羥氯扎胺阿苯達唑復方混懸液中抑菌劑的添加劑量篩選及抑菌效力評價

張東輝，路寧寧，白玉彬，董 朕，陳 晨，李 冰，張繼瑜，周緒正

(中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 農村農業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

羥氯扎胺阿苯達唑復方混懸液是由中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所正在研發(fā)的新復方驅蟲制劑，在臨床上將被用于治療牛羊線蟲病、吸蟲病和絳蟲病，尤其是肝片吸蟲病。根據2020版《中華人民共和國獸藥典(二部)》抑菌效力檢查法(通則1121)規(guī)定[1-2]：如果藥物本身不具有充分的抗菌效力，則應根據制劑特性(如水溶性制劑)添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏或使用過程中由于微生物生長和繁殖而引起污染，尤其是多劑量包裝制劑。因此，可加入適當劑量的抑菌劑以防止混懸液被微生物污染。如果抑菌劑劑量不足，可能導致混懸液在多次使用過程中存在微生物污染現象；如果劑量過大，將會引起一定的毒副作用[3]。在混懸液中，抑菌劑的劑量一般應為最低有效劑量，既能達到規(guī)定抑菌效果的最低濃度，同時又能盡量減小抑菌劑的毒副作用[4]。為了合理使用抑菌劑，本試驗對羥氯扎胺阿苯達唑復方混懸液的抑菌劑添加濃度進行篩選，并對其抑菌效力進行評估。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9270型)，上海一恒科學儀器有限公司；生物安全柜(HFsafe-1200LC型)，上海力申有限公司；比濁儀，Densichek plus有限公司；電子天平(ME-403),梅特勒-托利多儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋(CT62A型)，馳通儀器(上海)有限公司。

1.2 供試品 羥氯扎胺阿苯達唑復方混懸劑(乳白色不透明混濁均一液體，規(guī)格為4.0%，每100 mL含羥氯扎胺和阿苯達唑各4.0 g)，由中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制。

1.3 試驗菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]和黑曲霉菌[CMCC(F)98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院醫(yī)學菌種保藏中心，試驗中均使用第3代傳代菌株。

1.4 主要試劑 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：1072401)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：1073051)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：1073191)和沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號：1071001)，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，各培養(yǎng)基均經適用性試驗，結果應符合2020版《中華人民共和國獸藥典(二部)》要求[2]；0.9%氯化鈉注射液；氯化鈉-蛋白胨緩沖液[含中和劑：3.0%聚山梨酯-80(Tween-80)、0.3%卵磷脂和0.1%組氨酸，pH 7.0]。

1.5 方法

1.5.1 菌液制備 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35 ℃培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)24 h。對上述培養(yǎng)物分別用0.9%氯化鈉注射液稀釋制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉菌新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)7 d，加入含0.05% Tween-80的0.9%無菌氯化鈉溶液3 mL，將孢子洗脫，過濾菌絲吸出孢子懸液至無菌試管中，然后制成適宜濃度的菌懸液。

1.5.2 未添加抑菌劑供試品的抑菌效力測定 取未添加抑菌劑的羥氯扎胺阿苯達唑復方混懸液供試品1瓶，分別移取10 mL至5支無菌試管中。分別接種1.5.1項中5種適宜濃度的菌懸液各100 μL，使接種后供試品中的菌濃度為105～106CFU/mL，充分搖勻，細菌于30～35 ℃(真菌于20～25 ℃)培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別在第14天和第28天對供試品中存活的微生物進行菌落計數，考察無抑菌劑情況下供試品中試驗菌的存活情況，為供試品中是否需要添加抑菌劑提供依據。抑菌效力判定標準如表1所示。

表1 抑菌效力試驗結果判定標準

1.5.3 抑菌劑劑量篩選 (1)第1次篩選試驗：在試驗中分別選取了苯甲酸鈉的常用濃度0.01%、0.02%、0.05%、0.10%、0.15%和0.20% 進行試驗。分別考察添加以上不同濃度苯甲酸鈉的羥氯扎胺阿苯達唑復方混懸液對5種試驗菌的抑菌能力，尋找合適的抑菌濃度區(qū)間，然后進行正式試驗。觀察試驗菌的生長情況，“+”表示有菌落生長，“-”表示無菌落生長。(2)第2次篩選試驗：選擇第1次篩選試驗結果中對抑菌劑抑制作用最弱的微生物作為試驗菌進行第2次篩選試驗。分別制備含0.015%、0.020%、0.030%、0.040%和0.050%共5個不同濃度的苯甲酸鈉供試品，即a、b、c、d組和e組。分別取上述各組供試品20 mL于無菌離心管中，接種1.5.1項中5種適宜濃度的菌懸液各100 μL，使接種后供試品中的菌濃度為105～106CFU/mL，充分搖勻，于適宜溫度的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。分別于第14天和第28天進行菌落計數。

1.5.4 菌落計數方法適用性試驗 根據第2次篩選試驗結果選擇最佳供試品中抑菌劑的添加量，進行抑菌效力測定。供試品的微生物計數方法應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該供試品的微生物計數。(1)試驗組：取含有最佳抑菌劑添加量的供試品，用含中和劑的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)進行10倍稀釋，即作為1∶10的供試液。吸取1∶10的供試液9.9 mL于5支無菌離心管中，分別加入1.5.1項中5種適宜濃度的菌懸液各100 μL，混勻，使每毫升供試液中含菌量不大于100 CFU。(2)供試品對照組：用等量無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)替代菌液，其余按試驗組操作。(3)菌液對照組：用等量無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)替代試驗組中的供試品，其余按試驗組操作。(4)中和劑對照組：用等量含中和劑的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)替代試驗組中的供試品，其余按試驗組操作。分別吸取試驗組、供試品對照組、菌液對照組和中和劑對照組液體1 mL各2份，置于90 mm無菌培養(yǎng)皿中，細菌注入約20 mL適宜溫度的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，凝固后置于30～35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d；真菌注入約20 mL適宜溫度的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，凝固后置于20～25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。

1.5.5 回收率測定 采用平皿法進行菌落計數。適用性試驗的回收率計算方法分別為：試驗組回收率/%=(試驗組菌落數-供試品對照組菌落數)/菌液對照組菌落數×100%；中和劑組回收率/%=(中和劑對照組菌落數-供試品對照組菌落數)/菌液對照組菌落數×100%。當回收率大于70%時，符合要求。

1.5.6 抑菌效力測定 (1)供試品制備：取3瓶不同批次含最佳抑菌劑濃度的包裝完整的羥氯扎胺阿苯達唑復方混懸液供試品，分別吸取9.9 mL至無菌離心管中，每批次準備5個以檢測5種試驗菌。(2)供試品接種：取上述每批次5個無菌離心管，分別接種1.5.1項中5種適宜濃度的菌懸液各100 μL，使接種后供試品中的菌濃度為105～106CFU/mL，振蕩搖勻，然后將接種后的供試品放置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。(3)存活菌落數測定：分別于接種后的第0、14天和第28天測定供試品中所含菌落數。精密量取接種后的供試品1 mL，用含中和劑的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH 7.0)依次進行10倍稀釋至適當的稀釋級，按照1.5.4項中適用性試驗的方法進行菌落計數。

2 結果

2.1 未添加抑菌劑供試品的抑菌效力測定 結果如表2所示，不添加抑菌劑的羥氯扎胺阿苯達唑復方混懸液對5種試驗菌幾乎均無抑菌效果，可能是由于在混懸液制備過程中選用Tween-80作為藥物的潤濕劑，而具有抑菌效力的原料藥被包被在其中，從而失去了抑菌能力。試驗結果表明：未添加抑菌劑的羥氯扎胺阿苯達唑復方混懸液供試品菌落數lg值的減少均不符合規(guī)定，因此，需要在混懸液中添加抑菌劑來確保用藥安全。

表2 未添加抑菌劑供試品第0、14天和第28天試驗菌對數值

2.2 抑菌劑劑量篩選

2.2.1 第1次篩選試驗 結果如表3所示，當抑菌劑苯甲酸鈉的濃度大于0.05%時，5種試驗菌均不生長；而當苯甲酸鈉的濃度小于0.02%時，表現出對部分或全部試驗菌有抑制作用。因此需要進一步篩選抑菌劑濃度，設計濃度為0.015%、0.020%、0.030%、0.040%和0.050%。

表3 第1次篩選試驗結果

2.2.2 第2次篩選試驗 選擇第1次篩選試驗中對抑菌劑抑制作用最弱的黑曲霉菌和白色念珠菌作為第2次篩選試驗的試驗菌。結果如表4所示，在5個不同濃度的試驗組中，a組(含0.015%苯甲酸鈉)雖然有抑菌作用，但是對黑曲霉菌的抑菌效果未達到抑菌效力判定標準；b、c、d組和e組(即苯甲酸鈉濃度在0.020%以上時)在第14天時對白色念珠菌和黑曲霉菌的菌落數lg值下降均大于1.0，且第28天時菌落數未增加，表現出有效的抑菌作用。即苯甲酸鈉濃度在0.020%以上時可有效抑制試驗菌的生長繁殖。由于抑菌劑存在一定的毒副作用，為了保證用藥安全，綜合以上因素考慮，最終選用b組(含0.020%苯甲酸鈉)作為供試品中抑菌劑的添加量。

表4 第2次篩選試驗結果

2.3 菌落計數方法適用性試驗 結果如表5所示，5種試驗菌的回收率均大于70%。表明該方法可以用于供試品的抑菌效力測定試驗。

表5 菌落計數方法適用性試驗結果

2.4 抑菌效力測定 結果如表6所示，細菌在第14天時不再生長；真菌在第14天時菌落數下降大于1.0個lg值且不再增加，故抑菌劑濃度為0.020%的供試品抑菌效力試驗結果符合判定標準。

表6 抑菌效力測定結果

3 討論

3.1 抑菌劑劑量篩選 口服混懸液是最常見的非處方獸藥制劑之一，為了避免在使用過程中發(fā)生二次污染，需要在其處方中加入適宜濃度的抑菌劑，同時抑菌劑的添加量應當在確保制劑有足夠抑菌能力的前提下添加越少越好[5-6]，且抑菌劑種類應對主藥含量無影響。國內的口服制劑在研發(fā)過程中，對抑菌劑的合理使用和質量控制沒有引起重視，許多制劑中存在抑菌劑添加過量的情況，其抑菌劑添加劑量是否合理值得深思[7-8]。因此，本試驗通過對抑菌劑苯甲酸鈉的濃度進行篩選，尋找最低有效抑菌濃度，同時還能保證藥物安全穩(wěn)定。在第1次劑量篩選過程中，低濃度的苯甲酸鈉對細菌有強烈的抑制作用，對真菌的抑菌較差，因此在第2次抑菌劑劑量篩選過程中主要以白色念珠菌和黑曲霉菌為考察對象。本試驗在濃度篩選過程中，依據“最低且有效”的原則，最終選擇的濃度合適的抑菌劑是0.020%的苯甲酸鈉。

3.2 計數方法適用性 計數方法適用性是進行抑菌效力試驗的重要一步，只有方法合適才能準確地反映樣品中微生物的存活情況，保障試驗的準確性，選出“低量有效”的抑菌劑濃度[9]。本試驗采用稀釋法聯用中和法(3% Tween-80、0.3%卵磷脂和0.1%組氨酸)進行菌落計數方法學適用性試驗[10-12]，消除混懸液中藥物對微生物的抑菌性，以便達到各試驗菌株回收率均大于70%的要求。

3.3 抑菌效力測定 在處方設計中，對抑菌劑濃度的篩選可能產生試驗偏差，同時還應考慮到在實際生產過程中可能存在的投料偏差[13]，為了保證抑菌作用的有效性，在試驗過程中分別取3瓶不同批次的混懸液進行抑菌效力測定。結果表明，供試品中添加0.020%的苯甲酸鈉可以滿足該混懸液在貯藏和使用的無菌要求。