高效液相色譜法測定乳與乳制品中柚皮苷

宮慧麗，段國霞，劉麗君，陳素敏，謝瑞龍，劉春霞，陳 靜，武倫瑋，劉 旺，唐 爍，李翠枝，呂志勇

（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

柚皮苷是柚皮提取物的活性成分之一[1-2]，又名柚苷、異橙皮苷，全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一種雙氫黃酮類化合物[3-5]，主要存在于蕓香科植物柚、葡萄柚的未成熟或近成熟的干燥外層果皮以及胡柚的外層果皮中[6-8]。同時，柚皮苷是形成柚皮苦味的主要物質(zhì)（占柚皮中苦味物質(zhì)的80%以上）[9-11]。因此，柚皮苷經(jīng)?？勺鳛榭辔秳┗蝻L味改良劑、天然色素應用于食品及藥品的生產(chǎn)[12-13]。柚皮苷的多種生物活性及藥理作用，如抗氧化、抗突變、抗病毒、抗過敏[14-16]、抑菌、改善局部微循環(huán)、降血壓和減少血栓形成[17-19]等，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有廣泛應用[20-21]。因此，柚皮苷越來越倍受關(guān)注。乳與乳制品中添加柚皮苷（藥食同源性化合物）為標志性成分的新產(chǎn)品，不僅能改善其口感，還能增加其功效。目前，液相色譜法測定藥品中柚皮苷的含量[22-24]較為常見，也有高效液相色譜法測定牙膏[25]、柑橘類果實[26]、柚子[27]中柚皮苷的含量，以及超高效液相色譜法測定兒童指畫印泥中柚皮苷和苯甲酸地那銨含量[28]。而乳與乳制品中柚皮苷采用高效液相色譜檢測的方法較少見。因此，本研究建立高效液相色譜法測定乳與乳制品中柚皮苷含量的方法，為乳與乳制品中柚皮苷的檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市場隨機抽取乳粉、液態(tài)乳和酸乳樣品，并在抽取的乳粉樣品中選取一種樣品添加1、2 g/100 g和4 g/100 g含柚皮苷的骨碎補原料（添加含柚皮苷的骨碎補原料樣品制備方法：取100 g乳粉樣品3 份，分別加入1、2、4 g含柚皮苷的骨碎補原料，充分混勻；加標回收實驗中：分別選擇不含柚皮苷的乳粉、液態(tài)乳和酸乳，添加不同質(zhì)量濃度的柚皮苷標準溶液進行實驗）。其中，乳粉樣品6 份、乳粉中添加不同含量的骨碎補原料乳粉3 份、液態(tài)乳樣品5 份、酸乳樣品5 份。

柚皮苷對照品（純度≥95%） 德國Sigma公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純） 成都科隆化學品有限公司；無水乙醇（色譜純） 福晨（天津）化學試劑有限公司；冰乙酸（色譜純） 天津市光復科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測器）、Pro UV超純水機 美國賽默飛世爾公司；AL204分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；MS 3 Basic渦旋振蕩器德國IKA公司；KQ-300DE超聲波振蕩器 昆山超聲儀器有限公司；3K30高速離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

準確稱取固體樣品1.0 g（精確至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，加入2 mL水混勻，再加入甲醇定容至刻度，搖勻。液體樣品稱取2.0 g（精確至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，再加入甲醇定容至刻度，搖勻。超聲處理1 h，取出，冷卻至室溫。轉(zhuǎn)入離心管后以8 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為試樣待測液。

1.3.2 標準溶液制備

柚皮苷標準儲備液（1.0 mg/mL）：準確稱取柚皮苷標準品50 mg（精確至0.1 mg）于50 mL容量瓶中，加入60%甲醇溶液超聲溶解，用60%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，備用。

柚皮苷標準中間液（500 μg/mL）：準確吸取柚皮苷標準儲備液5 mL于10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

柚皮苷標準工作液：分別準確吸取標準中間液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液溶解并定容至刻度，混勻，此標準工作液的質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200、500 μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 儀器工作條件

檢測器：二極管陣列檢測器；色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 mm）；流速1 mL/min；檢測波長284 nm；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；流動相：體積分數(shù)0.1%醋酸水溶液-乙腈（75∶25，V/V）。

試樣中柚皮苷的含量按下式計算。

式中：X為試樣中待測組分含量/（g/100 g）；ρ為由標準曲線得出的試樣液中待測物質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為試樣定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g；10 000為單位換算系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)和圖譜進行處理和繪制，加標回收率采用3水平6平行實驗測定[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

使用添加4 g/100 g含柚皮苷的骨碎補原料乳粉為樣品，優(yōu)化實驗條件。

甲醇、無水乙醇和乙腈均能和水混溶，是沉淀蛋白常用的有機溶劑。因此，選用甲醇、無水乙醇和乙腈3 種提取劑進行實驗。采用甲醇和無水乙醇提取的樣品能得到分離效果良好的色譜峰，而乙腈提取的樣品未能得到分離效果良好的色譜峰。因為柚皮苷溶于甲醇和無水乙醇，所以甲醇和無水乙醇能提取出樣品中的柚皮苷，由于甲醇的極性比無水乙醇極性強，使得甲醇的提取效率高于無水乙醇。而柚皮苷不溶于乙腈，所以乙腈不能提取出樣品中的柚皮苷。

由圖1可知，甲醇提取柚皮苷含量的平均值為0.069 3 g/100 g，無水乙醇提取柚皮苷含量的平均值為0.055 3 g/100 g，甲醇的提取效率比無水乙醇高1.3 倍。因此，選用甲醇作為柚皮苷的提取劑。

圖1 使用甲醇和無水乙醇提取對柚皮苷含量的影響Fig.1 Effects of extraction solvent on naringin content

2.2 加水量的選擇

分別向1.0 g乳粉樣品中加入0、2、5 mL水溶解，用甲醇定容，超聲后離心。不加水的樣品，加入甲醇后，樣品很快形成團塊，且無法散開，導致甲醇不能有效提取團塊內(nèi)部的柚皮苷，使提取效率降低。加入2 mL水溶解使樣品充分被水浸潤，提高了甲醇的提取效率，同時甲醇能降低溶液的電解常數(shù)，從而增強蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導致溶解度降低，另外，甲醇與水的作用能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)析出。當加水量為5 mL時，再加入甲醇，無法達到蛋白質(zhì)沉淀的甲醇濃度，因此，蛋白質(zhì)無法析出，樣品不能進行上機測試。

由圖2可知，不加水時，甲醇提取柚皮苷含量的平均值為0.002 3 g/100 g，樣品的提取效率較低。當加水量為2 mL時，甲醇提取柚皮苷含量的平均值為0.069 3 g/100 g，樣品的提取效率明顯提高，比不加水的提取結(jié)果高30.1 倍。因此加入2 mL水溶解樣品。

圖2 加水量對柚皮苷提取的影響Fig.2 Effect of amount of water used to dissolve sample on naringin extraction

2.3 流速的選擇

改變色譜柱流速分別為1.0、0.8、0.5 mL/min，由圖3可知：色譜柱流速為0.5 mL/min時，色譜峰的出峰時間為9.727 min，色譜峰出現(xiàn)明顯的拖尾和展寬現(xiàn)象；流速為0.8 mL/min時，色譜峰的出峰時間為6.083 min，色譜峰出現(xiàn)拖尾和展寬現(xiàn)象；流速為1.0 mL/min時，色譜峰的出峰時間為4.883 min，出峰時間最短，峰型尖銳，且對稱性較好。故1.0 mL/min為色譜柱的最佳流速。

圖3 流速對柚皮苷色譜峰的影響Fig.3 Effect of flow rate on the naringin chromatographic peak

2.4 檢測器的選擇

通過實驗發(fā)現(xiàn)，柚皮苷在284 nm波長附近有強烈的紫外吸收峰，二極管陣列檢測器和紫外檢測器均能滿足檢測要求。依據(jù)實驗室條件，選擇二極管陣列檢測器進行檢測。

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限

以柚皮苷峰面積為縱坐標，柚皮苷標準工作液質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸，其回歸方程為y=0.195 1x-0.050 2（R2=0.999 9），線性范圍符合要求。由表1可知：乳粉、液態(tài)乳和酸乳樣品中柚皮苷檢出限的信噪比（RS/N）均大于3，符合檢出限要求；乳粉、液態(tài)乳和酸乳樣品中柚皮苷定量限的RS/N均大于10，符合定量限要求。

表1 檢出限和定量限Table Limit of detection and limit of quantification for milk product samples

2.6 精密度實驗

按實驗方法計算乳粉、液態(tài)乳和酸乳6 次檢測結(jié)果的相對標準偏差。由表2可知，對乳粉、液態(tài)乳和酸乳樣品進行重復性實驗，根據(jù)GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[30]的要求，被測組分含量為1%時，相對標準偏差≤2.7%，本研究結(jié)果相對標準偏差分別為1.12%～2.31%、1.25%～1.85%和1.24%～1.66%，均＜2.7%，實驗結(jié)果重復性符合要求。

表2 精密度實驗結(jié)果（n=6）Table 2 Results of precision test (n = 6)

2.7 準確度實驗

按照實驗方法，對乳粉、液態(tài)乳和酸乳進行加標實驗，加標量分別為定量限、2 倍定量限和4 倍定量限。由表3可知，乳粉、液態(tài)乳和酸乳的加標回收率分別為96.2%～103.2%、96.3%～103.7%和99.7%～104.1%，根據(jù)GB/T 27417—2017的要求，被測組分含量＞100 mg/kg，加標回收率為95%～105%，因此本研究結(jié)果準確度符合要求。

表3 準確度實驗結(jié)果（n =6）Table 3 Results of accuracy test (n=6)

2.8 樣品測定結(jié)果

由表4可知，乳粉、液態(tài)乳和酸乳中均未檢出柚皮苷，而添加含柚皮苷的骨碎補原料乳粉中柚皮苷含量分別為0.017 2、0.033 4、0.069 5 g/100 g。

表4 乳粉、液態(tài)乳、酸乳及含柚皮苷的骨碎補原料乳粉測定結(jié)果Table 4 Results of HPLC detection of naringin contents in milk powder, liquid milk, yogurt and drynaria with added naringin

3 結(jié) 論

本方法建立了高效液相色譜法測定乳與乳制品中柚皮苷含量的方法。樣品經(jīng)甲醇提取，在284 nm檢測波長下，流動相為體積分數(shù)0.1%醋酸水溶液-乙腈（75∶25，V/V），C18色譜柱分離，經(jīng)二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。結(jié)果表明：此方法的線性關(guān)系良好，加標回收率分別為96.2%～103.2%、96.3%～103.7%和99.7%～104.1%，符合GB/T 27417—2017加標回收率為95%～105%的要求，相對標準偏差（n=6）為1.12%～2.31%，符合GB/T 27417—2017中被測組分含量為1%時，相對標準偏差≤2.7%的要求；將該方法應用于樣品的測定，其穩(wěn)定性、重復性和準確性良好，可作為乳與乳制品中柚皮苷含量的測定方法。