石斛多糖延緩秀麗隱桿線蟲衰老的研究

李海春 廖思藝 田貴豐 許吉安 劉 偉 黃九九*

（1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；2廣州市博藤貿(mào)易有限公司，廣東廣州 510000；3廣州蜜妝生物科技有限公司，廣東廣州 510000）

石斛屬（Dendrobium）植物為蘭科（Orchidaceae）附生珍稀瀕危物種，為中國傳統(tǒng)名貴中藥材[1]。石斛莖中含有豐富的植物多糖，具有滋養(yǎng)皮膚、降低血糖、抗腫瘤、提高免疫力及延緩衰老等功效，素有“藥中黃金”之美稱[2]。對(duì)于石斛多糖滋養(yǎng)皮膚、降低血糖、抗腫瘤、提高免疫力等功能的研究多有報(bào)道[2-5]，但其延緩衰老功能及可能的作用機(jī)理尚缺乏試驗(yàn)依據(jù)。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一種無毒無害、可以獨(dú)立生存的線蟲，其遺傳背景清楚、個(gè)體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生命周期短、基因組測(cè)序完成、進(jìn)化過程中高度保守、與人類的基因同源性高達(dá)60%～80%，且培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、易于操作，為國際上公認(rèn)的分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究的首選模式生物，目前被廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域[6-8]。

本文選取多糖含量豐富的鐵皮石斛、鼓槌石斛、細(xì)莖石斛為研究對(duì)象，對(duì)石斛多糖影響秀麗隱桿線蟲的壽命、產(chǎn)卵量、運(yùn)動(dòng)行為和熱應(yīng)激能力等進(jìn)行了研究，旨在探討石斛多糖延緩衰老的作用機(jī)理，以期為更好地開發(fā)利用石斛多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、細(xì)莖石斛（Dendrobium moniliforme （L.） Sw.）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum Lindl.），取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物種質(zhì)保護(hù)與利用研究中心的溫室大棚。

雌雄同體的N2野生型秀麗隱桿線蟲、尿嘧啶合成缺陷型大腸桿菌菌株E.coli OP50，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取鐵皮石斛、細(xì)莖石斛、鼓槌石斛3個(gè)石斛品種，分別從中提取石斛多糖[9]。每個(gè)石斛品種均配置成濃度為0.4、0.8、1.6 mg/mL的石斛多糖溶液，分別取 5 μL，并加入 E.coli OP50 菌液 95 μL，混勻后涂于NGM平板上。得到石斛多糖最終濃度分別為20、40、80 mg/L，對(duì)照組添加相應(yīng)量的無菌水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 E.coli OP50培養(yǎng)。挑取E.coli OP50單菌落至10 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6。

1.3.2 秀麗隱桿線蟲的復(fù)蘇和培養(yǎng)。取秀麗隱桿線蟲凍存管于37℃水浴解凍，以1500r/min離心1min，棄上清液，沉淀轉(zhuǎn)移到涂布E.coli OP50的線蟲培養(yǎng)基（NGM）的菌苔外緣，于20℃培養(yǎng)。

1.3.3 秀麗隱桿線蟲的同期化處理。將處于產(chǎn)卵期的雌雄同體的線蟲用無菌M9溶液沖洗轉(zhuǎn)移至EP管，加入等量高氯酸鈉裂解液充分混勻后離心，沉淀用M9溶液清洗2～3次至pH值7.0，取蟲卵滴于含E.coli OP50的NGM平板上20℃恒溫培養(yǎng)，約48 h后，線蟲的受精卵發(fā)育至L4期，完成同期化處理。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 壽命測(cè)定。取同期化的線蟲，記為本次試驗(yàn)的第0天，20℃恒溫培養(yǎng)，每天將存活的線蟲轉(zhuǎn)移到新NGM培養(yǎng)板，記錄線蟲的死亡數(shù)量和存活數(shù)量，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。線蟲無移動(dòng)、吞咽動(dòng)作且用鉑絲輕觸蟲體無任何反應(yīng)視為死亡，最后一條線蟲死亡的時(shí)間為該組線蟲的最長壽命[10]。

1.4.2 產(chǎn)卵量測(cè)定。取同期化的線蟲，每個(gè)NGM平板放置1條，每隔24 h轉(zhuǎn)移到新NGM培養(yǎng)板，待線蟲不再產(chǎn)卵后將所有NGM平板繼續(xù)于20℃恒溫培養(yǎng)。子代線蟲孵化長大后進(jìn)入產(chǎn)卵期之前對(duì)線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)，即為該線蟲的產(chǎn)卵量[11]，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。

1.4.3 頭部擺動(dòng)頻率測(cè)定。挑取狀態(tài)相當(dāng)?shù)耐诨€蟲，放置在無大腸桿菌的NGM平板上，記錄1 min內(nèi)線蟲頭部擺動(dòng)的次數(shù)，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。一次頭部擺動(dòng)是指線蟲的頭部從一個(gè)方向擺向另一個(gè)方向后又?jǐn)[回來[12]。

1.4.4 身體彎曲頻率測(cè)定。挑取狀態(tài)相當(dāng)?shù)耐诨€蟲，放置在無大腸桿菌的NGM平板上，記錄1 min內(nèi)線蟲身體彎曲的次數(shù)，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。一次身體彎曲是指線蟲向身體所在直線的方向做一個(gè)波長的運(yùn)動(dòng)[12]。

1.4.5 熱應(yīng)激能力測(cè)定。取同期化的線蟲，于20℃恒溫培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)移到37℃下培養(yǎng)，每隔1 h記錄線蟲的存活率，每組測(cè)定50條，重復(fù)3次。線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)同壽命測(cè)試[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

衰老研究主要關(guān)注的指標(biāo)之一是生物體的壽命長短[14]。鐵皮石斛、細(xì)莖石斛和鼓槌石斛在石斛屬中均屬于多糖含量較高的種類，試驗(yàn)分別選取不同濃度的石斛多糖添加涂布于NGM平板，觀測(cè)NGM平板秀麗隱桿線蟲的壽命，結(jié)果如表1所示。不同濃度的石斛多糖能顯著延長秀麗隱桿線蟲的最長壽命和平均壽命；且隨著濃度的增大，石斛多糖延長壽命的效果越明顯，濃度為80 mg/L的細(xì)莖石斛多糖延長壽命的效果最好，與不添加多糖的對(duì)照組相比，平均壽命增加了33.3%。

在評(píng)估藥物抗衰老功能特性時(shí)，不僅需要考慮藥物對(duì)生物體壽命的影響，還需要關(guān)注藥物在延長壽命的同時(shí)對(duì)機(jī)體正常生理活動(dòng)是否有影響[15]。由表2可知，添加不同濃度的鐵皮石斛多糖、細(xì)莖石斛多糖和鼓槌石斛多糖，秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵量與對(duì)照組沒有明顯差異，表明石斛多糖在延長秀麗隱桿線蟲壽命的同時(shí)并沒有降低其生殖能力。

2.2 石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)行為能力的影響

運(yùn)動(dòng)是生命的基本存在形式，反映了神經(jīng)系統(tǒng)基本功能完好，生物體衰老往往伴隨著運(yùn)動(dòng)行為能力的下降[16]。對(duì)于線蟲，運(yùn)動(dòng)行為能力的喪失意味著死亡。由表3、表4可知，與不添加石斛多糖的對(duì)照組相比，3種石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率均有明顯提升，且隨著濃度的增大，石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)行為能力的影響越明顯；在濃度80 mg/L時(shí)，3種石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲頭部擺動(dòng)頻率的提升效果相當(dāng)，而鼓槌石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲身體彎曲頻率的提升效果最明顯。

表3 不同石斛多糖處理下秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)頻率

表4 不同石斛多糖處理下秀麗隱桿線蟲的身體彎曲頻率

2.3 石斛多糖對(duì)秀麗隱桿線蟲熱應(yīng)激能力的影響

細(xì)胞應(yīng)激是由熱、冷、缺氧、酸度變化、炎癥、X射線或紫外線照射等引起的，其中急性熱應(yīng)激通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性影響DNA復(fù)制，從而引發(fā)正常細(xì)胞衰老凋亡，縮短生物體的壽命[17]。生物體對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力被稱作對(duì)環(huán)境的應(yīng)激能力[17]。由圖1可知，在37℃條件下，石斛多糖處理的秀麗隱桿線蟲存活率較對(duì)照得到了明顯提高，并且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。其中，80 mg/L細(xì)莖石斛多糖的效果最為明顯，且與其延長壽命效果相吻合。表明石斛多糖能夠有效提高秀麗隱桿線蟲的熱應(yīng)激能力，其效果與延長秀麗隱桿線蟲的壽命密切相關(guān)。

3 討論

衰老是生物體隨著年齡增長在功能、形態(tài)等方面出現(xiàn)不可逆的漸進(jìn)性退化，是生物體內(nèi)自發(fā)的必然過程[18]。它與老年病的發(fā)生密切相關(guān)。延緩衰老可減少動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等老年病的發(fā)生[19]。一些名貴中藥材，例如人參[20]、靈芝[21]、石斛[2]等，都具有一定的延緩衰老作用，但對(duì)其效價(jià)成分和作用機(jī)制尚不清楚，限制了這些藥材的開發(fā)利用。

鐵皮石斛、細(xì)莖石斛和鼓槌石斛含有豐富的植物多糖且表現(xiàn)出良好的離體抗氧化活性。本研究結(jié)果表明，從這3種石斛中提取得到的粗多糖均能在不影響秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵量的前提下延長其平均壽命和最長壽命。

石斛多糖一般由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等單糖組成2～5個(gè)多糖亞組分復(fù)合而成，用含有石斛多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，線蟲的頭部擺動(dòng)頻率、身體彎曲頻率以及熱應(yīng)激條件下的存活率均隨著多糖濃度的升高而明顯增加，與延長線蟲的壽命有著密切的正相關(guān)關(guān)系，因而提高線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力和熱應(yīng)激能力可能是延緩其衰老的重要作用機(jī)理。但是，關(guān)于生物體衰老目前有自由基學(xué)說、DNA損傷修復(fù)學(xué)說、端粒和端粒酶學(xué)說、細(xì)胞凋亡學(xué)說等多種理論[22-23]，其各自的調(diào)控機(jī)制也錯(cuò)綜復(fù)雜，因而石斛多糖延緩衰老的作用機(jī)制仍有待繼續(xù)深入研究。