山姜素對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的保護作用機制

陳穎妹 翟任群 周 菲（海南省人民醫(yī)院，海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院心電圖室，?？?570311）

缺血性心臟病是臨床常見疾病，目前主要治療手段為經(jīng)皮冠狀動脈介入治療等，但在血管治療過程中可能引起心肌缺血再灌注損傷。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激加劇可引起細胞凋亡進而加重心肌組織損傷，因此尋找減輕心肌缺血再灌注損傷的藥物有助于提高再灌注治療效果［1］。研究報道，中藥含有多種有效成分且具有抗炎、抗氧化等作用，可用于多種心血管疾病臨床治療［2-3］。山姜素是從傳統(tǒng)中藥中提取的物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化、抗癌等作用，并可抑制炎癥相關(guān)性疾病發(fā)生，研究表明，山姜素可抑制角叉菜誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)［4］。但山姜素對心肌缺血再灌注損傷的治療效果鮮有報道。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是新型非編碼RNA分子，可充當(dāng)miRNA海綿分子調(diào)控細胞增殖、分化等生物學(xué)過程，研究表明，circPRKCI在脂多糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可減輕細胞損傷［5］。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，miR-29b-3p在缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導(dǎo)的心肌細胞中表達上調(diào)，并可加重心肌細胞損傷［6］。但circPRKCI/miR-29b-3p軸是否參與心肌缺血再灌注損傷過程，以及circPRKCI是否可作為山姜素治療缺血性心臟病的治療靶點尚未闡明。因此，本研究采用H/R誘導(dǎo)大鼠心肌細胞H9C2建立心肌細胞損傷模型，探討山姜素是否可通過調(diào)控circPRKCI/miR-29b-3p軸減輕心肌缺血再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 山姜素購自美國Sigma；大鼠心肌細胞H9C2購自上海弘順生物；DMEM培養(yǎng)基、MTT試劑、DMSO、凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑與熒光定量PCR試劑購自美國Megentec；Lipofectamine2000購 自 美 國Invitrogen；miR-NC、miR-29b-3p mimics、si-NC、si-circPRKCI購自廣州銳博生物；pcDNA、pcDNA-circPRKCI購自上海吉滿生物；LDH、MDA、SOD、MPO、IL-1β、TNF-α檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物；兔抗鼠Bcl-2、Bax與二抗購自美國Abcam；Model 680酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad；IX71熒光顯微鏡購自日本Olympus；Step-OnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI；FACS Calibur流式細胞儀購自美國Becton Dickinson。

1.2 方法

1.2.1 分組H9C2細胞接種于6孔板（1×105個/孔），將其置于37℃、95%N2、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧處理24 h，棄舊培養(yǎng)基后加入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧處理6 h，記為H/R組［7］，未經(jīng)處理的H9C2細胞記為對照組。取對數(shù)生長期H9C2細胞分別培養(yǎng)于含不同濃度（5、10、20 mg/L）山姜素的培養(yǎng)液中［8］，各組細胞培養(yǎng)24 h后進行H/R處理，分別記為山姜素低、中、高劑量組。取對數(shù)生長期H9C2細胞接種于24孔板（2×104個/孔），分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circ-PRKCI 24 h后再進行H/R處理，記為H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-circPRKCI組。si-NC、si-circPRKCI分別轉(zhuǎn)染H9C2細胞24 h后置于含20 mg/L山姜素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再進行H/R處理，記為山姜素高劑量+si-NC組、山姜素高劑量+si-circPRKCI組。

1.2.2 檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)LDH、MDA、SOD水平收集各組細胞培養(yǎng)上清，根據(jù)試劑盒說明書檢測LDH含量。反復(fù)凍融法裂解各組H9C2細胞，根據(jù)試劑盒說明檢測MDA、SOD水平。

1.2.3 ELISA檢測炎癥因子MPO、IL-1β、TNF-α水平收集各組H9C2細胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測MPO、IL-1β、TNF-α水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖 收集各組H9C2細胞接種于96孔板（3×103個/孔），20μl/孔加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，150μl/孔加入DMSO，室溫避光振蕩孵育5 min，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度，計算細胞存活率（%）=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 收集各組H9C2細胞，預(yù)冷PBS洗滌，棄上清，收集細胞沉淀，加入500μl結(jié)合緩沖液懸浮細胞，分別加入5μl Annexin V-FITC與5μl PI，室溫振蕩孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 化學(xué)發(fā)光法檢測ATP含量 取各組H9C2細胞，裂解，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，化學(xué)發(fā)光法檢測ATP含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.7 qRT-PCR檢 測circPRKCI、miR-29b-3p表達 根據(jù)RNA提取試劑盒（miRNA提取試劑盒與普通RNA提取試劑盒）說明書分別提取H9C2細胞RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2μl、10×King RT Buffer 2μl、Fast-King RT Enzyme Mix 1μl、FQ-RT Primer Mix 2μl、RNA 2μg，RNase-Free ddH2O補足至20μl；反應(yīng)條件：42℃15 min，95℃3 min。以2μl cDNA進行qRT-PCR擴增，按照試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min（循環(huán)1次），95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。熒光定量PCR儀檢測目的基因表達。circPRKCI正向引物：5'-ATTCAGGGACACCGTTCTT-3'，反向引物：5'-CTCTTCAGAACACTTGCAGCTT-3'；miR-29b-3p正向引物：5'-TGCGCTAGCACCATTTGAAAT-3'，反向引物：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；GAPDH正向引物：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，反向引物：5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3'。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測circPRKCI與miR-29b-3p的靶向關(guān)系 采用點突變試劑盒突變circPRKCI與miR-29b-3p結(jié)合位點，分別構(gòu)建含結(jié)合位點與突變位點的野生型載體WT-circPRKCI和突變型載體MUT-circPRKCI，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分 別 將WT-circPRKCI、MUT-circPRKCI與miR-NC或miR-29b-3p mimics共轉(zhuǎn)染至H9C2細胞，24 h后收集細胞并檢測相對熒光素酶活性。

1.2.9 Western blot檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 采用蛋白裂解液提取H9C2細胞總蛋白，高溫變性，取40μg蛋白樣品進行10%SDS-PAGE電泳，分離蛋白凝膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別于一抗稀釋液（Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000、GAPDH 1∶3 000）、二抗稀釋液（1∶5 000）中孵育，孵育時間與條件分別為4℃24 h、37℃1 h，Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激及炎癥因子的影響 與對照組比較，H/R組LDH、MDA、MPO、IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05）；與H/R組比較，山姜素低、中、高劑量組LDH、MDA、MPO、IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性（表1）。

表1 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激及炎癥因子的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of alpinetin on oxidative stress and inflammatory factors in H/R-induced cardiomyocytes（±s，n=9）

表1 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激及炎癥因子的影響（±s，n=9）Tab.1 Effect of alpinetin on oxidative stress and inflammatory factors in H/R-induced cardiomyocytes（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with H/R group，2）P＜0.05；compared with Alpinetin-L group，3）P＜0.05；compared with Alpinetin-M group，4）P＜0.05.

Groups Control H/R Alpinetin-L Alpinetin-M Alpinetin-H FP LDH/（U·L-1）124.76±15.34 326.47±32.401）234.35±18.992）183.69±7.282）3）156.09±5.852）3）4）161.657＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）1.03±0.04 4.86±0.461）3.22±0.142）2.32±0.222）3）1.83±0.072）3）4）338.746＜0.001 SOD/（U·ml-1）40.83±4.36 12.40±1.151）16.41±0.982）20.50±1.022）3）26.45±2.342）3）4）198.774＜0.001 MPO/（U·g-1）21.82±2.10 90.69±3.241）68.30±3.322）50.26±5.992）3）37.09±3.682）3）4）430.794＜0.001 IL-1β/（pg·ml-1）16.91±1.28 85.83±4.241）68.65±2.422）51.92±4.702）3）34.48±3.972）3）4）525.691＜0.001 TNF-α/（pg·ml-1）12.20±1.68 120.11±8.141）79.75±6.312）60.20±5.552）3）40.46±4.302）3）4）472.045＜0.001

2.2 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞增殖、凋亡及ATP含量的影響 與對照組比較，H/R組細胞存活率和ATP含量降低（P＜0.05），凋亡率和Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；與H/R組比較，山姜素低、中、高劑量組細胞存活率和ATP含量升高（P＜0.05），凋亡率和Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性（圖1、表2）。

表2 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞增殖、凋亡及ATP含量的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of alpinetin on proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

表2 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞增殖、凋亡及ATP含量的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of alpinetin on proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with H/R group，2）P＜0.05；compared with Alpinetin-L group，3）P＜0.05；compared with Alpinetin-M group，4）P＜0.05.

Groups Control H/R Alpinetin-L Alpinetin-M Alpinetin-H F P Survival rate（%）100.10±2.59 28.99±3.341）46.13±4.222）61.19±2.722）3）74.86±4.162）3）4）551.327＜0.001 Apoptosis rate（%）5.93±0.58 29.17±3.371）19.27±0.872）16.66±0.432）3）13.60±0.482）3）4）251.360＜0.001 ATP/（nmol·mg-1·L-1）24.70±2.07 11.02±0.791）14.18±0.462）16.04±0.592）3）18.67±0.612）3）4）205.483＜0.001

圖1 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響Fig.1 Effect of alpinetin on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis and Bcl-2 and Bax protein expressions

2.3 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞circPRKCI與miR-29b-3p表達的影響 與對照組比較，H/R組circPRKCI表達降低（P＜0.05），miR-29b-3p表達升高（P＜0.05）；與H/R組比較，山姜素低、中、高劑量組circPRKCI表達升高（P＜0.05），miR-29b-3p表達降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性（表3）。

表3 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞circPRKCI與miR-29b-3p表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of alpinetin on expressions of circPRKCI and miR-29b-3p in cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

表3 山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞circPRKCI與miR-29b-3p表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of alpinetin on expressions of circPRKCI and miR-29b-3p in cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with H/R group，2）P＜0.05；compared with Alpinetin-L group，3）P＜0.05；compared with Alpinetin-M group，4）P＜0.05.

Groups Control H/R Alpinetin-L Alpinetin-M Alpinetin-H F P circPRKCI 1.00±0.06 0.27±0.061）0.49±0.072）0.68±0.052）3）0.85±0.032）3）4）241.752＜0.001 miR-29b-3p 1.00±0.08 3.99±0.661）2.26±0.182）1.77±0.052）3）1.38±0.072）3）4）126.860＜0.001

2.4 circPRKCI靶向調(diào)控miR-29b-3p表達circ-PRKCI與miR-29b-3p存在結(jié)合位點（圖2A）。miR-29b-3p過表達可降低野生型載體WT-circPRKCI熒光素酶活性（P＜0.05，圖2B）。circPRKCI可負向調(diào)控miR-29b-3p表達（P＜0.05，圖2C）。

圖2 circPRKCI靶向調(diào)控miR-29b-3p表達Fig.2 circPRKCI targeted regulates miR-29b-3p expression

2.5 circPRKCI過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激、炎癥因子、增殖、凋亡及ATP含量的影響 與H/R+pcDNA組比較，H/R+pcDNA-circPRKCI組LDH、MDA、MPO、IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），細胞存活率和ATP含量升高（P＜0.05），凋亡率和Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05，表4、圖3）。

圖3 circPRKCI過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響Fig.3 Effect of circPRKCI overexpression on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis，Bcl-2 and Bax protein expressions

表4 circPRKCI過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激、炎癥因子、增殖、凋亡及ATP含量的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of circPRKCI overexpression on oxidative stress，inflammatory factors，proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

表4 circPRKCI過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激、炎癥因子、增殖、凋亡及ATP含量的影響（±s，n=9）Tab.4 Effect of circPRKCI overexpression on oxidative stress，inflammatory factors，proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

Groups H/R+pcDNA H/R+pcDNAcircPRKCI t P circPRKCI 1.00±0.04 2.42±0.29 14.552＜0.001 LDH/（U·L-1）328.70±27.82 198.71±10.47 13.119＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）4.86±0.47 2.32±0.25 14.314＜0.001 SOD/（U·ml-1）12.26±0.85 24.64±2.31 15.089＜0.001 MPO/（U·g-1）90.78±2.73 51.52±3.88 24.826＜0.001 IL-1β/（pg·ml-1）85.36±2.68 47.20±4.72 21.091＜0.001 TNF-α/（pg·ml-1）120.09±6.30 74.89±5.61 16.074＜0.001 Survival rate（%）28.72±4.10 58.83±6.68 11.525＜0.001 Apoptosis rate（%）29.59±2.71 15.92±0.67 14.691＜0.001 ATP/（nmol·mg-1·L-1）11.07±1.32 17.06±0.73 11.913＜0.001

2.6 干擾circPRKCI表達部分逆轉(zhuǎn)山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激、炎癥因子、增殖、凋亡及ATP含量的作用 與山姜素高劑量+si-NC組比較，山姜素高劑量+si-circPRKCI組LDH、MDA、MPO、IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05），SOD活性、細胞存活率和ATP含量降低（P＜0.05），凋亡率和Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05，圖4、表5）。

圖4 干擾circPRKCI表達部分逆轉(zhuǎn)山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響Fig.4 Interference with circPRKCI expression partially reversed effect of alpinetin on H/R-induced cardiomyocyte apoptosis，Bcl-2 and Bax protein expressions

表5 干擾circPRKCI表達部分逆轉(zhuǎn)山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激、炎癥因子、增殖、凋亡及ATP含量的作用（±s，n=9）Tab.5 Interference with circPRKCI expression partially reversed effect of alpinetin on oxidative stress，inflammatory factors，proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

表5 干擾circPRKCI表達部分逆轉(zhuǎn)山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激、炎癥因子、增殖、凋亡及ATP含量的作用（±s，n=9）Tab.5 Interference with circPRKCI expression partially reversed effect of alpinetin on oxidative stress，inflammatory factors，proliferation，apoptosis and ATP content of cardiomyocytes induced by H/R（±s，n=9）

Groups Alpinetin-H+si-NC Alpinetin-H+si-circPRKCI t P circPRKCI 1.00±0.02 0.55±0.03 37.442＜0.001 miR-29b-3p 1.00±0.05 1.70±0.05 29.698＜0.001 LDH/（U·L-1）155.11±8.06 244.21±24.76 10.265＜0.001 MDA/（nmol·ml-1）1.84±0.09 3.30±0.19 20.834＜0.001 SOD/（U·ml-1）26.40±1.93 16.74±0.37 14.747＜0.001 MPO/（U·g-1）37.48±3.41 64.15±3.90 15.444＜0.001 IL-1β/（pg·ml-1）34.97±3.61 71.58±3.01 23.367＜0.001 TNF-α/（pg·ml-1）40.14±5.96 84.09±4.68 17.399＜0.001 Survival rate（%）74.26±5.56 47.22±6.17 9.767＜0.001 Apoptosis rate（%）13.58±0.73 19.48±0.68 17.742＜0.001 ATP/（nmol·mg-1·L-1）18.68±0.44 13.32±0.57 22.331＜0.001

3 討論

尋找有效干預(yù)靶點是心肌缺血再灌注損傷的研究重點，部分中藥提取物能夠減輕心肌缺血再灌注損傷，但具體作用機制尚未闡明［9］。circRNA在心肌細胞損傷中表達異常，并可參與細胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等過程［10］。但circRNA是否可作為中藥提取物治療心血管疾病靶點，以及circRNA是否可作為減輕心肌缺血再灌注損傷的干預(yù)靶點均需進一步探究。

山姜素可通過抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕脂多糖誘導(dǎo)的干細胞損傷［11］。山姜素可抑制炎癥反應(yīng)及TLR4/NLRP3信號通路減緩急性結(jié)腸炎進展［12］。本研究顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞LDH、MDA水平升高，SOD活性降低，與既往研究結(jié)論相似［13］，提示心肌細胞損傷模型建立成功。進一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著山姜素濃度升高，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞LDH、MDA水平降低，SOD活性升高，提示山姜素可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激。心肌缺血再灌注損傷可促進心肌細胞釋放MPO、IL-1β、TNF-α等多種炎癥遞質(zhì)［14］。本研究顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞MPO、IL-1β、TNF-α水平升高，而山姜素作用后MPO、IL-1β、TNF-α水平降低，且呈劑量依賴性，提示山姜素可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞炎癥反應(yīng)。心肌細胞重要的代謝過程之一是能量代謝，心肌組織損傷時可引起能量代謝障礙從而導(dǎo)致細胞損傷，ATP含量變化可反映細胞內(nèi)能量代謝［15］。本研究顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞ATP含量降低，而山姜素作用后ATP含量升高，且呈劑量依賴性，提示山姜素可通過增加H/R誘導(dǎo)的心肌細胞ATP含量而增強能量代謝，從而發(fā)揮心肌細胞保護作用。本研究顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞存活率降低，凋亡率和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，與既往研究結(jié)論相似［16］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，山姜素處理后H/R誘導(dǎo)的心肌細胞存活率升高，凋亡率和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，提示山姜素可通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，并可通過增強細胞能量代謝促進細胞增殖。

為進一步探究山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的作用機制，本研究顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞circPRKCI表達降低，miR-29b-3p表達升高，而山姜素作用后circPRKCI表達升高，miR-29b-3p表達降低，提示山姜素可能通過上調(diào)circPRKCI表達及下調(diào)miR-29b-3p表達發(fā)揮抗心肌細胞損傷作用。研究表明，circPRKCI在過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可減輕細胞損傷［17］。此外，circPRKCI在胃癌等腫瘤中表達異常，并可通過充當(dāng)miR-545海綿分子促進細胞增殖及侵襲［18］。本研究顯示，circPRKCI過表達可明顯降低H/R誘導(dǎo)的心肌細胞炎癥及氧化應(yīng)激，并促進細胞存活及增加ATP含量，還可降低細胞凋亡率。提示circPRKCI過表達可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡及促進細胞增殖從而減輕心肌細胞損傷。本研究證實，心肌細胞circPRKCI與miR-29b-3p存在靶向調(diào)控關(guān)系。研究表明，miR-29b-3p在H/R誘導(dǎo)的心肌細胞表達上調(diào)，下調(diào)其表達可減輕細胞損傷［19］。下調(diào)miR-29b-3p表達可減輕煙霧吸入引起的急性肺損傷［20］。本研究顯示，干擾circPRKCI表達可通過上調(diào)miR-29b-3p表達而逆轉(zhuǎn)山姜素對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的作用。提示circPRKCI/miR-29b-3p軸可能介導(dǎo)山姜素治療心血管疾病過程。

綜上，山姜素可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凋亡，并可增強能量代謝、促進細胞增殖進而對心肌細胞發(fā)揮保護作用，circ-PRKCI可靶向調(diào)控miR-29b-3p表達，其作用機制與上調(diào)circPRKCI表達、下調(diào)miR-29b-3p表達有關(guān)，為心肌缺血再灌注損傷防治提供了新方向。課題組將進一步探究山姜素是否可通過調(diào)控其他circRNA對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞發(fā)揮保護作用。