宏基因二代測序在兒童肺炎病原體檢測中的應用

邢芮寧 綜述，李渠北 審校

(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院，重慶 400014)

肺炎造成兒童死亡的人數(shù)超過任何其他傳染病。根據(jù)2020年聯(lián)合國兒童基金會數(shù)據(jù)顯示，肺炎是5歲以下兒童首要死因，平均每39秒就有1例兒童死于肺炎[1]。其病原體快速且準確地鑒定是兒童肺炎早期明確診斷和合理用藥的基礎。目前，臨床上被廣泛使用的病原學檢測方法仍然是基于19世紀80年代由巴斯德開創(chuàng)的基于培養(yǎng)的技術[2]，在檢測速度及靈敏度等方面具有較大局限性。近年來，隨著宏基因二代測序(mNGS)技術的出現(xiàn)，為明確肺炎病原體提供了一種新的檢測方法。該技術具有通量高、敏感性高的優(yōu)勢，可以同時檢測幾百萬到上億條核酸序列，提高了全基因組的測序速度，并降低了單個堿基測序的成本[3-5]。

1 兒童肺炎病原學檢測現(xiàn)狀

肺炎作為臨床上常見的兒童呼吸道感染性疾病,病原體包括細菌、真菌、病毒、肺炎支原體、衣原體等，種類繁多、構成復雜。肺炎發(fā)病率高，致死率可達30%～50%，對兒童生命及健康構成嚴重威脅[6]，早期識別病原體對指導肺炎的診療及改善預后具有很大幫助。

傳統(tǒng)病原學檢測方法包括病原分離培養(yǎng)、血清學抗體檢測、抗原檢測、聚合酶鏈反應(PCR)技術等。病原分離培養(yǎng)法作為目前臨床診斷的“金標準”，在臨床上最為常用。該檢測技術可以檢測多種病原體，并且根據(jù)藥敏試驗結果對臨床治療給予相應指導，但培養(yǎng)周期長，且操作過程復雜。此外，長期的抗生素使用會降低培養(yǎng)敏感性，即使檢測結果為陰性，也不能完全排除感染[7]。血清學抗體檢測法通過免疫學方法明確感染后患兒免疫狀態(tài)，無須經(jīng)過培養(yǎng)，對于傳統(tǒng)培養(yǎng)基下不易生長的病原體具有一定檢測優(yōu)勢，但對于免疫系統(tǒng)發(fā)育不全及免疫力低下的患兒，容易產(chǎn)生假陰性結果[8]?？乖瓩z測方法主要針對血清型較少、細胞培養(yǎng)不能增殖的呼吸道病原體，其檢測標本范圍廣，無論是痰液、支氣管肺泡灌洗液(BALF)，還是胸腔腹水均可作為標本，其特異性高、操作簡便、反應時間短，對于病程中使用過抗生素治療的患兒仍可以檢測出病原體[9]，已逐漸成為兒童肺炎病原體檢測的主流方法[10-11]，但與其他檢測方法相比，其敏感性較低。PCR技術是一種體外介導DNA序列酶促反應合成的分子生物學技術，具有操作簡單、特異性及敏感性高等特點，且檢測結果幾乎不受抗生素影響，對混合感染的病原學診斷尤其適用，近年來臨床應用價值逐漸提升。但PCR技術對操作規(guī)范和質量控制要求嚴格，且容易產(chǎn)生假陽性結果，與病源分離培養(yǎng)相比，不能反映藥敏試驗結果及耐藥性[12]。目前，臨床上各種病原體檢測方法應用廣泛，但仍有15%～25%的肺炎患者無法明確病原學診斷。由此可見，傳統(tǒng)病原體檢測方法已很難滿足目前兒童肺炎診治的需求。

2 宏基因二代測序(mNGS)在兒童肺炎病原體檢測方面的應用進展

2.1mNGS概述 NGS是在一代Sanger測序技術基礎上發(fā)展起來的一項新型測序技術。1998年RIZZO等[13]首先提出這一概念，2004年美國國立人類基因組研究所正式發(fā)起該項目的研究；2005年焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)首次被報道[14]；2014 年第1篇使用 NGS 檢測腦脊液標本并明確鉤端螺旋體感染病例的國外雜志報道[15]，至此，NGS開始廣泛應用于臨床研究。

NGS技術包括對樣本中所有的遺傳物質進行測序的mNGS和利用基因組中特定的標記基因(例如16S rRNA)僅對樣本中的微生物進行種系發(fā)育分析的宏分類組學。mNGS可以直接從樣本中提取其中所有的核酸序列，并進行大規(guī)模測序，無須經(jīng)過培養(yǎng)[16]。因此可以邊合成邊測序，臨床操作步驟包括：臨床標本的采集與運輸；標本核酸提取、DNA 和(或)RNA 富集；DNA文庫制備；高通量測序和生物信息學分析等步驟。

2.2mNGS的優(yōu)勢 同一代Sanger測序技術相比，mNGS通量更高，即每次測序反應所能讀取的DNA序列的數(shù)量更多；mNGS的平均讀取長度更短，使檢測每個堿基的成本更低，以常見平臺為例(BGI、Illumina、Roche、SoLiD)，mNGS平均讀取長度為30～400 bp，而Sanger測序法可讀取的長度范圍是500～1 000 bp[17]，這在一定程度上限制了mNGS可以進行的實驗類型，但在過去5年里使檢測堿基成本較一代測序降低了近10萬倍以上[18]，并由此產(chǎn)生巨大的序列數(shù)據(jù)集[19]。

此外，mNGS對標本選擇不具有偏向性，可檢測的標本包括血液，痰液，肺泡灌洗液，腦脊液，胸、腹水等；所有已知基因組序列的病原體均可被mNGS報告，目前已被納入的病原體包括4 000余種病毒、3 000余種細菌、200 余種真菌和140余種寄生蟲[20]。越來越多的臨床證據(jù)表明mNGS正在臨床被廣泛應用。無論是皮膚感染，還是眼部、泌尿系統(tǒng)、骨關節(jié)的感染，mNGS病原體檢出率均高于傳統(tǒng)病原學檢測[16,21-22]；mNGS對腫瘤標記物可以作出更加準確的臨床診斷，明確致病基因，為臨床治療方案提供有利支持[23-24]。在產(chǎn)前診斷方面，mNGS利用其敏感性高的特點，可以對微量DNA物質進行檢測，對胎兒進行產(chǎn)前無創(chuàng)性染色體疾病篩查[25-26]。此外，與病原培養(yǎng)等方法相比，既往使用抗生素對mNGS結果影響小[27]。mNGS還可以識別罕見病原體及發(fā)現(xiàn)新的病原體，對弓形蟲、隱球菌、風疹病毒、阿米巴原蟲等臨床檢出率低的病原體具有更高的提示性[28-30]，在多重復雜耐藥突變的檢出上也可以提供一定數(shù)據(jù)支持[31-32]。

2.3mNGS在兒童肺炎病原體檢測方面的臨床應用 李學青等[33]回顧性分析了mNGS對重癥肺炎兒童的肺泡灌洗液標本的病原學診斷，結果顯示：34例患兒中有32例檢出病原體(檢出率為94.1%)，經(jīng)抗感染等對癥治療后，33例患兒好轉出院，1例患兒死亡。表明mNGS 在重癥肺炎上可以提高病原檢出率，并對臨床治療起到指導作用。FARNAES等[34]對15例診斷為社區(qū)獲得性肺炎兒童進行了游離血漿的mNGS，結果顯示，mNGS發(fā)現(xiàn)了13例(86%)的病原體，而在僅使用標準培養(yǎng)和PCR方法的兒童中，為47%。表明mNGS與傳統(tǒng)方法比較敏感性更高。而且，在這 15 例兒童中，7 例在mNGS結果回示后調整了抗生素治療方案。說明 mNGS 亦可以提高兒童下呼吸道感染病原菌的檢出率，有利于精準診療的實施。ZINTER 等[35]對 34 例免疫缺陷兒童共41份下呼吸道標本進行mNGS，結果顯示：在傳統(tǒng)方法檢測到病原體的17例樣本中，有14例結果和mNGS結果一致，另外3例mNGS檢出了傳統(tǒng)方法未曾檢測到的病原體。在24例傳統(tǒng)方法未檢測到病原體的樣本中，有11例mNGS檢測出了可能導致感染的病原體，剩下的13例則未能檢測出。表明mNGS 可提高對呼吸道病原體檢測敏感性，ATKINSON等[36]研究也有相似發(fā)現(xiàn)。此外，YUN等[37]研究發(fā)現(xiàn)，mNGS早期病原體檢出率高，有助于指導個體化治療，降低經(jīng)驗用藥所致的耐藥性，降低患兒病死率。

2.4兒童肺炎的mNGS標本選擇 兒童肺炎的mNGS檢測標本通常包括外周血、痰液、BALF、咽拭子等[38]，應盡量在疾病早期采樣本并盡快送檢。專家共識指出，在檢出細菌及真菌方面，BALF標本具有更高的敏感性；而在檢測病毒方面，外周血標本檢出率更高。其中腺病毒BALF和血mNGS同時可以檢出[39]。對于EBV、CMV等不引起肺炎的病原，即使外周血檢測到也不考慮為導致肺炎的病原體。對于單純肺炎患者，經(jīng)支氣管鏡操作采集的BALF標本要優(yōu)于痰和外周血標本；而對于重癥肺炎患者，可采取多種類型樣本(血液、痰液或BALF)、多種方法學病原體培養(yǎng)、細菌/真菌涂片、PCR檢測或mNGS平行送檢，以便相互印證結果，其中優(yōu)先選送BALF標本[40]。

2.5mNGS靈敏度及影響因素 mNGS的靈敏度與測序數(shù)據(jù)量(檢測總序列數(shù))及致病微生物基因組的堿基數(shù)呈正相關，與單位體積標本中人源細胞含量及背景微生物基因數(shù)呈負相關。在測序數(shù)據(jù)量確定的情況下，常見影響mNGS檢測靈敏度因素包括病原體基因組大小、細胞外游離DNA(cfDNA)數(shù)目、細胞壁厚度、人源細胞占比、背景微生物占比等。其中病原體基因組越大，mNGS靈敏度越高，通常寄生蟲病原體最大，真菌次之，細菌和病毒的基因組較?。挥捎趍NGS檢測的是cfDNA，對于一些胞內寄生病原體(如傷寒沙門菌等)檢出率較低[41]；結核分枝桿菌(MTB)等細胞壁較厚的細菌，核酸提取率低，導致檢出靈敏度降低，在眾多病原體中，病毒核酸提取率最高，細菌次之，真菌及MTB核酸提取率相對較低；人源細胞占比及背景微生物占比也是影響靈敏度2個重要因素。就肺炎檢測標本而言，BALF的人源細胞占比少于外周血，痰液的人源細胞占比更高；背景微生物主要包括定植微生物和污染，其不僅影響mNGS檢測結果，還對傳統(tǒng)病原學檢測結果會產(chǎn)生干擾[31,42-44]。

3 mNGS目前存在的問題

3.1結果判讀標準 mNGS雖然可識別臨床樣品中的全部病原體，但由于不同種類的微生物基因組長度不同，不同平臺之間無統(tǒng)一質控標準，目前對于mNGS報告尚無統(tǒng)一的結果判讀標準，而是由臨床醫(yī)生結合癥狀綜合判定[31,43-44]。

3.1.1陽性閾值的界定 多篇專家共識指出，對于檢出的可能致病微生物不能只關注序列數(shù)的多少，需結合該序列在基因組的覆蓋度和特異性進行評判[43,45]。一般序列數(shù)和致病可能性成正比，以及檢出序列數(shù)越高，致病可能性越大，而對于極少存活于環(huán)境中的病毒，即使檢出少量的特異序列(<3條)就可判為陽性[43]。對于MTB、布魯氏桿菌等檢測難度較大的病原體，檢出1條特異序列即可判為陽性[27,44]。

3.1.2致病菌、定植菌和污染菌的區(qū)分 定植微生物廣泛存在于人體及檢測環(huán)境中，這是擁有高敏感性的mNGS檢測過程中無法避免的，往往會將真正導致疾病的病原體掩蓋，因此，當考慮條件致病菌時，應首先分析臨床患兒的基礎疾病、免疫狀態(tài)及標本的來源。對于檢出大量的雜菌序列而沒有主導的微生物時，則首先考慮污染菌，其次考慮為條件致病菌[46]。

3.1.3假陰性結果與假陽性結果分析 對于臨床癥狀符合，且其他傳統(tǒng)檢測方法高度提示的病原體，即使mNGS結果為陰性，也不能排除感染可能，可根據(jù)臨床需要必要時再次行mNGS檢測；而對于mNGS檢測為陽性，而臨床癥狀不支持的檢測結果，需結合其他傳統(tǒng)檢測方法進行評估，并以傳統(tǒng)實驗室檢測結果為首選參考依據(jù)[46]。

3.2對RNA病原體檢出率低 DNA病毒的基因組可以通過直接從樣本中提取進行mNGS檢測，而RNA病毒由于其遺傳物質豐度低，易降解，需先逆轉錄為與其互補的DNA再進行測序[47]。此外，人源RNA同DNA相比的豐度和復雜度更高，更易降解，對樣本運輸和保存要求也更高。以上因素導致mNGS對RNA病毒的檢測率較低。在檢測前對RNA病毒進行富集對提高檢出率有所改善。

3.3檢測周期長 目前，病原微生物mNGS檢測的周期一般是72 h內。與病原培養(yǎng)、血清學檢測和一般細菌/真菌涂片等技術相比，mNGS技術可一次檢測包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲等多種類型的病原體，并且不受分離培養(yǎng)的限制，在核酸序列水平對病原體進行準確分析。但是，與臨床需求相比，尤其是對于急癥患者來說，mNGS在檢測周期時長上仍需進一步改進。

3.4與其他常用實驗室檢查相比費用較高 雖然mNGS的檢測成本同Sanger技術相比大大降低，但與其他傳統(tǒng)實驗室檢測相比仍花費巨大。目前，臨床傳統(tǒng)實驗室檢測的費用在數(shù)十元至百元不等，而一次mNGS檢測需花費上千元。高昂的檢測成本也是限制mNGS在臨床廣泛應用的因素之一[39]。

4 結語與展望

近年來，mNGS作為一種新興的臨床病原體檢測方法，可以檢出臨床標本中所有的病原體，通量高、敏感性高，在罕見、不典型病原體及混合感染的病原體檢出上體現(xiàn)了自己獨特的臨床價值，以上優(yōu)勢已被多篇指南及專家共識認可并推薦臨床使用[48-51]。在兒童肺炎的病原體檢測中，mNGS提高了病原體檢出率，對早期針對治療起到指導作用，對縮短肺炎病程，減少并發(fā)癥具有重大意義。然而，作為一項新技術，mNGS仍存在一些不足之處，如檢測過程尚無統(tǒng)一質控標準；標本處理復雜，一旦發(fā)生污染對檢測結果影響較大；檢測成本相對較高；檢測周期長，對于急危重癥患兒臨床意義較小；對于mNGS檢測結果，需結合臨床癥狀及其他傳統(tǒng)實驗室檢測結果共同分析等。因此，mNGS目前尚不能作為臨床常規(guī)檢測方法。但隨著相關研究不斷進展，mNGS的不足之處將不斷改善，檢測特異度及靈敏度更高，檢測成本更低，在不久的將來有可能取代部分傳統(tǒng)實驗室檢測方法，成為臨床上兒童肺炎診斷的一項常規(guī)檢測。