基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS的苦黃注射液化學(xué)成分分析

王允吉，王海丹，劉璐，張引蘭，童寧，曹輝*（.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院／南京市第二醫(yī)院藥學(xué)部，南京 0003；.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室，南京 009）

苦黃注射液源于張仲景《傷寒論》的茵陳蒿湯（茵陳、大黃、山梔），鄒良才老中醫(yī)改良茵陳蒿湯而得到由大黃、苦參、茵陳、柴胡和大青葉組成的苦黃注射液。該藥具有清熱利濕、疏肝退黃的功效，主治濕熱型黃疸，即因濕熱內(nèi)蘊(yùn)引起的黃疸型病毒性肝炎患者的退黃[1-2]。目前，有關(guān)苦黃注射液的研究多集中于臨床療效觀察，研究表明苦黃注射液對黃疸型病毒性肝炎[3]、膽汁淤積性肝病[4]、原發(fā)性膽汁性肝硬化[5]等疾病均有較好的療效。

關(guān)于苦黃注射液中的化學(xué)成分研究僅有針對某類或某幾個(gè)特征性成分進(jìn)行定量分析的報(bào)道[6-7]，尚未見對苦黃注射液中化學(xué)成分進(jìn)行全面分析的研究。超高效液相色譜-四極桿-靜電軌道場離子阱質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）技術(shù)具有高分離性能、高靈敏度及高檢測能力，可以進(jìn)行高精度的定量和定性分析，已廣泛用于中藥成分分析、藥物動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)藥物分析等領(lǐng)域[8]。本研究首次采用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 對苦黃注射液中化學(xué)成分進(jìn)行全面分析，并對其進(jìn)行藥材歸屬，為明確苦黃注射液藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，闡明其藥理學(xué)作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Q-Extractive 液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（含高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)量分析器）、Xcalibur 3.1 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（美國Thermo公司）；Heraeus Multifuge X1R 冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國Waters 公司）；Milli-Q Direct 超純水儀（德國默克Millipore 公司）。

1.2 試藥

苦黃注射液（常熟雷允上制藥有限公司，批號：2106281，規(guī)格：10 mL）；乙腈、乙醇（HPLC 級，德國Merck 公司）；甲酸（HPLC 級，美國Sigma-Aldrich 公司）；純水取自超純水儀。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

吸取苦黃注射液1 mL，加入純乙醇溶液3 mL 沉淀后，于2～8℃冰箱中放置24 h 后，離心5 min（4 ℃、12 000 r·min－1），吸取上清液后經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后得到供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速：0.35 mL·min－1；柱溫：35℃；0.1%甲酸水為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～8 min，0%～25%A；8～23 min，25%～55%A；23～25 min，55%～80%A；25～26 min，80%～100%A；26～27 min，100%A；27～28 min，100%～0%A；28～30 min，0%A）；進(jìn)樣量：5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源為HESI 源，正、負(fù)離子檢測模式，毛細(xì)管電壓為3500 V，毛細(xì)管溫度為350 ℃，離子源溫度為350℃，鞘氣流速為9 L·min－1，輔助氣流速為3 L·min－1，階梯碰撞能量：25、35、45 eV，檢測方式為Full MS/dd-MS2，一級質(zhì)譜分辨率Full MS 70 000 FWHM（Full Width at Half Maximum），二級質(zhì)譜分辨率dd-MS217 500 FWHM，掃描范圍m/z100～1000 Da。

2.4 數(shù)據(jù)處理

通過查閱Scifinder、Chemspider 數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)，收集整理了苦黃注射液中各類化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式以及化合物的裂解規(guī)律。運(yùn)用Xcalibur 3.0 軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理，通過高分辨質(zhì)譜計(jì)算出分子式（誤差范圍±1×10－5），結(jié)合目前已有文獻(xiàn)信息推測可能的化合物的裂解規(guī)律，并根據(jù)相同類型的化合物的裂解規(guī)律對化合物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

3 結(jié)果

3.1 苦黃注射液中化學(xué)成分分析

采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 正負(fù)離子模式分析苦黃注射液乙醇沉淀后的（＋）HESIMS、（－）HESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖（TIC）（見圖1），通過UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 技術(shù)檢測得到離子流峰的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，共鑒定出苦黃注射液中化學(xué)成分123 個(gè)[9-25]，其中包括黃酮類36 個(gè)、酚酸類20 個(gè)、生物堿類19 個(gè)、蒽醌類15 個(gè)、氨基酸11 個(gè)、核苷類8 個(gè)、萜類6 個(gè)、脂肪酸類3 個(gè)，糖類1 個(gè)等，化合物結(jié)果見表1。

表1 苦黃注射液中化學(xué)成分的UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 鑒定結(jié)果Tab 1 Identified chemical constituents in Kuhuang injection by UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 ESI＋模式（A）和ESI－模式（B）下苦黃注射液的總離子流圖Fig 1 Total ion chromatogram of Kuhuang injection under the positive ion（A）and the negative ion（B）modes

3.2 苦黃注射液中主要化合成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律

3.2.1 黃酮類化合物的分析鑒定 苦黃注射液中共鑒定出黃酮類化合物36 種，該類成分主要來自于大黃、茵陳和大青葉?，F(xiàn)以芫花素、柚皮素為例，依據(jù)多級碎片信息，解析苦黃注射液中黃酮類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。

峰84 保留時(shí)間為12.82 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z285.0754 [M+H]＋，同時(shí)可觀察到主要的碎片離子分別為m/z270.0518、255.0651、242.0573、225.0544、163.0390、151.0390、123.0442，分別對應(yīng)的分子式為[M+HCH3]＋、[M+H-CH2O]＋、[M+H-C2H2O]＋、[M+H-CO3]＋、[M+H-C7H6O2]＋、[M+H-C8H6O2]＋、[M+HC9H6O3]＋，根據(jù)正離子模式下的精確分子質(zhì)量及特征碎片的質(zhì)量，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]可判斷該化合物為芫花素，其裂解規(guī)律見圖2。

圖2 芫花素可能的裂解途徑Fig 2 Possible fragmentation pathways of genkwanin

峰94 保留時(shí)間為14.83 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z271.0609 [M-H]－，同時(shí)可觀察到主要的碎片離子分別為m/z253.0500、227.0712、177.0180、151.0025、119.0489、93.0332，分別對應(yīng)的分子式為[M-H-OH]－、[M-H-CO2]－、[MH-C6H6O]－、[M-H-C8H8O]－、[M-H-C7H4O4]－、[M-HC9H6O4]－，根據(jù)負(fù)離子模式下的精確分子質(zhì)量及特征碎片的質(zhì)量，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]可判斷該化合物為柚皮素，其裂解規(guī)律見圖3。

圖3 柚皮素可能的裂解途徑Fig 3 Proposed fragmentation pathways of naringenin

3.2.2 酚酸類及其化合物的分析鑒定 苦黃注射液中共鑒定出酚酸類成分20 種，該類成分主要存在于該組方中的大黃、柴胡和茵陳。

峰42 保留時(shí)間為5.90 min，可觀察到該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z353.0872 [M-H]－，與其分子式C16H18O9相符，其主要的碎片離子分別為m/z191.0551、179.0339、173.0441、161.0231、135.0438，歸屬各碎片離子分別為[M-H-C9H6O3]－、[M-HC7H10O5]－、[M-H-C9H8O4]－、[M-H-C7H12O6]－、[M-HC8H10O7]－，根據(jù)負(fù)離子模式下精確相對分子質(zhì)量和二級質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10，12-13]可判斷該化合物為綠原酸，其裂解規(guī)律見圖4。

峰22 保留時(shí)間為4.26 min，可觀察到該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z169.0132 [M-H]－，與其分子式C7H6O5相符，其主要的碎片離子分別為m/z125.0231、97.0281、69.0331，歸屬各碎片離子分別為[M-H-CHO]－、[M-H-C3H4O3]－、[M-HC3O4]－，根據(jù)負(fù)離子模式下精確相對分子質(zhì)量和二級質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15-17，21-22]可判斷該化合物為沒食子酸，其裂解規(guī)律見圖5。

圖5 沒食子酸可能的裂解途徑Fig 5 Proposed fragmentation pathways of gallic acid

3.2.3 生物堿類化合物的分析鑒定 苦黃注射液中共鑒定出種生物堿類化合物19 種，該類成分主要來自于苦參和大青葉。峰17 保留時(shí)間為3.95 min，可觀察到該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z191.1178 [M+H]＋，與其C11H14N2O 分子式相符，其主要的碎片離子分別為m/z148.0756、120.0809，歸屬各碎片離子分別為[M+H-C2H5N]＋、[M+HC3H5NO]＋，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]可判斷該化合物為金雀花堿，其裂解規(guī)律見圖6。

圖6 金雀花堿可能的裂解途徑Fig 6 Proposed fragmentation pathways of cytisine

峰34 保留時(shí)間為4.69 min，可觀察到該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z249.1961 [M+H]＋，與其C15H24N2O 分子式相符，其主要的碎片離子分別為m/z247.1801、230.1536、150.1275、148.1120、112.0759，歸屬各碎片離子分別為[M+H-H2]＋、[M+H-OH]＋、[M+H-C5H8NO]＋、[M+HC5H10NO]＋、[M+H-C8H10NO]＋，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[18-20]可判斷該化合物為苦參堿，其裂解規(guī)律見圖7。

圖7 苦參堿可能的裂解途徑Fig 7 Proposed fragmentation pathways of matrine

3.2.4 蒽醌類化合物的分析鑒定 苦黃注射液中共鑒定出種蒽醌類化合物15 種，該類成分主要來自于大黃?，F(xiàn)以大黃酸、大黃素、大黃酚為例，依據(jù)多級碎片信息，解析苦黃注射液中蒽醌類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。

其中峰107 保留時(shí)間為18.85 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z283.0246 [M-H]－，同時(shí)可觀察到主要的碎片離子分別為m/z239.0344、211.0391、183.0441，分別對應(yīng)的分子式為[M-H-CO2]－、[M-HC2O3]－、[M-H-C3O4]－，根據(jù)負(fù)離子模式下的精確分子質(zhì)量及特征碎片的質(zhì)量，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15-17，21-22]可判斷該化合物為大黃酸，其裂解規(guī)律見圖8。

圖8 大黃酸可能的裂解途徑Fig 8 Proposed fragmentation pathways of rhein

峰114 保留時(shí)間為23.44 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z269.0452 [M-H]－，可觀察到主要的碎片離子分別為m/z241.0504、225.0553、210.0307、197.0596、181.0647，分別對應(yīng)的分子式為[M-H-CO]－、[M-H-CO2]－、[M-H-C2H3O2]－、[MH-C2O3]－、[M-H-C3H3O3]－，根據(jù)負(fù)離子模式下的精確分子質(zhì)量及特征碎片的質(zhì)量，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15-17，21-22]可判斷該化合物為大黃素，其裂解規(guī)律見圖9。

圖9 大黃素可能的裂解途徑Fig 9 Proposed fragmentation pathways of emodin

峰118 保留時(shí)間為26.33 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z253.0501 [M-H]－，可觀察到主要的碎片離子分別為m/z225.0503、183.0665，分別對應(yīng)的分子式為[M-H-CO]－和[M-H-C3H3O3]－，根據(jù)負(fù)離子模式下的精確分子質(zhì)量及特征碎片的質(zhì)量，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15-17，21-22]可判斷該化合物為大黃酚，其裂解規(guī)律見圖10。

圖10 大黃酚可能的裂解途徑Fig 10 Proposed fragmentation pathways of chrysophanol

3.2.5 氨基酸與核苷類化合物分析鑒定 苦黃注射液中共鑒定出氨基酸與核苷類成分分別為11種和8 種，該類成分主要存在于本組方中的各味中藥材。

峰1 保留時(shí)間為0.93 min，可觀察到該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z175.1190 [M+H]＋，與其分子式C6H15N4O2相符，其主要的碎片離子分別為m/z158.0925、130.0957、116.0708、112.0871、70.0658、60.0564，歸屬各碎片離子分別為[M+HOH]＋、[M+H-COOH]＋、[M+H-CH6N3]＋、[M+HCH6NO2]＋、[M+H-C2H8N3O2]＋、[M+H-C5H10NO2]＋，根據(jù)正離子模式下精確相對分子質(zhì)量和二級質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫HMDB 和文獻(xiàn)[23]中化合物信息，可判斷該化合物為精氨酸，其裂解規(guī)律見圖11。

圖11 精氨酸可能的裂解途徑Fig 11 Proposed fragmentation pathways of arginine

峰7 保留時(shí)間為1.76 min，可觀察到該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z136.0618 [M+H]＋，與其分子式C5H5N5相符，其主要的碎片離子分別為m/z119.0354、109.0511，94.0405，歸屬各碎片離子分別為[M+H-NH3]＋、[M+H-CHN]＋、[M+HCH3N2]＋，結(jié)合數(shù)據(jù)庫HMDB 和文獻(xiàn)[23]中化合物信息，可判斷該化合物為腺嘌呤，其裂解規(guī)律見圖12。

圖12 腺嘌呤可能的裂解途徑Fig 12 Proposed fragmentation pathways of adenine

4 討論

本研究利用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)對苦黃注射液的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，通過分析正負(fù)離子模式下質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子[M+H]＋和[M-H]－數(shù)據(jù)，并結(jié)合質(zhì)譜的高分辨率可得到化合物的可靠相對分子質(zhì)量，從而快速分析苦黃注射液中的組分結(jié)構(gòu)，并對其中12 種主要成分可能的裂解規(guī)律進(jìn)行了描述，以期為苦黃注射液的質(zhì)量控制以及后續(xù)闡明苦黃注射液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了詳實(shí)的數(shù)據(jù)支撐。

本次研究中鑒定出的化合物中，黃酮類、酚酸類、生物堿類和蒽醌類成分中有保肝退黃的相關(guān)報(bào)道[26-33]。如苦參的生物堿類化學(xué)成分苦參堿和氧化苦參堿可通過抑制Notch 信號通路促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，減輕肝損傷[26]；也可通過與表皮生長因子受體（EGFR）結(jié)合在細(xì)胞表面，抑制其功能，阻斷與EGFR 相關(guān)的下游信號通路，可減緩肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，保護(hù)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，從而改善肝功能[27]；還具有抗乙肝病毒活性作用[28]。柴胡的主要成分柴胡皂苷對膽堿酯酶有抑制作用，能發(fā)揮擬膽堿樣作用，調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能[29]，也可抑制機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生，對生物細(xì)胞膜產(chǎn)生保護(hù)作用，減少自由基與生物細(xì)胞膜的接觸，避免自由基對細(xì)胞膜的破壞從而降低肝損傷[30-31]。茵陳中主要活性物質(zhì)綠原酸能減輕肝組織的慢性炎性反應(yīng)及匯管區(qū)膽管增生反應(yīng)，減緩肝纖維化進(jìn)程[32]。大黃中的大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素和鞣質(zhì)等成分能促進(jìn)膽汁、膽汁酸和膽紅素分泌，引起膽囊收縮，增強(qiáng)十二指腸和膽管舒張，疏通膽道和微細(xì)膽小管內(nèi)瘀積的膽汁，而起利膽、退黃作用[33]。上述化合物的藥理作用與苦黃注射液清熱利濕、疏肝退黃的功效一致，且在譜圖中有明顯的峰形，可能是苦黃注射液主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。