成肌分化過程中相關(guān)因子的研究進(jìn)展*

張 棟,王 欣,史東林 綜述,熊 雷 審校

(1.清華大學(xué)體育部，北京 100084；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院足踝外科，河北 石家莊 050051；3.河北體育學(xué)院,河北 石家莊 050041；4.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401120)

運(yùn)動性損傷多見于大強(qiáng)度和不習(xí)慣的劇烈離心運(yùn)動后，但并不是運(yùn)動時或運(yùn)動后即刻發(fā)生的，常表現(xiàn)為遲發(fā)性肌肉酸痛，目前認(rèn)為肌肉微撕裂是造成遲發(fā)性肌肉酸痛的原因[1-2]。運(yùn)動性損傷后肌肉修復(fù)相關(guān)的研究已經(jīng)向肌肉組織的超微結(jié)構(gòu)、分子機(jī)制和基因水平拓展[3]。肌肉修復(fù)的治療方法主要有營養(yǎng)療法、運(yùn)動療法及藥物療法等，但這些方法的治療效果有限。目前，研究提示基因靶向治療可能是肌肉修復(fù)的有效治療方法，通過基因靶向治療提高骨骼肌的再生與修復(fù)能力。

1 肌肉再生與修復(fù)機(jī)制

當(dāng)骨骼肌損傷后，靜息的肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活，重新進(jìn)入細(xì)胞周期，繼而大量增殖、分化、成熟并融合形成新的肌纖維[4]。這個過程受到多種因子調(diào)節(jié)，其中包括成肌增強(qiáng)子、成肌調(diào)控子、配對盒轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)節(jié)。

2 成肌因子在成肌分化的作用

2.1人類肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(MEF2)基因在成肌分化過程中的作用 MEF2調(diào)控肌細(xì)胞增殖、分化、生存、凋亡等一系列生物學(xué)過程[5]。MEF2家族由MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D 4種蛋白質(zhì)組成[6]。MEF2A、MEF2B、MEF2D存在于人體內(nèi)各個部位，MEF2C存在于肌肉、腦、脾臟等組織[7]。MEF2蛋白質(zhì)在這些器官中發(fā)揮生物學(xué)功能依靠其本身的結(jié)構(gòu)域，MEF2蛋白質(zhì)由3個結(jié)構(gòu)域組成：N端 MADS box、Mef2 domian、C端反式激活域[8]。MADS結(jié)構(gòu)域和Mef2結(jié)構(gòu)域分別與DNA結(jié)合后形成MEF2-DNA二聚體，激活成肌因子啟動子調(diào)控成肌分化過程[9]。以下對4種MEF2亞基對成肌分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用介紹。

YUAN 等[10]在C2C12細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，MEF2A與HDAC5蛋白質(zhì)協(xié)同作用于Cpt1b啟動子共同調(diào)節(jié)Cpt1b mRNA水平表達(dá)，促進(jìn)C2C12細(xì)胞成肌分化。 SUN 等[11]為研究MEF2B對成肌分化的過程，選取了孵育13的鴨蛋，在鴨胚中提取的腿部成肌細(xì)胞，通過異位表達(dá)表達(dá)Akirin1，導(dǎo)致MRF4和MEF2B表達(dá)增加，從而證明MEF2B對成肌分化過程的促進(jìn)作用。

MEF2B蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與其他3種亞型不同，在肌肉組織中涉及相關(guān)基因的報道很少[12]。NELSA 等[13]為研究MEF2C基因在哺乳動物成肌過程中的作用，在小鼠胚胎期將MEF2C基因敲除讓其發(fā)育，發(fā)現(xiàn)MEF2C基因敲除小鼠肌肉組織的肌纖維排列紊亂，但對小鼠成肌分化進(jìn)程影響不大。 SUI 等[14]研究發(fā)現(xiàn)在C2C12細(xì)胞中，長鏈非編碼RNA Lrm與MEF2D有著密切關(guān)系，通過過表達(dá)長鏈非編碼RNA Lrm導(dǎo)致MEF2D表達(dá)增加，促進(jìn)成肌分化進(jìn)程。

對于MEF2D相關(guān)研究進(jìn)展中，YANG 等[15]在研究必需氨基酸對豬生長的影響中發(fā)現(xiàn)，喂養(yǎng)必需氨基酸的實驗組較對照組中的蛋氨酸、半胱氨酸和?；撬釢舛绕停拾彼岷徒M氨酸水平均偏高，同時MEF2D表達(dá)量增加，且實驗豬生長狀況較對照組好。OGAWA等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在成肌刺激因子作用下MEF2D DNA結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域糖基化修飾降低。敲低糖基化的MEF2D，通過招募Myogenin啟動子啟動成肌調(diào)控過程。

雖然MEF2基因調(diào)控著成肌分化過程，尋找其直接調(diào)控底物是研究其分子機(jī)制的關(guān)鍵。MEF2蛋白質(zhì)底物氨基酸序列相似程度高，為尋找其直接調(diào)控底物提供了有效的依據(jù)[16]，ESTRELLA等[13]發(fā)現(xiàn)4個MEF2的底物蛋白質(zhì)，成肌分化抗原(MyoD)蛋白質(zhì)是其中之一。

2.2MyoD基因在成肌分化過程中的作用 WARDLE 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，MyoD是成肌分化過程中的重要調(diào)控因子。MyoD的表達(dá)主要受2個增強(qiáng)子區(qū)域的調(diào)控。這2個增強(qiáng)子區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游24 kb的區(qū)域內(nèi)，調(diào)控胚胎、胎兒和成人中MyoD的表達(dá)。MyoD的基因序列看似簡單，但其調(diào)控機(jī)制卻很復(fù)雜，不同的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物作用于這2個增強(qiáng)子，調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化過程。MyoD上游區(qū)域的一系列表觀遺傳修飾也在發(fā)育和再生過程中激活和抑制MyoD的表達(dá)。

SOLEIMANI等[18]通過染色質(zhì)免疫沉淀測序?qū)yoD全基因組分析表明，MyoD基因中原性順式調(diào)節(jié)元件(CREs)的E-boxs序列調(diào)控成肌分化過程。E-boxs序列是否發(fā)生位置突變直接決定CREs與其他復(fù)合物的結(jié)合能力和遺傳特性。

JUNG等[19]發(fā)現(xiàn)，MyoD在TRIM72通過靶向胰島素受體底物-1抑制成肌分化過程中起到了重要協(xié)同作用。其機(jī)制為MyoD分別與TRIM72啟動子的近端E-box和MEF2位點(diǎn)作用，進(jìn)而定向突變，從而抑制成肌分化。

KHILJI等[20]研究發(fā)現(xiàn)，RXR選擇性激動劑直接調(diào)控MyoD能促進(jìn)成肌細(xì)胞向成熟的肌管分化和融合。LAMARCHE等[21]研究發(fā)現(xiàn)，敲除成肌細(xì)胞中SMAD2基因不影響成肌細(xì)胞分化的效率，但產(chǎn)生的肌管小，分化終末MyoD的表達(dá)減少。

2.3Pax3/Pax7基因在成肌分化過程中的作用 MAYRAN等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成哺乳動物配對結(jié)構(gòu)域(PD)因子家族的9個Pax轉(zhuǎn)錄因子，在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。Pax基因序列中包含了PD結(jié)構(gòu)域和DNA識別區(qū)，該序列是Pax基因發(fā)揮生物學(xué)功能的主要位點(diǎn)。Pax3/Pax7基因?qū)儆赑ax家族成員，他們可以激活大量參與成肌分化調(diào)節(jié)的基因[23]。Pax3在胚胎早期骨骼肌形成中發(fā)揮主要作用，而Pax7在成人出生后生長和肌肉再生中占主導(dǎo)地位[24]。Pax3/Pax7調(diào)節(jié)成肌分化過程有共性也有特性。YANG等[25]在C2C12細(xì)胞中分別過表達(dá)Pax3和Pax7后，研究發(fā)現(xiàn)Pax7而不是Pax3上調(diào)Zac1和GPR39的表達(dá)。KANAYAMA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在肺泡橫紋肌肉瘤中，通過敲除PAX3-FOXO復(fù)合物后抑制成肌分化過程。AI TANOURY等[26]研究發(fā)現(xiàn)成肌干細(xì)胞能參與人肌肉損傷修復(fù)過程。在過表達(dá)Pax7和MYOG的間充質(zhì)干細(xì)胞中，觀察到有成肌干細(xì)胞的功能。

2.4MyoG基因在成肌分化過程中的作用 MyoG蛋白質(zhì)是MyoD蛋白質(zhì)的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶點(diǎn)[27]，MyoD蛋白質(zhì)作用于MyoG蛋白質(zhì)后導(dǎo)致其DNA染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變[28]。

LIU 等[29]發(fā)現(xiàn)，CASZ1基因通過調(diào)控MYOD和MYOG的表達(dá)誘導(dǎo)骨骼肌和橫紋肌肉瘤分化。YOHE等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在橫紋肌肉瘤中，致癌基因RAS通過RAF-MEK-ERK信號通路抑制了成肌分化調(diào)控因子MyoG表達(dá)抑制成肌分化過程。其機(jī)制主要機(jī)制為MyoG序列上的依賴ERK2的RNA聚合酶Ⅱ的啟動子失活。臨床研究發(fā)現(xiàn)曲美替尼這種藥抑制MEK表達(dá)導(dǎo)致MyoG啟動子處ERK2的丟失，抑制MyoG轉(zhuǎn)錄表達(dá)過程。

HUANG等[31]研究發(fā)現(xiàn)在牛成肌細(xì)胞中，過表達(dá)DEC1導(dǎo)致MyoG表達(dá)降低抑制成肌分化過程。TONG等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在牛成肌細(xì)胞中MiR2245-5p通過靶向作用于RAD9A和MyoG的表達(dá)調(diào)控增殖和分化過程。

3 富含亮氨酸重復(fù)序列和跨膜結(jié)構(gòu)域1(Lrtm1)基因研究現(xiàn)狀

3.1Lrtm1蛋白的結(jié)構(gòu) LRTM1是位于人染色體3p14.3的蛋白編碼基因[33-34]。Lrtm1屬于細(xì)胞外LRR富集超家族[35]。其由一個信號肽，LRR氨基末端，6個LRRs，一個LRR羧基末端，一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個含有小段酸性殘基的短的細(xì)胞質(zhì)尾部組成[36]。

Lrtm1蛋白質(zhì)的LRR結(jié)構(gòu)域是富含亮氨酸的重復(fù)序列，是存在于許多具有不同功能的蛋白質(zhì)中的20～29個殘基的序列基序。其主要功能是為形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供多功能的結(jié)構(gòu)框架。Lrtm1具有這個結(jié)構(gòu)域，表明Lrtm1蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能可能需要借助其他蛋白質(zhì)的相互作用。Lrtm1蛋白質(zhì)還包含一個跨膜結(jié)構(gòu)域，因此認(rèn)為Lrtm1蛋白質(zhì)定位在膜上[37]。

3.2Lrtm1蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能 NABESHIMA等[38]報道在對先天性膈肌發(fā)育缺陷的研究中發(fā)現(xiàn)，Lrtm1在膈肌發(fā)育障礙的基因敲除小鼠中的表達(dá)顯著下降，提示Lrtm1可能參與了膈肌形成的調(diào)控。LI等[39]報道Lrtm1抑制FGFR1信號通路中ERK基因表達(dá)，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。

骨骼肌之所以具有很強(qiáng)的再生能力，是因為其含有少量的骨骼肌干細(xì)胞，即肌衛(wèi)星細(xì)胞[40]。生理狀態(tài)下肌衛(wèi)星細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，其膜電位較K+生理平衡電位低，該情況下能激活選擇性陽離子通道如瞬時受體po-(TRPC)[41]，該受體通道定位于骨骼肌纖維漿膜和基底膜之間[33]。激活的瞬時受體po-(TRPC)讓大量K+離子內(nèi)流，進(jìn)一步誘發(fā)一系列生物學(xué)過程。而成肌細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)向骨骼肌的定向分化過程受一系列成肌轉(zhuǎn)錄因子的層級調(diào)控，包括Pax7、Myod、Myf5、Mrf4及Myogenin等[33]。

3.3推測Lrtm1基因可能參與的其他信號通路 Lrtm1是跨膜蛋白質(zhì)[36]，LI等[39]報道Lrtm1通過FGFR1信號通路促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，是否存在其他信號通路。調(diào)研類似的跨膜蛋白參與調(diào)控骨骼肌形成的文獻(xiàn)。TONG等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在牛成肌細(xì)胞中MiR2245-5p通過靶向作用于RAD9A和MyoG的表達(dá)調(diào)控增殖和分化過程。他們在牛成肌細(xì)胞增殖分化不同階段采用stem-loop RT-PCR技術(shù)檢測MiR2425-5p的表達(dá)水平。細(xì)胞增殖實驗研究中發(fā)現(xiàn)顯示，MiR2245-5p促進(jìn)RAD9A表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞增殖過程。免疫熒光技術(shù)中發(fā)現(xiàn)MiR2245-5p抑制MyoG表達(dá)，進(jìn)而抑制成肌分化過程。

BELLOMO等[42]研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅰ型受體是一種經(jīng)典的G-蛋白偶聯(lián)受體，信號通過G-蛋白底物激活了MAPKs通路。為證明血管緊張素Ⅱ型受體影響成肌分化過程。首先用血管緊張素Ⅱ型受體激活劑和受體抑制劑來觀察對肌肉再生的影響。通過SiRNA敲低血管緊張素Ⅱ型受體表達(dá)來觀察對肌肉再生的影響。HARON[43]發(fā)現(xiàn)，血管緊張素II型受體是通過ERK1/2信號通路來調(diào)控成肌細(xì)胞的分化過程。

YOSHIDA等[44]研究降鈣素通過激活了PI3K/Akt，P38 MAPK信號通路促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖，通過激活GPRC6A-ERK1/2促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化。對于Lrtm1基因的對骨骼肌損傷與修復(fù)的機(jī)制研究，首先從幾個常規(guī)的信號通路去考慮如增殖的P38/MAPK信號通路及ERK1/2信號通路等。GPRC6A是通過左旋氨基酸激活的G蛋白偶聯(lián)受體[45]。其與降鈣素結(jié)合形成復(fù)合物后啟動成肌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[44]。

4 結(jié)語與展望

運(yùn)動性肌肉損傷嚴(yán)重影響普通人群的生活和工作及專業(yè)運(yùn)動人群的訓(xùn)練和比賽[46-47]。如何讓損傷的肌肉修復(fù)，從骨骼肌再生修復(fù)的分子機(jī)制探索，在分子層面來研究Lrtm1基因?qū)趋兰≡偕迯?fù)的影響，從而尋找一種基因替代治療的方法。

本文通過引用相關(guān)文獻(xiàn)分析了解Lrtm1基因相關(guān)信息，在定位Lrtm1蛋白質(zhì)位置時，可以通過免疫熒光這個實驗技術(shù)方法來觀察Lrtm1蛋白質(zhì)的定位。在確定Lrtm1蛋白質(zhì)分子量時可以通過Lrtm1蛋白質(zhì)的信號肽來分析。本文綜述成肌轉(zhuǎn)錄因子和成肌增強(qiáng)子對成肌分化的作用，為后續(xù)證明Lrtm1基因?qū)趋兰≡偕迯?fù)影響打下基礎(chǔ)。最后根據(jù)Lrtm1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，推測Lrtm1基因可能參與的信號通路。發(fā)展基于Lrtm1基因及其相關(guān)分子為靶標(biāo)的骨骼肌損傷的基因治療提供了理論基礎(chǔ)。