基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的慈丹膠囊抗肝癌作用機(jī)制探討

辛 寶，解方園，姚 晨，張 菁，黃婷婷，黃玉鳳

海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）第三附屬醫(yī)院藥材科，上海 200438

慈丹膠囊由莪術(shù)、牛黃、黃芪、山慈菇、蜂房、丹參、馬錢子、鴉膽子、僵蠶、當(dāng)歸、冰片等中藥組成，具有消腫止痛、補(bǔ)中益氣、散結(jié)化瘀等功效［1］，臨床常用于原發(fā)性肝癌的輔助治療，適用于原發(fā)性肝癌瘀毒蘊(yùn)結(jié)證，聯(lián)合介入化療可提高病灶緩解率。研究證實，慈丹膠囊可使原發(fā)性肝癌患者癥狀改善、免疫力提高、生存期延長［2］。慈丹膠囊所含中藥種類繁多，化學(xué)成分復(fù)雜，目前其抗肝癌的有效成分及相應(yīng)的作用機(jī)制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是研究多靶點干預(yù)疾病網(wǎng)絡(luò)以期達(dá)到理想藥效的理論，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法特別適合復(fù)雜生物系統(tǒng)的相互作用研究，為中藥作用機(jī)制提供了一個全新的視角和解決方案［3］。本研究通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）及相關(guān)文獻(xiàn)收集慈丹膠囊活性成分，并在此基礎(chǔ)上利用藥物靶點分析平臺（Search Tool for Interactions of Chemicals，STITCH）預(yù)測慈丹膠囊可能的作用靶點，采用Cytoscape 軟件構(gòu)建慈丹膠囊抗肝癌作用的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)，對這些靶點進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，利用注視、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（Database for Annovation, Visualization, and Integrated Discovery；DAVID）進(jìn)行基因功能和信號通路分析，探討慈丹膠囊抗肝癌作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 慈丹膠囊中活性成分的篩選通過檢索TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及相關(guān)文獻(xiàn)，分別收集慈丹膠囊中莪術(shù)、牛黃、黃芪、山慈菇、蜂房、冰片、丹參、 馬錢子、鴉膽子、僵蠶、當(dāng)歸的主要化學(xué)成分，建立慈丹膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。在此基礎(chǔ)上篩選慈丹膠囊中有效的活性成分，即口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）＞0.18［4］且相關(guān)文獻(xiàn)中報道化合物含量及相關(guān)生物功能的化學(xué)成分。

1.2 活性成分潛在作用靶點的預(yù)測通過STITCH（http://stitch.embl.de）進(jìn)行分析，將活性成分輸入，選擇人類物種進(jìn)行搜索。將搜索得到的靶點結(jié)果以TSV 格式進(jìn)行保存，篩選其中結(jié)合得分＞0.7 的靶點。通過與GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)系統(tǒng)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM；https://omim.org/）中肝細(xì)胞癌有關(guān)的基因進(jìn)行比對，獲得與肝細(xì)胞癌相關(guān)的靶點。

1.3 慈丹膠囊活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建根據(jù)慈丹膠囊中主要有效成分預(yù)測與肝細(xì)胞癌相關(guān)的靶點，建立活性成分與靶點之間的相互對應(yīng)關(guān)系。將活性成分和作用靶點作為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點，以兩者之間的相互作用作為網(wǎng)絡(luò)中的連接，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建慈丹膠囊活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將慈丹膠囊與肝細(xì)胞癌相關(guān)的靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（http://string-bd.org），獲取蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，將結(jié)果保存成TSV格式，保留文件中的節(jié)點1、節(jié)點2 和結(jié)合得分信息并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件，繪制相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析，保存結(jié)果。設(shè)置節(jié)點的大小和顏色反映節(jié)點度值的大小、邊的粗細(xì)反映結(jié)合得分的大小，獲得慈丹膠囊作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因功能和信號通路分析將慈丹膠囊與肝細(xì)胞癌相關(guān)的靶點導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov），選擇標(biāo)識符為標(biāo)準(zhǔn)的基因名稱，列表類型設(shè)置為基因列表，限定物種為人，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。使用Cytoscape3.8.2 軟件對慈丹膠囊中活性成分作用靶點進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 慈丹膠囊中活性成分的篩選通過TCMSP 從丹參、當(dāng)歸、黃芪、莪術(shù)、鴉膽子、馬錢子、冰片、牛黃、山慈菇中分別收集到202、125、87、81、67、62、31、19、18 個主要的化學(xué)成分。以O(shè)B＞30%、DL＞0.18 及相關(guān)文獻(xiàn)報道作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到活性成分24 個，其中丹參7 個（黃芩苷、谷甾醇、隱丹參酮、異歐前胡素、木犀草素、丹參新酮、丹參酮ⅡA）、黃芪6 個（樺木酸、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、異鼠李素、山柰酚、槲皮素）、鴉膽子3 個（谷甾醇、鴉膽子苦醇、木犀草素）、當(dāng)歸2 個（豆甾醇、谷甾醇）、牛黃2 個（膽固醇、脫氧膽酸）、山慈菇2 個（豆甾醇、谷甾醇）、馬錢子1 個（豆甾醇）、冰片1 個（積雪草酸），刪除重復(fù)者后共獲得18 個活性成分。

2.2 慈丹膠囊潛在靶點的預(yù)測通過STITCH 篩選共得到100 個蛋白靶點，通過與GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 中肝細(xì)胞癌有關(guān)的基因進(jìn)行比對，共篩選出97 個可能與肝細(xì)胞癌相關(guān)的作用靶點。其中與肝細(xì)胞癌相關(guān)性得分＞20 分并且經(jīng)文獻(xiàn)證實的靶點有20 個，分別為表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、caspase（CASP）8、AKT1、G1/S 特異性細(xì)胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）、 血管內(nèi)皮生長因子A （vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、Myc 原癌基因蛋白（Myc proto-oncogene protein，MYC）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9、含有桿狀病毒 IAP 重復(fù)序列的蛋白5（baculoviral IAP repeatcontaining protein 5，BIRC5）、MMP2、NFE2樣 BZIP 轉(zhuǎn)錄因子 2（NFE2 like BZIP transcription factor 2，NFE2L2）、CASP3、TNF、Jun 原癌基因AP-1 轉(zhuǎn) 錄 因 子 亞 基（Jun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit；JUN）、CASP9、細(xì)胞色素 P450（cytochrome P450，CYP）1A1、ATP 結(jié)合盒亞家族B 成員11（ATP binding cassette subfamily B member 11，ABCB11）、MAPK8、MAPK3、IL-10。

2.3 慈丹膠囊活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)分析由圖1可知木犀草素、異鼠李素、樺木酸可共同作用于靶點AKT1，脫氧膽酸、谷甾醇可共同作用于靶點ABCB11，芒柄花黃素、異鼠李素、槲皮素可共同作用于靶點CYP1A1，黃芩苷、谷甾醇、木犀草素、樺木酸、芒柄花黃素可共同作用于CASP3，毛蕊異黃酮、芒柄花黃素可共同作用于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1（uridine diphosphateglucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1），木犀草素、異鼠李素可共同作用于MAPK8，而谷甾醇可同時作用于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（sterol regulatory element binding transcription factor，SREBF）2、三磷酸腺苷結(jié)合盒亞家族G（ATPbinding cassette G-subfamily，ABCG）8、ABCG5、載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）、24-脫氫膽固醇還原酶（24-dehydrocholesterol reductase，DHCR24）、CASP3、SREBF1、ABCB11、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM1）、 膽 固 醇7α-羥 化 酶（cholesterol 7αhydroxylase，CYP7A）。同一靶點可對應(yīng)不同的活性成分，不同靶點也可對應(yīng)相同的活性成分，表明慈丹膠囊具有多成分、多靶點的作用特點。

圖1 慈丹膠囊的主要活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Component-target network of Cidan capsule

2.4 慈丹膠囊主要活性成分潛在作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)分析將慈丹膠囊主要活性成分的肝細(xì)胞癌相關(guān)靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)共涉及88 個節(jié)點和467 條邊（圖2）。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，度值排名靠前的有JUN、STAT3、TNF、AKT1、CASP3、MAPK3、EGFR、MYC、CCND1、細(xì)胞癌基因FOS、Toll樣受體（Toll-like receptor 4，TLR4）、VEGFA、MMP9、MAPK8、 轉(zhuǎn) 錄 因 子SP1、CYP1A1、CYP1A2、IL-10、CYP2B6、 載 脂 蛋 白B-100（apolipoprotein B-100，APOB），度 值 分 別 為33、33、30、28、25、25、22、22、18、18、18、17、17、15、15、15、15、14、14、13，提示這些靶點在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，很可能是慈丹膠囊治療肝癌的關(guān)鍵靶點。

圖2 慈丹膠囊主要活性成分潛在作用靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Protein-protein interaction network of potential targets of main active components of Cidan capsule

2.5 慈丹膠囊主要活性成分肝細(xì)胞癌相關(guān)靶點基因功能和信號通路分析GO 富集分析結(jié)果顯示，生物學(xué)過程中靶點數(shù)目排名靠前的依次有細(xì)胞過程、生物調(diào)控、代謝過程、對化學(xué)刺激的反應(yīng)、大分子代謝過程的調(diào)控、對應(yīng)激的反應(yīng)、基因表達(dá)調(diào)控、小分子代謝過程、大分子生物合成過程的調(diào)控、信號通路、信號傳輸、脂質(zhì)代謝過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氮化合物代謝過程的正向調(diào)控等，細(xì)胞組分中靶點數(shù)目排名靠前的依次是細(xì)胞內(nèi)部分、細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)膜界類細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器部分、膜、核、細(xì)胞器腔、膜封閉腔、細(xì)胞核部分、細(xì)胞器膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、膜部分、不溶性組分、內(nèi)膜系統(tǒng)等，分子功能中靶點數(shù)目排名靠前的依次是蛋白結(jié)合、催化活性、蛋白質(zhì)二聚化活性、酶結(jié)合、同源蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、核苷酸結(jié)合、過度金屬離子結(jié)合、DNA 結(jié)合、腺嘌呤核苷結(jié)合、嘌呤核苷結(jié)合、核苷結(jié)合、嘌呤核苷酸結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚化活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性等。

KEGG 通路分析結(jié)果顯示，靶點數(shù)目排名靠前的是TNF、PI3K-AKT、MAPK 等信號通路（圖3）。

圖3 慈丹膠囊主要活性成分潛在作用靶點KEGG 通路富集分析結(jié)果Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of main active components of Cidan capsule

3 討 論

本研究通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫及相關(guān)參考文獻(xiàn)共篩選出慈丹膠囊中18 種主要的活性成分。隱丹參酮是丹參中的二萜類成分，它可激活CASP 級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡［5］。黃芪可通過調(diào)控肝纖維化大鼠肝臟中MAPK 信號通路上下游相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制纖維化因子的表達(dá)，從而抑制肝纖維化［6］。以毛蕊異黃酮和芒柄花黃素為主的黃芪提取物可通過PI3K-AKT 信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖［7］。鴉膽子提取物可通過抑制miRNA-95的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［8］。當(dāng)歸補(bǔ)血湯加味能明顯改善肝纖維化患者的肝功能、抑制肝膠原纖維合成，從而阻止肝纖維化發(fā)展至肝硬化［9］。牛黃中的熊去氧膽酸能促進(jìn)正常大鼠膽汁中膽紅素、總膽汁酸的分泌［10］，降低膽汁中膽固醇的含量，并降低血清中膽紅素、總膽汁酸、膽固醇水平［11］，有利于膽結(jié)石患者的膽固醇結(jié)石逐漸溶解。山慈菇含藥血清能明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)凋亡，抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［12］。馬錢子堿對結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 活性有較強(qiáng)的抑制作用［13］。

本研究結(jié)果表明慈丹膠囊活性成分可作用于100 個蛋白靶點，其中97 個作用靶點可能與肝細(xì)胞癌相關(guān)，活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)顯示慈丹膠囊具有多成分、多靶點的抗肝癌作用特點。PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示慈丹膠囊靶蛋白間存在著相互作用，是復(fù)雜交互的網(wǎng)絡(luò)，并不是單獨起作用。靶點的GO 分析結(jié)果表明，慈丹膠囊的抗肝癌作用涉及細(xì)胞過程、生物調(diào)控、代謝過程、對化學(xué)刺激的反應(yīng)等生物學(xué)過程，細(xì)胞內(nèi)部分、細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)膜界類細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組分，以及蛋白質(zhì)結(jié)合、催化活性、蛋白質(zhì)二聚化活性、酶結(jié)合等分子功能，是一個復(fù)雜的過程。KEGG 通路分析分析結(jié)果顯示，慈丹膠囊抗肝癌的靶點主要涉及TNF、PI3K-AKT、MAPK 等信號通路。

慈丹膠囊活性成分與肝細(xì)胞癌相關(guān)的靶點中，PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果度值排名前20、與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性得分＞20 分并且有文獻(xiàn)證實條件的基因共有14 個， 分 別 為JUN、STAT3、TNF、AKT1、CASP3、MAPK3、EGFR、MYC、CCND1、VEGFA、MMP9、MAPK8、CYP1A1、IL-10，慈丹膠囊可能主要通過作用于以上靶點實現(xiàn)其抗肝癌作用。CASP3 在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用。匹伐他汀可依賴于人肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的CASP3 通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［14］。EGFR 是一種細(xì)胞表面蛋白，它可與表皮生長因子結(jié)合誘導(dǎo)受體二聚化和酪氨酸自磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。EGFR的擴(kuò)增和突變已被證明是許多類型癌癥的驅(qū)動因素。在肝癌患者中EGFR 與腫瘤的大小和組織分化相關(guān)，是肝癌預(yù)后的危險因素［15］。CCND1 屬于高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族。細(xì)胞增殖的調(diào)控事件主要發(fā)生在細(xì)胞周期的G1期，G1期細(xì)胞周期蛋白的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)。有研究者分析了CCND1 異常表達(dá)在肝細(xì)胞癌中的作用，發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌后期CCND1 表達(dá)下調(diào)［16］。MYC 是一種多功能的核磷蛋白，在細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。有研究檢測肝細(xì)胞癌和正常肝細(xì)胞中的p21ras、c-MYC 和p53，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)參與了人類肝癌的發(fā)生［17］。VEGFA 是血小板源性生長因子/血管內(nèi)皮生長因子家族的成員。血管生成對于實體瘤的發(fā)展和進(jìn)展至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA 是參與肝細(xì)胞癌血管生成的重要因素之一，甚至可能參與了肝細(xì)胞癌本身的發(fā)生和進(jìn)展［18］。MMP2 與MMP9 是MMP家族的成員，該家族成員參與正常生理及疾病過程中細(xì)胞外基質(zhì)的分解。研究發(fā)現(xiàn)，MMP1和MMP2過表達(dá)與腫瘤去分化相關(guān)，表明MMP 與肝細(xì)胞癌的侵襲密切相關(guān)［19］。CYP 家族成員可催化涉及藥物代謝及膽固醇、類固醇和其他脂質(zhì)合成的許多反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌中 CYP1A1 蛋白表達(dá)下調(diào)［20］。STAT 能與DNA 結(jié)合，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡，研究發(fā)現(xiàn)STAT 的過度表達(dá)可能是肝細(xì)胞癌的一個重要特征［21］。JUN 是一種與病毒蛋白高度相似的蛋白質(zhì)，可直接與特定的靶DNA 序列相互作用以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌腫瘤組織中c-Jun、JunD 和 AP-1 的表達(dá)比鄰近非腫瘤組織升高［22］。IL-10 是一種細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中具有多效性。研究表明，IL-1、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22、IL-35 和 IL-37 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路參與多種肝臟疾病的進(jìn)展［23］。

慈丹膠囊篩選得到的蛋白靶點富集的通路中，PI3K-AKT 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、胰島素信號、血管生成和腫瘤形成中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)AKT1 的減少可誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡［24］，還發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT 信號通路在阿帕替尼發(fā)揮放射增敏治療肝細(xì)胞癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用［25］。TNF 信號通路參與多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡，以及脂質(zhì)代謝與凝血過程。研究顯示TNF 的遺傳變異與HBV 的清除有關(guān)［26］。lncRNA SPRY4-IT1 可通過介導(dǎo)TNF 信號通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和遷移［27］。MAPK 信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周期進(jìn)程等。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK3 活性在P-糖蛋白介導(dǎo)的多重耐藥肝癌細(xì)胞中下調(diào)，同時MAPK3 可能是規(guī)避多重耐藥肝癌細(xì)胞的潛在藥物靶點［28］。Linc00601 通過激活MAPK 信號通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)展［29］。慈丹膠囊活性成分可能通過作用于以上靶點及信號通路，實現(xiàn)其抗肝癌作用。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示慈丹膠囊的18種活性成分作用于97 個與肝細(xì)胞癌相關(guān)的蛋白靶點，其中與肝細(xì)胞癌關(guān)系密切的蛋白靶點有14 個，慈丹膠囊可能通過這些靶點的相互作用及TNF、PI3K-AKT、MAPK 等信號通路改善肝癌患者的癥狀，實現(xiàn)其抗肝癌作用。慈丹膠囊對肝癌的作用機(jī)制涉及多個生物學(xué)過程、分子和通路，體現(xiàn)了慈丹膠囊多成分、多靶點、多途徑的作用特點。