粗壯潤(rùn)楠化學(xué)成分及其活性研究

里艷茹，黃勝男，尋園，程林友，謝百波，*（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，北京 100050；.北京慧寶源生物技術(shù)股份有限公司，北京 1006；.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院南區(qū)，北京 10618；.廣西慧寶源醫(yī)藥科技有限公司，廣西 欽州 55008）

潤(rùn)楠屬（Machilus）植物為常綠喬木或灌木，在全世界約有100 余種，分布于亞洲東南部和東部的熱帶、亞熱帶，中國(guó)西南部及印度為其主要產(chǎn)地。我國(guó)約有68 種3 變種，產(chǎn)于長(zhǎng)江流域及以南各省區(qū)和山東東部，以云南和華南為主要產(chǎn)地，是當(dāng)?shù)刂饕慕?jīng)濟(jì)林木[1]。粗壯潤(rùn)楠為高大喬木，樹(shù)皮粗糙，灰黑色。我國(guó)主要分布于云南南部、貴州南部、廣西、廣東[2]。潤(rùn)楠屬植物資源豐富，在我國(guó)民間作為草藥廣泛使用，具有溫中順氣、舒筋活血、消腫止痛等較強(qiáng)的生物活性，治療各種皮膚病和風(fēng)濕性疾病，臨床上用于治療胃呆食少、腹脹、腹瀉、扭挫傷等[3]。前文主要報(bào)道了粗壯潤(rùn)楠中的木脂素和苷類化合物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定及其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)和保肝活性[4-6]。本文繼續(xù)報(bào)道該植物化學(xué)成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定及其活性篩選結(jié)果。

1 材料

Perkin-Elmer 343 型旋光測(cè)定儀；美國(guó)Varian 公司Mercury-300、Mercury-400、Inova-500 或SYS-600 核磁共振儀（測(cè)定溫度297 K，以溶劑峰信號(hào)作為參照）；Micromass Autospec-Ultima ETOF 型質(zhì)譜儀和 Q-Trap LC/MS/MS（Turbo Ionspray source）型質(zhì)譜儀（Waters 公司）；R-205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi公司）；閃式快速分離系統(tǒng)（AB SCIEX 公司）；Waters 600 高效液相色譜儀和Agilent HP 1100、1200型高效液相色譜儀；柱色譜硅膠（200～300目）（青島海洋化工廠）；高效制備薄層硅膠板（HSGF）（煙臺(tái)江友硅膠發(fā)展有限公司）；Sephadex LH-20（瑞典Amersham Pharmacia 公司）；MCI Gel CHP-20 樹(shù)脂（70～150 μm）（日本三菱公司）；Thermo SKANIT SOFTWARE 3.2（Thermo 公司）；DMEM及馬血清（Gibco 公司）；胎牛血清（Hyclone 公司）；細(xì)胞株P(guān)C12 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

植物樣品采自廣西壯族自治區(qū)大瑤山，經(jīng)廣西林業(yè)局龍光日工程師鑒定為粗壯潤(rùn)楠Machilus robusta，標(biāo)本現(xiàn)存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所標(biāo)本室，標(biāo)本號(hào)為（No.041）。

2 提取與分離

稱取粉碎干燥的粗壯潤(rùn)楠莖皮5.3 kg，用95%乙醇45 L 于室溫浸漬提取3 次，每次48 h。提取液減壓濃縮，得干浸膏535.0 g，混懸于2000 mL 水中，用乙酸乙酯萃?。?×2000 mL），乙酸乙酯萃取部分（261.0 g）進(jìn)行硅膠柱（100～200目，1000 g，8 cm×100 cm）色譜分離，用石油醚-丙酮（100∶0～0∶100）梯度洗脫，最后用甲醇洗脫；洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測(cè)，TLC 暗斑在紫外燈254 nm 或365 nm 下觀察，通過(guò)碘熏或噴5%硫酸乙醇溶液后加熱顯色檢測(cè)。合并組成相似的流分，回收溶劑得到9 個(gè)部分（Fr.A～Fr.I）。

Fr.B（石油醚-丙酮＝20∶1 洗脫）部分析出紅色針晶，經(jīng)過(guò)濾，用石油醚反復(fù)洗滌得到化合物6（2 mg）。剩余Fr.B 母液減壓蒸干（17.5 g），經(jīng)硅膠柱（200～300 目，150 g）色譜分離，石油醚-乙酸乙酯（100∶5～100∶20）梯度洗脫得到5 個(gè)洗脫部分（B1～B5），B1經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（石油醚-氯仿-甲醇＝5∶5∶1 洗脫）分離純化析出白色結(jié)晶，經(jīng)石油醚-丙酮重結(jié)晶純化得化合物14（5053 mg），B2硅膠柱色譜分離（石油醚-乙酸乙酯＝50∶1 洗脫），經(jīng)反相HPLC 半制備色譜（MeOH-H2O＝91∶9）洗脫，分離純化得化合物10（2.5 mg）和11（1.6 mg）。B3部分經(jīng)反相Flash 柱色譜分離，50%～100%甲醇水溶液洗脫得到6 個(gè)亞組分（B3-1～B3-6）。B3-2部分析出白色結(jié)晶，經(jīng)石油醚-丙酮重結(jié)晶純化得化合物15（25 mg）和16（20 mg）。B4經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（石油醚-氯仿-甲醇＝5∶5∶1 洗脫）分離純化，再經(jīng)反相HPLC 半制備（C18，5 μm，10 mm×250 mm）色譜，以MeOH-H2O（89∶11）為流動(dòng)相，制備純化得到化合物8（2 mg）。B5經(jīng)硅膠柱色譜 [氯仿-丙酮（0%～100%）]洗脫，得到B5-1～B5-4。B5-2經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜（石油醚-氯仿-甲醇＝5∶5∶1 洗脫）分離純化，得到B5-2-1～B5-2-11，B5-2-3再經(jīng)反相HPLC 半制備（C18，5 μm，10 mm×250 mm） 色譜，以MeOH-H2O（93∶7）為流動(dòng)相，制備純化得到化合物3（1.5 mg）和4（2 mg）。Fr.C（70 g）經(jīng)MCI 凝膠柱色譜（以30%～100%甲醇梯度洗脫），除去色素，分成兩部分C1和C2，C2部分經(jīng)硅膠柱色譜分離（石油醚-乙酸乙酯＝50∶1 洗脫），經(jīng)反相HPLC 半制備色譜（MeOH-H2O＝95∶5 洗脫）分離純化得化合物1（1.0 mg）和2（3.0 mg）。

Fr.D（2.0 g）經(jīng)MCI 凝膠柱色譜（30%～100%甲醇梯度洗脫），分成6 個(gè)部分（D1～D6）。D5部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯體系洗脫）和反相HPLC 半制備色譜（MeOH-H2O系統(tǒng)洗脫）分離純化得到化合物5（2.0 mg）。

Fr.E（15.0 g）經(jīng)MCI 凝膠柱色譜（10%～100%甲醇梯度洗脫）得到5 個(gè)部分（E1～E5）。E1部分經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜（石油醚-氯仿-甲醇＝2∶2∶1）洗脫，分離純化得到化合物19（4.1 mg）。E2部分再經(jīng)反相Flash 柱色譜分離，30%～70%甲醇水溶液洗脫得到3 個(gè)洗脫部分（E2-1～E2-3），E2-1經(jīng)反相HPLC 半制備（C18，5 μm，10 mm×250×250 mm）色譜，以MeOHH2O＝8∶2 為流動(dòng)相，制備純化得到化合物12（1.0 mg）和13（1.1 mg）。E4反復(fù)經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜（石油醚-氯仿-甲醇＝2∶2∶1）洗脫，得到化合物17（4.5 mg）和18（3.0 mg）。E5經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜（石油醚-氯仿-甲醇＝2∶2∶1）洗脫，再經(jīng)反相HPLC 半制備色譜（MeOH-H2O＝58∶42 洗脫）分離純化得到化合物9（1.1 mg）。

Fr.F（25.0 g）經(jīng)MCI 凝膠柱色譜（10%～100%甲醇梯度洗脫），分成5 個(gè)部分（F1～F5）。F3部分經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜（氯仿-甲醇＝5∶1）洗脫，分離純化得到化合物7（5.0 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色結(jié)晶（氯仿）；ESI-MSm/z465 [M＋Na]＋；1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ4.84（2H，s，H-26a，H-27a），4.56（2H，s，H-26b，H-27b），3.25（2H，dd，J＝11.5，4.0 Hz，H-3 和H-21），2.41（2H，d，J＝13.0 Hz，H-5 和H-15），1.97（2H，dt，J＝13.0，5.0 Hz，H-7 和H-15），1.75（2H，m，H-6 和H-16），1.72（2H，m，H-1 和H-19），1.67（2H，m，H-2 和H-20），1.57（2H，m，H-10 和H-18），1.55（2H，m，H-6 和H-16），1.53（2H，m，H-11 和H-12），1.38（2H，m，H-1 和H-19），1.11（2H，m，H-5和H-17），0.99（2H，s，H-23 和H-30），0.76（2H，s，H-24 和H-29），0.64（2H，s，H-25 和H-28）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ37.0（C-1和C-19），28.0（C-2 和C-20），78.9（C-3 和C-21），39.1（C-4 和C-22），54.7（C-5 和C-17），24.0（C-6 和C-16），38.3（C-7 和C-15），148.4（C-8 和C-14），57.6（C-9 和C-13），39.3（C-10和C-18），22.6（C-11 和C-12），28.3（C-23 和C-30），15.4（C-24 和C-29），14.5（C-25 和C-28），106.7（C-26 和C-27）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道的α-芒柄花萜醇數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物1 為α-芒柄花萜醇。

化合物2：白色無(wú)定形粉末；（－）-ESIMSm/z455 [M-H]－；1H NMR（500 MHz，pyridine-d5）δ5.49（1H，brs，H-12），3.46（1H，m，H-3），2.64（1H，m，H-18），1.24（3H，s，H-27），1.23（3H，s，H-26），1.05（3H，s，H-23），1.00（3H，d，J＝6.5 Hz，H-30），1.00（3H，s，H-25），0.95（3H，d，J＝6.0 Hz，H-29），0.88（3H，s，H-24）；13C NMR（125 MHz，pyridine-d5）δ39.2（C-1），28.0（C-2），77.9（C-3），38.9（C-4），55.6（C-5），18.6（C-6），33.4（C-7），39.8（C-8），47.9（C-9），39.2（C-10），17.3（C-11），125.4（C-12），139.1（C-13），42.3（C-14），28.6（C-15），24.7（C-16），47.9（C-17），53.4（C-18），39.3（C-19），37.3（C-20），30.9（C-21），37.1（C-22），28.5（C-23），16.4（C-24），15.5（C-25），17.3（C-26），23.7（C-27），179.9（C-28），23.4（C-29），21.2（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道的熊果酸的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物2 為熊果酸。

化合物3：白色結(jié)晶（氯仿）；ESI-MSm/z455 [M-H]－；1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ3.19（1H，dd，J＝11.0，4.5 Hz，H-3），3.00（1H，ddd，J＝10.0，10.0，6.0 Hz，H-19），0.94（3H，s，H-23），0.75（3H，s，H-24），0.82（3H，s，H-25），0.97（3H，s，H-26），0.98（3H，s，H-27），4.61，4.74（each，1H，brs，H2-29），1.67（3H，s，H-30）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ38.8（C-1），27.4（C-2），79.0（C-3），38.7（C-4），55.3（C-5），19.4（C-6），34.3（C-7），40.7（C-8），50.5（C-9），37.2（C-10），20.8（C-11），25.5（C-12），38.4（C-13），42.4（C-14），30.5（C-15），32.1（C-16），56.2（C-17），46.9（C-18），49.3（C-19），150.4（C-20），29.7（C-21），37.0（C-22），28.0（C-23），15.3（C-24），16.0（C-25），16.1（C-26），14.7（C-27），180.1（C-28），18.2（C-29），109.7（C-30）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的白樺脂酸數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物3 為白樺脂酸。

化合物4： 白色晶體（丙酮），1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ5.14（1H，t，J＝3.5 Hz，H-12），3.53（1H，q，J＝11.0 Hz，H-28），3.24（1H，dd，J＝11.0，5.0 Hz，H-3），3.19（1H，d，J＝11.0 Hz，H-28），1.10（3H，s，Me-27），1.00（3H，s，Me-26），0.98（3H，s，Me-25），0.96（3H，s，Me-23），0.94（3H，d，J＝6.0 Hz，Me-29），0.81（3H，d，J＝5.5 Hz，Me-30），0.79（3H，s，Me-24）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ38.8（C-1），27.2（C-2），79.0（C-3），38.8（C-4），55.2（C-5），18.3（C-6），32.8（C-7），40.0（C-8），47.7（C-9），36.9（C-10），23.4（C-11），125.0（C-12），138.7（C-13），42.0（C-14），26.0（C-15），23.3（C-16），38.0（C-17），54.0（C-18），39.4（C-19），39.4（C-20），30.6（C-21），35.2（C-22），28.1（C-23），15.6（C-24），15.7（C-25），17.3（C-26），23.3（C-27），69.9（C-28），21.3（C-29），16.8（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的熊果醇數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物4 為熊果醇。

化合物5：無(wú)色粉末，ESI-MSm/z：571 [M＋H]＋，593 [M＋Na]＋，569 [M-H]－；1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ6.30（1H，d，J＝1.8 Hz，H-4'），6.25（1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），6.22（2H，d，J＝1.8 Hz，H-2'和H-6'），6.19（1H，d，J＝1.8 Hz，H-4），5.25（1H，m，H-14'），2.88（2H，m，H-7），2.49（2H，m，H-7'），1.67～1.74（4H，m，H-8 和H-8'），1.39～1.60（26H，m，H-9～H-16 和H-9'～H-12'），1.33（2H，m，H-16'），1.31（2H，m，H-13'），0.88（2H，t，J＝7.2 Hz，H-17'），0.85（2H，t，J＝7.2 Hz，H-17）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ149.0（C-1），105.4（C-2），160.1（C-3），101.4（C-4），165.2（C-5），101.4（C-6），34.2（C-7），32.2（C-8），28.8～30.1（C-9～C-14 和C-9'～C-12'），31.9（C-15），22.7（C-16），13.9（C-17），171.7（C＝O），146.0（C-1'），110.8（C-2'和C-6'），156.6（C-3'和C-5'），108.0（C-4'），36.6（C-7'），30.8（C-8'），25.3（C-13'），75.8（C-14'），37.0（C-15'），18.8（C-16'），14.1（C-17'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道的8-（3，5-二羥基苯基）-1-丙基辛醇2，4-二羥基-6-十一烷基苯甲酸酯的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物5 為8-（3，5-二羥基苯基）-1-丙基辛醇2，4-二羥基-6-十一烷基苯甲酸酯。

化合物6：紅色針晶；ESI-MSm/z：283 [MH]－；1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ12.31（1H，s，OH），12.12（1H，s，OH），7.63（1H，s，4-H），7.37（1H，d，J＝2.5 Hz，5-H），7.08（1H，s，2-H），6.69（1H，d，J＝2.5 Hz，7-H），3.94（3H，s，OMe），2.45（3H，s，Ar-CH3）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ165.2（C-1），124.5（C-2），148.4（C-3），121.3（C-4），133.2（C-4a），110.3（C-5），162.5（C-6），106.8（C-7），166.5（C-8），108.2（C-8a），190.8（C-9），113.7（C-9a），182.0（C-10），135.2（C-10a），56.1（OMe），22.2（Me）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道的大黃素甲醚基本一致，確定化合物6 為大黃素甲醚。

化合物7：白色針狀結(jié)晶；ESI-MSm/z433 [M＋Na]＋；在3 種不同展開(kāi)溶劑（氯仿-乙酸乙酯＝4∶1，Rf值為0.5；正己烷-乙酸乙酯＝2∶1，Rf值為0.5；氯仿-甲醇＝40∶1，Rf值為0.7）系統(tǒng)中，其薄層色譜Rf值與對(duì)照品β-谷甾醇一致，確定化合物7 為β-谷甾醇。

化合物8：無(wú)色油狀物；[R]20D＋11（c 0.03，CHCl3）；ESI-MSm/z261 [M＋Na]＋，237 [M-H]－；1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.82（1H，d，J＝1.5 Hz，H-2），6.89（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.78（1H，dd，J＝8.0，1.5 Hz，H-6），4.11（1H，d，J＝10.0 Hz，H-7），2.84（1H，dq，J＝7.5，10.0 Hz，H-8），2.26（3H，s，H3-9'），0.77（3H，d，J＝6.5 Hz，H3-9），3.91（3H，s，OMe-3），3.10（3H，s，OMe-7）；13C NMR（125 MHz，acetone-d6）δ212.1（C-8'），146.9（C-3），145.6（C-4），131.2（C-1），121.2（C-6），113.9（C-5），108.9（C-2），86.3（C-7），56.5（OMe-3），56.0（OMe），53.5（C-8），29.9（C-9'），13.7（C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的（＋）-（7S，8R）-4-羥基-3，7-二甲氧基-1'，2'，3'，4'，5'，6'，7'-降七碳木脂烷-8'-酮的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物8為（＋）-（7S，8R）-4-羥基-3，7-二甲氧基-1'，2'，3'，4'，5'，6'，7'-降七碳木脂烷-8'-酮。

化合物9：無(wú)色膠狀物；（＋）-ESI-MSm/z245[M＋Na]＋；1H NMR（500 MHz，acetone-d6）δ7.05（1H，d，J＝15.1 Hz，H-7），6.44（1H，d，J＝15.1 Hz，H-8），5.89（1H，s，H-4），2.62（1H，d，J＝18.5 Hz，H-2a），2.10（1H，d，J＝18.5 Hz，H-2b），2.40（3H，s，H3-10），1.85（3H，s，H3-13），1.18（3H，s，H3-11），0.96（3H，s，H3-12）；13C NMR（125 MHz，acetone-d6）δ42.0（C-1），50.2（C-2），196.9（C-3），127.9（C-4），167.4（C-5），79.6（C-6），136.9（C-7），131.6（C-8），201.2（C-9），24.5（C-10），23.8（C-11），23.5（C-12），19.5（C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]中報(bào)道的（＋）-去氫催吐蘿芙木醇數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物9為（＋）-去氫催吐蘿芙木醇。

化合物10：白色粉末，ESI-MS 223 [M＋H]＋，245 [M＋Na]＋；1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ1.33（t，J＝7.2 Hz，3H，CH3），3.93（s，3H，ArOCH3），4.26（q，J＝7.2 Hz，2H，CH2），5.83（s，1H，ArOH），6.29（d，J＝16.2 Hz，1H，ArCH＝CH），6.92（d，J＝8.4 Hz，1H，6-ArH），7.08（dd，J＝8.4，1.8 Hz，1H，5-ArH），7.03（d，J＝1.8 Hz，1H，2-ArH），7.61（d，J＝16.2 Hz，ArCH＝CH）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ125.6（C-1），114.7（C-2），148.5（C-3），146.7（C-4），115.7（C-5），123.0（C-6），144.7（C-7），109.3（C-8），178.5（C-9），60.4（C-10），14.4（C-11），55.9（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道的3-羥基-4-甲氧基苯丙烯酸乙酯的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物10 為3-羥基-4-甲氧基苯丙烯酸乙酯。

化合物11：白色粉末；ESI-MS 223 [M＋H]＋，245 [M＋Na]＋；1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ1.33（t，J＝7.2 Hz，3H，CH3），3.93（s，3H，ArOCH3），4.26（q，J＝7.2 Hz，2H，CH2），5.83（s，1H，ArOH），6.29（d，J＝16.2 Hz，1H，ArCH＝CH），6.92（d，J＝8.4 Hz，1H，6-ArH），7.08（dd，J＝8.4，1.8 Hz，1H，5-ArH），7.03（d，J＝1.8 Hz，1H，2-ArH），7.61（d，J＝16.2 Hz，ArCH＝CH）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ127.1（C-1），115.7（C-2），147.9（C-3），146.7（C-4），114.7（C-5），123.0（C-6），144.6（C-7），109.3（C-8），168.0（C-9），60.3（C-10），55.9（-OCH3），14.4（C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20-23]報(bào)道的4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸乙酯ethyl ferulate 的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物11 為4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸乙酯。

化合物12：白色針晶（丙酮）；EIMS 176[M]＋；1H NMR（300 MHz，acetone-d6）δ7.58（1H，d，J＝9.0 Hz，H-4），7.26（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），7.22（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6），6.60（1H，s，H-8），6.54（1H，d，J＝9.0 Hz，H-3），3.58（3H，s，OMe）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的7-甲氧基香豆素的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物12 為7-甲氧基香豆素。

化合物13：黃色無(wú)定形固體；（＋）-ESI-MSm/z223 [M＋H]＋，245 [M＋Na]＋；1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ7.59（1H，d，J＝9.6 Hz，H-4），6.28（1H，d，J＝9.6 Hz，H-3），6.65（1H，s，H-8），3.94（3H，s，OMe-5），3.88（3H，s，OMe-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道的5，7-二甲氧基-6-羥基香豆素的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物13 為5，7-二甲氧基-6-羥基香豆素。

化合物14：白色針晶（氯仿）；ESI-MSm/z197 [M-H]－；1H NMR（300 MHz，acetone-d6）δ7.37（2H，s，H-2，H-6），3.88（6H，s，OMe-2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的4-羥基-3，5-二甲氧基苯甲酸的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物14 為4-羥基-3，5-二甲氧基苯甲酸。

化合物15：白色針狀結(jié)晶（氯仿）；（-）-ESIMSm/z121 [M-H]－；1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ12.40（1H，brs，COOH），8.14（2H，d，J＝7.5Hz，H-2，6），7.63（1H，m，H-4），7.49（2H，m，H-3，5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道的苯甲酸的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物15 為苯甲酸。

化合物16：白色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z123 [M＋H]＋，145 [M＋Na]＋，121 [M-H]－；1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ9.88（1H，s，H-7），7.81（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2，H-6），6.95（2H，d，J＝8.0 Hz，H-3，H-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]報(bào)道的對(duì)羥基苯甲醛的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物16 為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物17：白色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z139 [M＋H]＋，161 [M＋Na]＋；1H NMR（500 MHz，acetone-d6）δ8.08（1H，s，HO-6），7.03（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2，H-6），6.73（2H，d，J＝8.0 Hz，H-3，H-5），3.66（2H，m，H-8），2.69（2H，t，J＝7.5 Hz，H-7），3.57（1H，m，HO-8）；13C NMR（125 MHz，acetone-d6）δ131.0（C-1），130.7（C-2，C-6），115.8（C-3，C-5），156.5（C-4），39.4（C-7），64.2（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]報(bào)道的對(duì)羥基苯乙醇的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物17 為對(duì)羥基苯乙醇。

化合物18：白色針狀結(jié)晶（丙酮）；ESI-MSm/z153 [M-H]－；1H NMR（300 MHz，acetone-d6）δ10.8（1H，s，COOH），9.19（2H，s，OH），7.52（1H，d，J＝1.2Hz，H-2），7.48（1H，dd，J＝8.1，1.2 Hz，H-6），6.89（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]報(bào)道3，4-二羥基苯甲酸的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物18 為3，4-二羥基苯甲酸。

化合物19：白色針狀結(jié)晶（氯仿）；（－）-ESIMSm/z167 [M-H]－；1H NMR（300 MHz，acetone-d6）δ10.82（1H，brs，COOH），8.34（1H，brs，HO-3），7.59（1H，dd，J＝8.5，1.5 Hz，H-6），7.55（1H，d，J＝1.5 Hz，H-2），6.90（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），3.90（3H，s，OCH3）；13C NMR（75 MHz，acetone-d6）δ124.8（C-1），115.5（C-2），148.0（C-3），152.0（C-4），113.4（C-5），122.8（C-6），167.4（C-7），56.3（OMe）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]報(bào)道的3-羥基-4-甲氧基苯甲酸的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物19 為3-羥基-4-甲氧基苯甲酸。

各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 各化合物的結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of compounds

4 生物活性測(cè)定

4.1 神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性篩選

PC12 細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的96 孔板中，密度為每孔3.0×10 個(gè)。培養(yǎng)24 h 細(xì)胞貼壁后，換液，對(duì)照組加入含5%胎牛血清、5%馬血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，模型組加入終濃度為150 μmol·L－1MPP＋的 DMEM 完全培養(yǎng)基，各給藥組在MPP＋模型基礎(chǔ)上加入終濃度為1.0×10－5mol·L－1的化合物1～19（用DMSO配制）；于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入MTT（終濃度0.5 mg·mL－1）再培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀于570 nm 處測(cè)定吸光度（A）。細(xì)胞活力以相對(duì)保護(hù)率評(píng)價(jià)[32]。

相對(duì)保護(hù)率（%）＝[樣品組的OD（光密度）值－模型組OD值]/[對(duì)照組的OD值－模型組的OD值]×100%

測(cè)定化合物1～19 對(duì)MPP＋誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷保護(hù)的影響，結(jié)果表明，在1.0×10－5mol·L－1下，化合物9 對(duì)MPP＋誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷顯示出一定的保護(hù)作用，其相對(duì)保護(hù)率為（76.60±10.67）%。與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4.2 其他生物活性篩選

與此同時(shí)，對(duì)得到的單體化合物分別進(jìn)行了抗氧化[33]、人腫瘤細(xì)胞毒（HCT28、Bel-7402、BGC-823、A549 和A2780 細(xì)胞株）[34]、肝細(xì)胞保護(hù)[35]和抗人類免疫缺陷病毒（HIV）（VsVG/HIV模型）[36]等生物活性篩選。在相同濃度下，所有化合物在藥理模型篩選中均未顯示明顯活性。

5 討論

本研究對(duì)樟科植物粗壯潤(rùn)楠中的化學(xué)成分及其生物活性進(jìn)行探討。首次從該科中分離得到α-芒柄花萜醇和8-（3，5-二羥基苯基）-1-丙基辛醇2，4-二羥基-6-十一烷基苯甲酸酯。并對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行生物活性篩選。在1.0×10－5mol·L－1下，（＋）-去氫催吐蘿芙木醇（9）對(duì)MPP＋誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷顯示出一定的保護(hù)作用，其相對(duì)保護(hù)率為（76.60±10.67）%。下一步應(yīng)通過(guò)更廣泛的生物活性及其作用機(jī)制的深入研究，明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用靶點(diǎn)，為后續(xù)臨床應(yīng)用及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)民間習(xí)用藥材粗壯潤(rùn)楠的藥學(xué)研究及資源開(kāi)發(fā)利用。