番茄果實灰霉病拮抗細菌菌株SG－11的鑒定及其抑菌作用

崔杰，王翠翠，劉永光，趙紅，張德珍，遲文娟，楊園園

(1.濰坊科技學院/山東省設施園藝生物工程研究中心/山東省高校設施園藝實驗室，山東 壽光 262700；2.青島市黃島區(qū)自然資源局，山東 青島 266555)

番茄灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的一種世界性病害，主要危害葉片和果實，造成發(fā)病部位腐爛[1]，已成為我國溫室番茄生產(chǎn)中高發(fā)病害之一[2]?；移咸焰呦驳蜏?、高濕條件，不僅在番茄生長期為害，在番茄儲藏期及運輸期均能侵染果實，嚴重時可減產(chǎn)60%[3]。因此，灰霉病已成為限制我國番茄安全生產(chǎn)的重要因素。

目前防治番茄灰霉病的主要方法為化學防治，然而由于灰霉病菌繁殖快、變異度大等使得該病菌對化學藥劑極易產(chǎn)生抗藥性[1]。對于采后果實來說，生物防治在抑制病原菌生長的同時能夠保證食品的安全性，且對環(huán)境友好，因此以有效微生物取代化學殺菌劑用于果蔬采后病害的防治具有廣闊的應用前景。芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)因其穩(wěn)定性好、定殖率高以及防治效果好等優(yōu)點，已被開發(fā)成生物殺菌劑。楊利敏等[4]測定出一株枯草芽孢桿菌的發(fā)酵濾液在離體葉片上對番茄灰霉的防治效果可達100%；Bu等[5]篩選的一株枯草芽孢桿菌L1－21對番茄果實灰霉病防效達86.57%；潘曉梅等[6]從土壤中篩選到一株蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其對灰霉病菌的菌絲抑制率達66.35%；童蘊慧等[7]分離獲得的拮抗性強、抗菌譜廣的地衣芽孢桿菌對番茄葉片和果實灰霉病的防效為70%～80%，優(yōu)于50%速克靈2000倍液。目前針對番茄灰霉病生防菌的研究集中于平板對峙效果或?qū)θ~片病情的控制，而采后控制效果鮮有報道。因此，本研究從番茄根際土壤中獲得一株對番茄灰霉病具有良好防效，且具有廣譜真菌抗性的芽孢桿菌，并測定了其對采后番茄灰霉病抑制效果，為豐富生物防治番茄灰霉病抑病資源、開發(fā)新型農(nóng)用殺菌劑提供了材料。

1 材料與方法

1.1 供試病原真菌與培養(yǎng)基

供試菌株:番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici)、番茄灰葉斑病菌(Stemphylium lycopersici)、黃瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、番茄黑斑病菌(Alternaria alternata)、黃瓜黑斑病菌(Alternaria cucumerina)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum siamense)、蘋果褐斑病菌(Marssonina mali)，均由本實驗室分離和保存。蘋果炭疽葉枯病菌(Glomerella cingulata)和蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria dothidea)由青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院李保華教授惠贈；番茄早疫病菌(Alternaria solani)由中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院吳學宏教授惠贈。所有菌株均經(jīng)過單孢或單菌絲分離后保存。

供試培養(yǎng)基:拮抗細菌的分離和培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L，pH值自然)；病原菌的培養(yǎng)以及對峙培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L，pH值自然)。所有培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20 min后備用。

1.2 番茄灰霉病拮抗細菌的分離方法

于2021年4月1日在山東省壽光地區(qū)番茄溫室采集根際土壤樣品，取10 g放入盛有90 mL無菌水的三角瓶中于28℃、180 r/min振蕩30 min，使之充分混勻，然后置于80℃水浴處理10 min。用無菌水將其稀釋成10－1、10－2、10－3和10－4倍的土壤懸浮液，每個濃度吸取100 μL涂布于LB平板上，每個梯度重復3次。將平板倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)48 h。挑取形態(tài)不同的細菌單菌落在LB固體平板上劃線，獲得純化細菌菌株。

1.3 番茄灰霉病拮抗細菌初篩

將番茄灰霉病菌于25℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)7 d，用無菌水沖洗菌落，使用血球計數(shù)板將孢子濃度調(diào)至1×107個/mL。取500 μL孢子懸液加入100 mL融化冷卻至45℃左右的PDA培養(yǎng)基中，搖勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，制成含病原菌的瓊脂平板。在病原菌平板上用十字劃線法接入待檢測細菌菌株，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。挑選出對番茄灰霉病菌有明顯拮抗作用的細菌進行復篩。

1.4 番茄灰霉病拮抗細菌復篩

采用平板對峙法進行拮抗細菌的復篩。于對峙培養(yǎng)前3 d活化番茄灰霉病菌，同時挑取一環(huán)初篩有抑制效果的拮抗細菌加入到100 mL液體LB培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，制備種子液。取100 μL種子液加入100 mL LB培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)48 h。對峙培養(yǎng)時，在PDA平板中央接種直徑6 mm的番茄灰霉病菌菌餅，四周等距離2.5 cm處接種5 μL待測細菌菌液，以5 μL無菌水作為空白對照。置于25℃黑暗培養(yǎng)，3 d后統(tǒng)計細菌菌液對番茄灰霉病病原菌的抑制率。每個處理重復3個平板，試驗重復3次。

抑制率(%)＝(對照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑－菌餅直徑)×100。

1.5 生防細菌SG－11的抑菌譜測定

于對峙培養(yǎng)前3～5 d將番茄枯萎病菌、番茄灰葉斑病菌、黃瓜靶斑病菌、黃瓜黑斑病菌、番茄黑斑病菌、番茄早疫病菌、草莓炭疽病菌、蘋果褐斑病菌、蘋果炭疽葉枯病菌和蘋果輪紋病菌共10種常見植物病原菌進行活化。將直徑6 mm菌餅置于PDA平板中央，距其2.5 cm處四個點滴加5 μL拮抗菌SG－11菌液，以無菌水為對照，25℃培養(yǎng)3～5 d后計算菌絲生長抑制率。每個處理設置3個重復，所有試驗重復3次。

1.6 拮抗細菌SG－11對番茄灰霉病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制效果

參考1.4獲得拮抗細菌SG－11的種子液，取100 μL種子液加入100 mL LB培養(yǎng)基中28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，用LB培養(yǎng)基將培養(yǎng)液分別稀釋5、10、20、40倍，平板中央放置直徑為6 mm的灰霉菌餅。以無菌水為空白對照，50%腐霉利1500倍液為陽性對照。25℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，計算抑制率。

將SG－11菌液調(diào)整濃度為1×109cfu/mL，于12000 r/min離心15 min，使用細菌過濾器將上清液過濾，上清濾液用無菌水稀釋5、10、20、40倍，分別取10 μL與濃度為1×105個/mL的番茄灰霉病菌孢子懸浮液(用1%葡萄糖溶液配制)等體積混合，滴到載玻片中央，于100%相對濕度下25℃培養(yǎng)10 h。無菌水與分生孢子的混合液為空白對照。滴加0.1%曲利苯藍乳酚油終止萌發(fā)，檢查孢子萌發(fā)率，每個濃度設置3個重復，每個玻片檢測200個孢子，試驗重復3次。孢子萌發(fā)率(%)＝孢子萌發(fā)數(shù)量/孢子總量×100；孢子萌發(fā)抑制率(%)＝(1－處理孢子萌發(fā)率)/對照孢子萌發(fā)率×100。

1.7 拮抗細菌SG－11的分子生物學鑒定

采用細菌通用引物27F/1492R和up－1/up－2r分別擴增16S rDNA和gyrB基因片段[8]，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，擴增產(chǎn)物送至深圳華大基因股份有限公司進行測序。將獲得的基因序列與GenBank中已知的核酸序列進行BLAST比對，并選取近緣種序列用MEGA 7軟件中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 菌株SG－11對離體番茄果實灰霉病的抑制作用

從壽光番茄溫室中采集處于青熟期的“貝貝”櫻桃番茄果實，選取成熟度、果型、大小一致的果實用于接種試驗。經(jīng)75%乙醇果面消毒后，用無菌釘在果實赤道處打孔(直徑2 mm，深度2 mm)，每個果實一個孔口。待傷口晾干后，向其加入10 mL不同稀釋倍數(shù)的SG－11上清濾液(同1.6)，以無菌水處理為空白對照，50%腐霉利1500倍液為陽性對照。于22℃恒溫保濕處理48 h后，每傷口接種10 μL濃度為1×105個/mL的灰霉病菌孢子懸浮液。將接種后的番茄果實置于22℃、相對濕度為90%左右的密封盒中，每24 h觀察發(fā)病率與病斑擴展情況，測量病斑直徑，計算防效。防效(%)＝(對照組病斑面積－處理組病斑面積)/對照組病斑面積×100。每個處理接種30個番茄，試驗重復3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 25軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，采用鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄灰霉病拮抗細菌菌株的篩選

從供試土壤樣品中共獲得28株細菌，經(jīng)初篩與復篩后確定4株細菌對番茄灰霉病菌有較為穩(wěn)定的拮抗效果。在對峙培養(yǎng)中，4株細菌對番茄灰霉病菌的菌絲具有明顯的抑制作用，靠近細菌的一側(cè)菌絲生長速度減緩或停止。4個菌株中SG－11對番茄灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率為79.81%(圖1)。

圖1 拮抗細菌對番茄灰霉病菌的抑制作用

2.2 菌株SG－11對10種病原真菌的抑制作用

菌株SG－11對供試10種病原菌有不同程度的抑制作用，抑制率范圍為49.07%～78.02%，具有抑菌廣譜性。其中，對蘋果輪紋病菌、蘋果炭疽葉枯病菌和草莓炭疽病菌的抑制率均在70%以上，顯著高于其他供試病原菌(表1)。

表1 拮抗細菌菌株SG－11對10種病原真菌的抑制作用

2.3 生防菌SG－11對番茄灰霉病菌生長的影響

2.3.1 對菌絲生長的影響 生防菌株SG－11對番茄灰霉病菌菌絲生長抑制率隨菌液稀釋倍數(shù)的增加而顯著降低，SG－11原液對菌絲生長抑制率高達92.44%，顯著優(yōu)于50%腐霉利1500倍液(表2)；稀釋5倍對菌絲生長的抑制率為87.00%，與50%腐霉利1500倍液沒有顯著差異；稀釋40倍時防效降低為26.45%。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，對照組菌絲直立、粗細均勻，頂端分枝較少(圖2A)；加入SG－11后菌絲生長受到抑制，且發(fā)育異常，菌絲扭曲、分枝多(圖2B)，有細胞質(zhì)外滲現(xiàn)象(圖2C)。

2.3.2 對孢子萌發(fā)的影響 菌株SG－11濾液對番茄灰霉病菌分生孢子的萌發(fā)有明顯的抑制作用，可顯著降低其萌發(fā)率(表2)。正常生長的灰霉菌分生孢子萌發(fā)后菌絲生長較快，且粗細均勻(圖2D)，而經(jīng)SG－11濾液處理的分生孢子萌發(fā)較慢，芽管分枝較多(圖2E)，萌發(fā)率隨著濾液濃度升高而降低，但稀釋40倍時對孢子萌發(fā)抑制率仍高達30.73%。稀釋10倍時其對孢子萌發(fā)的抑制率仍優(yōu)于50%腐霉利1500倍液(表2)。

表2 菌株SG－11培養(yǎng)液對孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制作用

圖2 菌株SG－11對番茄灰霉病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

2.4 拮抗菌株SG－11的分子生物學鑒定

經(jīng)16S rDNA與gyrB基因測序分別獲得1064 bp和1053 bp長度的序列，經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)其與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)的序列相似性最高，分別為98.41%與98.77%。采用MEGA 7最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖3)表明，16S rDNA與gyrB基因序列聚類中，菌株SG－11均與B.velezensis聚為一支，因此將拮抗菌株SG－11鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 基于16S rDNA(A)與gyrB基因(B)構(gòu)建的 菌株SG－11系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 菌株SG－11對番茄果實灰霉病的防治效果

處理番茄果實3 d后，調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同稀釋倍數(shù)的濾液均對番茄果實灰霉病有顯著防效，病斑直徑小于無菌水處理(圖4)。使用SG－11濾液原液、稀釋5倍與10倍的濾液處理番茄果實后防效均高于80%。隨著濾液濃度的降低，其對番茄灰霉病的防效也逐步減弱，稀釋40倍時防效僅為30.0%，低于50%腐霉利1500倍液(圖4)。

圖4 生防菌株SG－11對番茄果實 灰霉病的防治效果

3 討論與結(jié)論

本研究從番茄溫室土壤中篩選到一株對番茄灰霉病有較好拮抗效果的細菌SG－11，經(jīng)16S rDNA與gyrB序列分析，將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)。芽孢桿菌抗逆性強、在植物表面有較好的定殖能力，且防治效果好、穩(wěn)定性高，已廣泛應用于多種植物病害的生物防治中。據(jù)報道，特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)在室內(nèi)和盆栽試驗中均對黃芪根腐病表現(xiàn)出較好的防效[9]；番茄內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌ZSY－1可在根部和葉部組織定殖，且對番茄植株灰霉病防效高于80%[10]。貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個新種，與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌親緣關系較近，近年來已用于防治桃褐腐病、菜豆菌核病[10]、番茄青枯病和黃瓜棒孢葉斑病[11]等幾十種植物病害。本研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌株SG－11的抑菌譜非常廣，對蘋果輪紋病菌、草莓炭疽病菌和蘋果炭疽葉枯病菌有非常強的抑制作用，防治效果均高于70%，表明該菌株具有成為新型生防微生物農(nóng)藥的潛力。

番茄采后病害常導致嚴重的經(jīng)濟損失。研究發(fā)現(xiàn)番茄進入儲藏期后，灰霉病發(fā)生率高達40%[12]，然而儲藏期果實不宜采用化學農(nóng)藥防控，因此生物防治成為果蔬采后病害防治的重要途徑。已有研究表明貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽物質(zhì)浸泡采后番茄果實對早疫病具有良好的防效[13]，羅倫隱球酵母菌(Cryptococcus laurentii)懸浮液浸泡櫻桃番茄10 min后對灰霉病的防效達59.1%[14]。然而目前關于貝萊斯芽孢桿菌控制番茄采后灰霉病的研究較少，本研究中菌株SG－11濾液稀釋10倍后對灰霉病的防效仍高于80%，表明SG－11對番茄果實灰霉病具有較好的防效。

拮抗細菌對病原菌的作用方式主要是抑制真菌分生孢子的萌發(fā)和菌絲生長以及導致病原菌菌絲畸形如頂端膨大、分支增多、細胞質(zhì)外滲等[15]，這在本研究中也得到了證實。SG－11對番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長等具有顯著的抑制作用，表明該菌株在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了抑菌物質(zhì)。多項研究發(fā)現(xiàn)拮抗細菌或真菌能產(chǎn)生醇類和酮類等有機揮發(fā)物(VOCs)，也可能通過分泌脂肪類、酯類、酚類和肽類等物質(zhì)來抑制病原菌生長[16－18]，但有關菌株SG－11抗菌活性物質(zhì)尚不明確，還需進一步提取和鑒定。另外，生防菌除自身分泌抗菌物質(zhì)外，還能提高植物防御酶活性[14，19，20]。因此，為進一步明確其抑菌機理有必要開展SG－11在番茄果實上定殖以及對番茄防御酶活性方面的研究，為該菌株活體制劑研發(fā)提供依據(jù)。