干姜和炮姜高效液相色譜指紋圖譜與色度值對(duì)比研究

余凌英，李星，強(qiáng)夢(mèng)琴，蔡平君（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137）

干姜是姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖。炮姜是干姜的炮制加工品，具有溫經(jīng)止血、溫中止痛作用，用于陽(yáng)虛失血，吐衄崩漏，脾胃虛寒，腹痛吐瀉?！吨袊?guó)藥典》2020年版中干姜和炮姜的指標(biāo)成分為6-姜辣素（又稱(chēng)6-姜酚），只是含量限度有所不同[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道干姜和炮姜的6-姜酚成分含量差異較大[2-4]，并通過(guò)指紋圖譜分析干姜與炮姜峰個(gè)數(shù)差異[5-7]。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥材的不同產(chǎn)地、不同炮制品、不同品種等研究[8-10]。炮姜炮制程度主要通過(guò)性狀顏色主觀判斷，市場(chǎng)上的炮姜顏色深淺不同，其他指標(biāo)如含量測(cè)定僅規(guī)定6-姜酚最低含量，對(duì)炮姜質(zhì)量評(píng)價(jià)不足，故臨床實(shí)際應(yīng)用的炮姜性狀差異較大。王維皓等[11]研究結(jié)果也表明來(lái)源于市場(chǎng)的炮姜相似度較低。目前評(píng)價(jià)炮姜質(zhì)量的指標(biāo)并不完善，本研究通過(guò)對(duì)炮姜色度值檢測(cè)、建立指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析，篩選炮姜質(zhì)量差異標(biāo)志物，并對(duì)市售炮姜進(jìn)行驗(yàn)證，以期為進(jìn)一步評(píng)價(jià)炮姜質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030C 3D 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；CR-400 色彩色差計(jì)（日本柯尼卡美能達(dá)公司）；BP110S 十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；KQ-300E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；QE-100 高速中藥粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；5 型多功能炒貨機(jī)（常州邁斯機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

姜酮（批號(hào)：18070502）、6-姜烯酚（批號(hào)：19052704）、8-姜烯酚對(duì)照品（批號(hào)：19072304）、10-姜烯酚（批號(hào)：19080802）對(duì)照品（純度＞98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；6-姜酚（批號(hào)：21010402）、10-姜酚（批號(hào)：20070809）（純度＞98%，成都市卓譜儀器有限公司）；8-姜酚對(duì)照品（批號(hào)：CHB180305，純度＞98%，成都克洛瑪生物科技有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Sigma 公司）；冰乙酸（色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）。10 批干姜飲片（G1～G3產(chǎn)地四川；G4～G6 產(chǎn)地云南；G7～G10 產(chǎn)地貴州），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蘭志瓊副教授鑒定為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖。10 批炮姜（自制，采用河砂于195 ℃炒制7.5 min即得，編號(hào)P1～P10）。7 批市售炮姜購(gòu)買(mǎi)于企業(yè)、藥店（編號(hào)為S1～S7）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色度值測(cè)定

2.1.1 測(cè)定方法與條件[12]測(cè)量光源為D65，視場(chǎng)選擇近似2°觀察角。分別取各炮制品粉末（過(guò)三號(hào)篩）適量，將樣品粉末置于色彩色差計(jì)中，測(cè)定樣品粉末顏色，平行測(cè)定3 份，經(jīng)白板校正后，測(cè)得各樣品L*、a*、b*。其中L*代表明暗度，正值偏亮，負(fù)值偏暗；a*為紅綠色，正值偏紅，負(fù)值偏綠；b*為黃藍(lán)色，正值偏黃，負(fù)值偏藍(lán)。

2.1.2 樣品測(cè)定與分析 取干姜和炮姜樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下測(cè)定條件測(cè)定樣品L*、a*、b*，總色值（E*）＝（L*2＋a*2＋b*2）1/2，總色差（ΔE*）＝（ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2）1/2，ΔL*、Δa*、Δb*分別是炮姜與同批次干姜數(shù)據(jù)的差值。其中10 批干姜和炮姜樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，市售炮姜樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。從表1數(shù)據(jù)可以看出：干姜L*為65.56～76.88，a*為3.35～7.74，b*為31.29～36.38，E*為73.67～84.23； 炮 姜L*為34.56～44.30，a*為12.82～14.39，b*為25.68～31.37，E*為45.10～56.04。干姜制成炮姜后ΔL*、Δb*均為負(fù)值，平均分別下降了34.09和5.01，表明炮姜顏色明顯偏黑；Δa*為正值，平均增加8.96，樣品偏紅；ΔE*平均增加35.68，色差明顯，干姜與炮姜可以明顯區(qū)分。

表1 干姜和炮姜色度值檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Chromatic values of dried ginger and processed ginger

從表2數(shù)據(jù)可以看出市售炮姜L*、E*均高于樣品炮姜，表明市售品顏色比樣品炮姜顏色明亮，色澤偏黃。市售炮姜a*、b*均有1 份樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)在樣品炮姜數(shù)據(jù)范圍內(nèi)。S3、S4 兩份樣品色度值與樣品炮姜最接近，但仍高于樣品。

表2 市售炮姜色度值檢測(cè)結(jié)果Tab 2 Chromatic values of processed ginger from market

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～25%A；10～30 min，25%～40%A；30～70 min，40%～80%A；70～83 min，80%～90%A；83～98 min，90%～100%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30℃，流速0.6 mL·min－1，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.0602、0.294、0.129、0.093、0.295、0.060、0.048 mg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取干姜和炮姜粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.30 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理40 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各共有峰的峰面積，結(jié)果各共有峰峰面積的RSD值為0.50%～0.72%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3” 項(xiàng)下溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄各共有峰的峰面積，結(jié)果共有峰峰面積的RSD值為0.47%～1.2%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取炮姜粉末6 份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各共有峰的峰面積，結(jié)果各共有峰峰面積的RSD值為1.4%～2.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 取10 批干姜和炮姜飲片按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，將10 批干姜和10 批炮姜色譜圖分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A 版）”軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，干姜的相似度為0.918～0.993，炮姜的相似度為0.904～0.993，相似度均大于0.9。10 批干姜和10 批炮姜飲片HPLC 指紋圖譜見(jiàn)圖1，干姜的共有峰為25 個(gè)，炮姜的共有峰為27 個(gè)，其中峰2、21、23 為干姜的特有峰，峰1、3、5、16、28 為炮姜的特有峰。通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)了其中7 個(gè)色譜峰，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 干姜（A）、炮姜（B）、混合對(duì)照品（C）HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of dried ginger（A），processed ginger（B）and mixed reference substance（C）

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

以炮姜確定的27 個(gè)共有峰為研究對(duì)象，采用SPSS 26.0 軟件對(duì)10 批干姜與10 批炮姜中共有峰的峰面積數(shù)據(jù)均一化處理后與色度值L*、a*、b*、E*進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。炮姜與干姜相比，色譜峰4、6、7、12（6-姜酚）、13、14（8-姜酚）、15（6-姜烯酚）、18（10-姜酚）、19（8-姜烯酚）、24（10-姜烯酚）、26、27、29 等13 個(gè)峰的峰面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中峰4、13、15、19、24、27 炮制后峰面積明顯增加。峰1、3、5、16、28 為炮制后新產(chǎn)生的成分。色度值L*、a*、b*、E*差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中L*、b*、E*在炮制后顯著降低，a*在炮制后顯著升高。

表3 干姜和炮姜峰面積、色度值平均值t 檢驗(yàn)結(jié)果Tab 3 t test of mean peak area and chromatic value of dried ginger and processed ginger

2.4 聚類(lèi)分析

利用SIMCA 14.1 軟件，以10 批干姜和10 批炮姜的HPLC 指紋圖譜的色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)平方歐氏距離為20 時(shí)，10 批干姜聚為一類(lèi)，10 批炮姜聚為一類(lèi)，說(shuō)明不同炮制品之間質(zhì)量存在明顯的差異。

圖2 聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig 2 Dendrogram of cluster analysis

2.5 主成分分析

將10 批干姜及10 批炮姜飲片HPLC 指紋圖譜中的27 個(gè)色譜峰的峰面積及色度值（L*、a*、b*、E*）經(jīng)數(shù)據(jù)處理后導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中進(jìn)行主成分分析，部分批次色譜峰缺失的峰面積以0 計(jì)。當(dāng)特征值＞1 時(shí)，共提取5 個(gè)主成分因子，其特征值和方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表4，前5 個(gè)主成分可用于反映干姜和炮姜指紋圖譜整體93.13%的信息。主成分分析二維得分圖見(jiàn)圖3，干姜與炮姜被明顯地分在坐標(biāo)軸的兩側(cè)，互不交叉，說(shuō)明干姜和炮姜具有明顯的差異性，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

圖3 干姜和炮姜的主成分分析得分圖Fig 3 Score plot of principal component analysis for dried ginger and processed ginger

表4 特征值及方差貢獻(xiàn)率Tab 4 Characteristic value and variance contribution rate

2.6 偏最小二乘-判別分析

為了進(jìn)一步尋找干姜和炮姜的差異標(biāo)志物，采用SIMAC 14.1 軟件對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘-判別分析。將10 批干姜和10 批炮姜的27 個(gè)共有峰的峰面積和色度值（L*、a*、b*、E*）導(dǎo)入SIMAC 14.1 軟件中，建立偏最小二乘-判別分析模型，模型得分圖見(jiàn)圖4，所得結(jié)果與主成分分析和聚類(lèi)分析結(jié)果均一致，可以很好地將兩者進(jìn)行分類(lèi)。其中R2Y達(dá)到0.978，表示模型擬合程度好，Q2達(dá)到0.944，表示該模型預(yù)測(cè)能力強(qiáng)。10 批干姜和10 批炮姜飲片的分類(lèi)聚集明顯。對(duì)模型中31 個(gè)變量的重要度（VIP）進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，選擇VIP ＞1 的成分作為區(qū)分干姜和炮姜飲片的重要特征數(shù)據(jù)，依次為a*（VIP＝1.39）、L*（VIP＝1.39）、E*（VIP＝1.38）、峰3（VIP＝1.32）、峰29（VIP＝1.28）、峰5（姜酮，VIP＝1.25）、峰14（8-姜酚，VIP＝1.23）、峰6（VIP＝1.22）、b*（VIP＝1.21）、峰12（6-姜酚，VIP＝1.20）、峰18（10-姜酚，VIP＝1.20）、峰16（VIP＝1.17）、峰28（VIP＝1.17）、峰15（6-姜烯酚，VIP＝1.16）、峰7（VIP＝1.09）、峰1（VIP＝1.07）、峰24（10-姜烯酚，VIP＝1.06）、峰13（VIP＝1.04）。

圖4 偏最小二乘-判別分布圖Fig 4 Score plot of partial least

圖5 VIP 值分布圖Fig 5 VIP score plot squares-discriminant analysis

2.7 差異標(biāo)志物與色度值相關(guān)性分析

利用SPSS 26.0 對(duì)14 個(gè)差異標(biāo)志物峰面積與色度值L*、a*、b*、E*進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見(jiàn)表5。一般認(rèn)為，相關(guān)系數(shù)|r|≥0.8 時(shí)高度相關(guān)；0.5 ≤|r|＜0.8 中度相關(guān)；0.3 ≤|r|＜0.5 時(shí)低度相關(guān)；|r|＜0.3 時(shí)基本不相關(guān)。除13 號(hào)峰與b*不相關(guān)外，其余各色譜峰與色度值均有相關(guān)性，其中峰1、3、5、15、16、24、28 與a*成顯著正相關(guān)，與L*、b*、E*成顯著負(fù)相關(guān)；峰6、7、12、14、18、29 與之相反，與a*成顯著負(fù)相關(guān)，與L*、b*、E*成顯著正相關(guān)。表明干姜炮制過(guò)程中，差異標(biāo)志物與顏色變化有較好的相關(guān)性。

表5 差異標(biāo)志物峰面積與色度值相關(guān)性分析Tab 5 Correlation analysis between marker peak area and chromatic value

2.8 市售炮姜數(shù)據(jù)分析

將7 批市售炮姜飲片按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。將市售炮姜與炮姜對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，S1～S7相似度分別是0.617、0.593、0.746、0.795、0.580、0.512、0.565，相似度均小于0.8。根據(jù)“2.5”項(xiàng)下篩選VIP ＞1 差異標(biāo)志物的色譜峰，以其峰面積分別與樣品姜（建立指紋圖譜的干姜、炮姜）峰面積進(jìn)行比較，其與干姜峰面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其與炮姜峰面積差異有統(tǒng)計(jì)意義的是峰5、6、12、14、16、24、28。市售炮姜峰面積與樣品炮姜對(duì)比，范圍不同的色譜峰有峰5、16、28，全部重疊的色譜峰為峰7、13，峰面積比較見(jiàn)表6，色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 市售炮姜色譜圖Fig 6 HPLC fingerprint of processed ginger from market

表6 市售炮姜與樣品炮姜差異標(biāo)志物峰面積比較Tab 6 Marker peak area between processed ginger from market and processed ginger

市售炮姜色度值與樣品炮姜有差異，相似度也較低；差異標(biāo)志物峰面積部分成分有差異，采用不同條件炮制炮姜，成分變化未達(dá)到樣品炮姜的炮制程度。

3 討論

本研究考察了不同提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇、甲醇）、不同流動(dòng)相（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液）、不同檢測(cè)波長(zhǎng)（240、254、280 nm）、不同流速（0.6、0.8、1.0 mL·min－1）對(duì)色譜圖的影響，最終確定了研究用色譜條件。

本研究對(duì)干姜和炮姜指紋圖譜進(jìn)行了相似度和化學(xué)模式識(shí)別分析。兩種炮制品相似度均＞0.9，表明炮制品各批次間成分差異不明顯，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。市售炮姜相似度在0.512～0.795，炮姜來(lái)源不同質(zhì)量差異大，可能與炮制工藝參數(shù)不一致，在炮制過(guò)程中化學(xué)成分變化程度不同有關(guān)。采用化學(xué)模型識(shí)別分析與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，說(shuō)明本研究采用的分析方法用于炮姜質(zhì)量評(píng)價(jià)是可行的。

基于VIP ＞1 的篩選原則，發(fā)現(xiàn)了14 個(gè)化學(xué)成分可作為區(qū)分干姜和炮姜的標(biāo)志物，并指認(rèn)了姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和10-姜烯酚等6個(gè)成分。14個(gè)成分中，色譜峰1、3、5、16、28 為新增加成分，市售炮姜中峰5、16、28 峰面積均低于樣品炮姜，表明上述成分可能與炮制程度關(guān)系更密切，是炮制程度潛在評(píng)價(jià)指標(biāo)。5 號(hào)峰為姜酮，具有抗炎、抗氧化、止血等作用[13-16]，是炮姜溫經(jīng)止血成分之一，姜酮含量與炮制溫度、時(shí)間均有關(guān)系[17]。炮姜中姜酚類(lèi)成分含量降低，姜烯酚類(lèi)和姜酮成分含量增加，其變化可能與姜酚類(lèi)成分在炒制過(guò)程中轉(zhuǎn)化為姜烯酚、姜酮等物質(zhì)有關(guān)[18-20]。姜烯酚類(lèi)成分抗炎作用強(qiáng)于姜酚類(lèi)[21]。課題組對(duì)脾胃虛寒型胃潰瘍大鼠進(jìn)行抗?jié)儗?shí)驗(yàn)，優(yōu)選工藝制得樣品[22]藥效優(yōu)于炮制太過(guò)或不及的樣品。說(shuō)明以差異標(biāo)志物作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)是科學(xué)的。

顏色是傳統(tǒng)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，辨色論質(zhì)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的發(fā)展應(yīng)用，有豐富的理論，但主觀性強(qiáng)，缺乏客觀標(biāo)準(zhǔn)。顏色量化值能反映炮制品顏色變化，通過(guò)比較粉末與飲片的色度值，粉末均勻，重現(xiàn)性好，選擇粉末為本研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)數(shù)據(jù)與差異標(biāo)志物關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明炮姜色度值與差異標(biāo)志物有明顯相關(guān)性，可以通過(guò)表觀顏色推測(cè)內(nèi)在成分高低，評(píng)價(jià)炮姜質(zhì)量。市售炮姜數(shù)據(jù)也說(shuō)明以色度值作為炮姜質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)具有合理性，且操作方便、快捷，為炮姜質(zhì)量快速評(píng)價(jià)以及在線(xiàn)監(jiān)測(cè)提供了思路，但是合適的色度范圍還需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步檢測(cè)分析確定。

綜上，建立的干姜和炮姜HPLC 指紋圖譜并結(jié)合色度值、化學(xué)模式識(shí)別分析，將外觀顏色與內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行了關(guān)聯(lián)，明確了炮制品質(zhì)量差異，為炮姜質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。初步分析了質(zhì)量差異標(biāo)志物與炮制程度的關(guān)系，但需要深入研究相關(guān)性；其他未知標(biāo)志物，有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究，如采用HPLC-MS-MS 等技術(shù)研究結(jié)構(gòu)與功效，并確認(rèn)標(biāo)志物的合理控制條件，有利于更全面地評(píng)價(jià)炮姜質(zhì)量。