渤海黑牛超數(shù)排卵與胚胎玻璃化冷凍保存研究

游偉，趙書慶，靳青，姜富貴，成海建，宋恩亮，張冬梅，譚秀文

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.濟(jì)南市歷城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 濟(jì)南 250099；3.鄒城市畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東 鄒城 273500)

渤海黑牛是我國唯一的濱海生態(tài)型黑色優(yōu)良牛種，被譽(yù)為“黑金剛”，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)嫩且蛋白質(zhì)豐富、遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)良的生物學(xué)特性，被列入國家、省畜禽品種志和?國家級品種資源保護(hù)名錄?。然而由于缺乏政府主導(dǎo)的系統(tǒng)育種和龍頭企業(yè)帶動等因素，渤海黑牛養(yǎng)殖效益較差，主產(chǎn)區(qū)存欄數(shù)量急劇下降，亟需對這一寶貴種質(zhì)資源進(jìn)行搶救性保護(hù)。

利用超數(shù)排卵技術(shù)可以在較短時間內(nèi)獲得大量的優(yōu)質(zhì)胚胎，用于鮮胚移植或冷凍保存，實(shí)現(xiàn)良種牛的快速擴(kuò)繁和種質(zhì)資源的長期保存。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于奶牛和其他主要肉牛品種[1-3]，然而關(guān)于渤海黑牛超數(shù)排卵及沖胚的報道非常少。已有研究證實(shí)，影響超數(shù)排卵的因素很多，季節(jié)[4，5]、激 素 劑 量[6]、供 體 牛 品 種[7]、日 糧 營養(yǎng)[8－10]等都可能對超數(shù)排卵效果產(chǎn)生影響。因此，本試驗(yàn)對季節(jié)、促卵泡素(FSH)來源、飼糧成分對渤海黑牛超排效果的影響進(jìn)行研究，并將獲得的可用胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍保存，旨在為渤海黑牛體內(nèi)胚胎生產(chǎn)及種質(zhì)資源保存提供應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 進(jìn)口促卵泡素(FSH)購自加拿大Bioniche animal health公司，國產(chǎn)FSH、氯前列烯醇(PG)購自寧波第二激素廠，磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)、三抗混合液(青霉素、鏈霉素和兩性霉素)購自以色列BI公司，培養(yǎng)液TCM199購自美國Gibco公司，玻璃化冷凍液套裝(包括平衡液、冷凍液)購自日本Kitazato公司。

1.1.2 主要耗材 玻璃化冷凍載桿購自廣州和弘生物科技有限責(zé)任公司，集卵杯、沖胚管購自日本富士平公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物及飼養(yǎng) 試驗(yàn)于2019年4月—2021年12月在山東無棣華興渤海黑牛種業(yè)公司進(jìn)行。供體牛為14～18月齡純種渤海黑牛青年母牛。所有牛只系譜檔案完整，無傳染病、寄生蟲病以及繁殖疾病，體況良好、膘情適中、生殖器官發(fā)育正常。全部采用舍飼喂養(yǎng)，每頭牛日采食2.5 kg精料(配方為65%玉米、30%豆粕、5%預(yù)混料)、3 kg干草、5 kg玉米青貯。

精液為本場自主生產(chǎn)的細(xì)管凍精，輸精前經(jīng)鏡下抽檢，精子活力良好，符合輸精標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

所選供體牛分別按季節(jié)(春、冬兩季)、FSH來源(進(jìn)口、國產(chǎn))、飼糧成分(含胚芽玉米、不含胚芽玉米)因素分組并進(jìn)行超排處理。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 同期發(fā)情處理 采用PG法兩次同期發(fā)情處理。將挑選好(直腸檢查生殖系統(tǒng)健康狀況:是否有子宮炎癥、各種卵巢疾病；在健康的基礎(chǔ)上卵巢是否處于乏情期，沒有卵泡發(fā)育，有明顯的功能性黃體)的供體牛采用PG肌肉注射，PG注射24 h后不間斷觀察牛只發(fā)情情況，詳細(xì)記錄每頭牛的發(fā)情時間。間隔10 d后，再進(jìn)行一次同期發(fā)情，方法同第一次。

1.3.2 超數(shù)排卵及人工授精 采用4天劑量遞減肌肉注射超數(shù)排卵方法。供體牛發(fā)情當(dāng)天記為0 d，在發(fā)情后第9天注射FSH 4 mL，早晚各2 mL；第10天注射FSH 3 mL，早晚各1.5 mL；第11天注射2 mL，早晚各1 mL，同時早上注射PG 4 mL；第12天注射FSH 1 mL，早晚各0.5 mL；早晚注射間隔時間為12 h。超排程序注射完后，第13天觀察供體牛發(fā)情情況，出現(xiàn)發(fā)情后間隔10 h左右開始人工授精。一般早上出現(xiàn)發(fā)情現(xiàn)象，傍晚配種，下午出現(xiàn)發(fā)情現(xiàn)象，第2天早上配種，輸精位置在子宮頸和子宮體連接的分叉處。第一次配種后，間隔12 h補(bǔ)配一次，再間隔10～12 h后，根據(jù)供體牛的發(fā)情情況決定是否需要進(jìn)行第三次輸精。

1.3.3 沖胚及質(zhì)量鑒定 第1次人工輸精后的第7天采用非手術(shù)法沖胚。將供體牛保定后，尾椎硬膜外腔注射5～8 mL利多卡因局部麻醉，待尾根松弛后清除直腸糞便，75%乙醇消毒外陰后生理鹽水沖洗2～3遍。按常規(guī)沖胚方法，每側(cè)子宮角約使用150～200 mL PBS液，回收到集卵杯后在體式顯微鏡下檢胚，將視野內(nèi)可見的胚胎用口吸管移至胚胎操作液(含1%三抗、20% FBS的TCM199培養(yǎng)液)中。按照國家標(biāo)準(zhǔn)?牛胚胎?(GB/T 25881—2010)中規(guī)定對胚胎質(zhì)量進(jìn)行鑒定，分為A、B、C、D級，其中A、B、C三級胚胎為可用胚胎，D級(含未受精和退化胚胎)為不可用胚胎。

1.3.4 玻璃化冷凍保存 選擇可用胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍保存。用口吸管把胚胎放在平衡液中，待收縮的胚胎體積恢復(fù)后轉(zhuǎn)移至冷凍液中，邊移動邊清洗，直到平衡液的擴(kuò)散液團(tuán)完全消失，再把胚胎放在載桿的前片端；手持載桿桿柄，將裝好胚胎的載片部分迅速浸入液氮中，用鑷子夾住桿套，浸入液氮中，直到無氣泡冒出，先將載片端輕輕套入桿套中，然后稍用力蓋緊，必要時可用力擰一下，以防桿套脫落；全部胚胎裝載完成后，桿柄朝上、桿套朝下，轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期儲存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0(Statistics Package for Social Sciences，Chicago，IL)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用獨(dú)立t－test進(jìn)行分析，百分率數(shù)據(jù)分析之前進(jìn)行一次反正弦轉(zhuǎn)換。當(dāng)P<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 季節(jié)對超數(shù)排卵的影響

分別在春、冬兩季對青年牛進(jìn)行超排，結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，春季超排有效率、頭均胚胎數(shù)高于冬季，但兩組間差異不顯著；春季頭均可用胚數(shù)、胚胎可用率顯著高于冬季(P<0.05)。

表1 季節(jié)對渤海黑牛超排效果的影響

2.2 FSH來源對超數(shù)排卵的影響

分別利用國產(chǎn)和進(jìn)口FSH對青年牛進(jìn)行超排，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)FSH處理的所有牛只均沒有排卵，其超排有效率、頭均胚胎數(shù)、頭均可用胚數(shù)、胚胎可用率顯著低于進(jìn)口FSH(P<0.05)。

表2 FSH來源對渤海黑牛超排效果的影響

2.3 飼糧成分對超數(shù)排卵的影響

飼糧中分別添加含胚芽玉米和不含胚芽玉米，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，含胚芽玉米組超排有效率、頭均胚胎數(shù)、頭均可用胚數(shù)、胚胎可用率均顯著高于不含胚芽玉米組(P<0.05)。

表3 飼糧成分對渤海黑牛超排效果的影響

2.4 胚胎的玻璃化冷凍保存

利用冷凍載桿將收集的可用胚共計103枚進(jìn)行玻璃化冷凍保存(圖1)。結(jié)果如表4，胚胎在平衡液中收縮后如果不能恢復(fù)原體積則棄掉，最后冷凍85枚，胚胎冷凍可用率為82.52%。本研究中每個冷凍載桿放2～3枚胚胎，桿均胚胎數(shù)為2.30枚。

圖1 玻璃化冷凍保存渤海黑牛胚胎

表4 渤海黑牛胚胎的玻璃化冷凍保存情況

3 討論

盡管嚴(yán)格意義上來說牛不屬于季節(jié)性發(fā)情動物，但其繁殖性能還是受到季節(jié)的影響。已有研究證實(shí)，季節(jié)影響牛的發(fā)情持續(xù)時間、孕酮濃度和受精率。在熱帶地區(qū)，雨季(3.5枚可移植胚胎/牛)較旱季(2.7枚可移植胚胎/牛)超排效果好[11]。Massey等[12]報道，婆羅門奶牛冬季獲可移植胚胎2.6枚/牛，春季獲可移植胚胎4.4枚/牛；同樣，Bastidas等[13]對813頭婆羅門奶牛進(jìn)行超排處理，發(fā)現(xiàn)秋季獲可移植胚胎4.2枚/牛，冬季獲可移植胚胎2.9枚/牛。Vieira等[14]報道，地處巴西西南部的熱帶氣候，每年涼爽季節(jié)經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛和青年奶牛的超排效果顯著高于濕熱季節(jié)，獲可移植胚胎和可冷凍胚胎數(shù)量顯著增多。但也有報道認(rèn)為，季節(jié)對供體牛超排數(shù)量沒有影響[15]。本研究中，春季渤海黑牛頭均可用胚數(shù)、胚胎可用率顯著高于冬季。

牛超排選用的外源激素主要是FSH，由于半衰期只有5 h，所以需要頻繁給藥。早期關(guān)于超排的研究認(rèn)為，LH是FSH超排成功所必需的；目前研究表明，內(nèi)源性LH足以完成卵泡生長的最后階段，不需要外源性LH[16]，而且高LH含量影響FSH產(chǎn)品質(zhì)量[17，18]。目前獲批用于獸醫(yī)的商業(yè)制劑FSH主要來自豬垂體組織。盡管經(jīng)過純化，但LH污染程度在這些產(chǎn)品之間以及產(chǎn)品中的批次之間可能會有所不同。另外，糖蛋白激素在其60多種不同異構(gòu)體中表現(xiàn)出廣泛的生物活性差異[19]。因此，純度和生物活性的變化可能是導(dǎo)致超排卵反應(yīng)不一致的因素[20，21]。本研究中，購自加拿大的FSH是目前牛超排方案中最被認(rèn)可的促性腺激素，超排效果穩(wěn)定。但近兩年由于受新冠疫情、貿(mào)易戰(zhàn)等各方面影響，國內(nèi)市場缺貨嚴(yán)重，價格持續(xù)攀高，因此促使大家選擇國內(nèi)同類產(chǎn)品。本研究采用寧波激素二廠生產(chǎn)的FSH，按超排程序進(jìn)行注射，但8頭供體牛均沒有排卵。秦殿武等[22]也報道，國產(chǎn)FSH(中科院生產(chǎn)[23]的除外)超排效果非常差，因此不建議使用。

研究證實(shí)，采食量、能量、蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)因素對動物的繁殖性能有重要影響，其中能量和干物質(zhì)攝入量(DMI)對牛超排效果發(fā)揮關(guān)鍵作用[8，24]。能量不足或過剩都會對胚胎產(chǎn)生不利影響。在日糧配方中，玉米是能量的重要來源，然而隨著玉米深加工的發(fā)展，胚芽作為附加值更高的產(chǎn)品被從玉米中分離出來，這部分不含胚芽的玉米主要流向了養(yǎng)殖場。玉米胚芽成分中脂肪含量高達(dá)40%～50%，其中不飽和脂肪酸達(dá)84%以上，主要為油酸和亞油酸，同時含有豐富的維生素E和鈣、鐵、鋅、硒等礦物質(zhì)，營養(yǎng)價值非常高。日糧配方中如果用去除胚芽的玉米粉代替全價玉米，超排效果是否受影響一直未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，不含胚芽玉米顯著降低超排效率，說明供體牛的超排效果與營養(yǎng)水平息息相關(guān)，必須飼喂全價飼料。

4 結(jié)論

渤海黑牛在春季較冬季更適合進(jìn)行超排處理，同時選用進(jìn)口FSH、飼喂?fàn)I養(yǎng)均衡的日糧，可在較大程度上保證超排效果；對獲得的可用胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍保存，可為渤海黑牛的快速擴(kuò)繁和種質(zhì)資源保存提供重要的“種子”資源。