLCs包封率從69.32%增加到86.75%，油酸質(zhì)量從20 mg增加到100 mg。這可能是由于液體脂質(zhì)摻入固體脂質(zhì)，導(dǎo)致了大量的晶體順序干擾，晶格中較大的缺陷留下了足夠空間來容納藥物分子，這最終提高了載藥能力和包封率[22]。在含有100 mg的油酸配方中，包封率最高，但粒徑、PDI較大，因此，綜合各因素處方選用油酸為64 mg的配比。單因素中考察了不同表面活性劑對(duì)包封率、載藥量、粒徑、ζ電位、PDI的影響，發(fā)現(xiàn)聚山梨酯-80所制備得到的DC-NLCs載藥量、包封率更高，可能由于聚山梨酯-80增溶及乳化效果更好，因此選用聚山梨酯-80作為表面活性劑。由于聚山梨酯-80的用量過大，會(huì)對(duì)紅細(xì)胞造成溶血現(xiàn)象[23]，對(duì)后續(xù)的大鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)造成影響，故選用1%聚山梨酯- 80進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤環(huán)境中由于癌細(xì)胞的有氧糖酵解增加導(dǎo)致癌細(xì)胞外pH值6.5～7.2低于正常組織[24]，DC-NLCs在釋放度實(shí)驗(yàn)中，藥物在pH值5.0中釋放最快，在pH值6.8中釋放最慢。這可能表明DC-NLCs在腫瘤環(huán)境中更適合緩慢釋放從而達(dá)到長(zhǎng)效作用。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道[25]，加入凍干保護(hù)劑形成的NLCs呈無定型狀態(tài)，而不含凍干保護(hù)劑的NLCs凍干后有一定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)存在。在進(jìn)行DSC實(shí)驗(yàn)中，空白NLCs、DC-NLCs只出現(xiàn)1個(gè)較弱的放熱峰，而巖黃連堿出現(xiàn)了1個(gè)較強(qiáng)的吸熱峰，可能是冷凍干燥時(shí)加入少量的蔗糖造成的。此外，巖黃連堿與空白NLCs的物理混合物沒有呈現(xiàn)任何的放熱、吸熱峰，有可能是物理混合物加大了兩者的不定型狀態(tài)造成的。

本研究所制備的DC-NLCs大小在150～200 nm，適合細(xì)胞攝取。在體外藥效研究發(fā)現(xiàn)，DC-NLCs對(duì)LX-2細(xì)胞在24、48 h都具有明顯的抑制作用，且與游離巖黃連堿抑制率的比較具有顯著性差異（＜0.01），這表明DC-NLCs對(duì)肝纖維化疾病治療有巨大的應(yīng)用前景。這些結(jié)果與納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在給藥方面的優(yōu)勢(shì)相一致[19,26]?？紤]到腫瘤組織和腫瘤微環(huán)境之間的聯(lián)系，需要通過更準(zhǔn)確和有效的藥物傳遞來解決日益增長(zhǎng)的癌癥負(fù)擔(dān)。在過去的20年里，納米技術(shù)在癌癥的診斷和靶向治療領(lǐng)域中做出了巨大貢獻(xiàn)[27]。然而，納米技術(shù)藥物傳遞相關(guān)的效率和毒性問題仍需要解決[28]。因此，后續(xù)研究將進(jìn)行DC-NLCs的體內(nèi)藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步完善質(zhì)量表征，為DC-NLCs的開發(fā)應(yīng)用提供更為全面的研究資料。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Formulation optimization of dehydrocavidine nanostructured lipid carriers by Box-Behnken design response surface method and pharmacodynamic studies

SU Xiao-dan1, MAI Wan-ting1, ZHONG Hua-shuai1, ZENG Yong-zhu1, LU Jian-mei1, QIN Yu-cui1, HUANG Qiu-jie2, YE Yong1, 3

1. School of Pharmacy, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China 2. School of Pharmacy, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530001, China 3. Guangxi Key Laboratory of Bioactive Molecules Research and Evaluation, Nanning 530021, China

To optimize the formulation of dehydrocavidine nanostructured lipid carriers (DC-NLCs) by Box-Behnken design response surface method, and studypharmacodynamics.Preparation of DC-NLCs by solvent evaporation. Encapsulation efficiency, drug loading and potential were used as evaluation index, single factor investigation method and Box-Behnken response surface method (BBD-RSM) were used to investigate the optimal prescriptions of DC-NLCs. The DC-NLCs were characterized andefficacy results were compared.The optimal formulation: dehydrocavidine dosage was 10.0 mg, solid-liquid lipid ratio was 1∶8, lecithin dosage was 85.0 mg, surfactant was 1% polysorbate-80. Envelopment efficiency, drug loading, potential and particle size of DC-NLCs were (85.29 ± 0.01)%, (6.27 ± 0.00)%, (?17.90 ± 1.09) mV and (188.50 ± 11.77) nm, respectively.drug release has obvious sustained-release characteristics.pharmacodynamic experiments showed that DC-NLCs had significant inhibitory effect on liver fibrosis.It is feasible to apply BBD-RSM for the formulation optimization of DC-NLCs, and DC-NLCs had significant inhibitory effect on liver fibrosis.

dehydrocavidine; nanostructured lipid carriers; Box-Behnken design-response surface method; sustained release; MTT colorimetric method; pharmacodynamic evaluation; solvent evaporation method; liver fibrosis

R283.6

A

0253 - 2670(2022)22 - 7019 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.005

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81960756）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360689）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2022GXNSFDA 035063）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2018GXNSFAA050078）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2015GXNSFAA139173）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升基金資助項(xiàng)目（2019KY0148）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升基金資助項(xiàng)目（2019KY0315）

蘇曉丹（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。

黃秋潔（1979—），女，副教授，主要從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: 13737172226 E-mail: hqj8@163.com

葉 勇（1979—），男，博士，副教授，主要從事民族藥藥效物質(zhì)及其新制劑研究。Tel: 13978679458 E-mail: yong-ye@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]