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    基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)的二至丸入血入腦成分分析

    2022-11-16 08:49:20林雪薛傲徐艷明孫琪徐紅丹薛慧楊波張寧黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院哈爾濱50040黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院黑龍江佳木斯54007
    中南藥學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:分子離子萜類黃酮類

    林雪,薛傲,徐艷明,孫琪,徐紅丹,,薛慧,楊波*,張寧,*(.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 50040;.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院,黑龍江 佳木斯 54007)

    二至丸由墨旱蓮、女貞子兩味藥組成,具有補益肝腎、滋陰止血的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,二至丸在抗衰老、益智等方面作用顯著[1],能夠治療阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD)[2],但其發(fā)揮藥效的活性成分尚未明確。UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)以其高分辨率、高質(zhì)量精度的特點,在中藥成分定性定量分析領(lǐng)域具有獨特優(yōu)勢[3]。藥物轉(zhuǎn)運到作用部位才能發(fā)揮作用,吸收入血尤其入腦的成分可能是二至丸治療AD 的潛在藥效成分。目前對于二至丸入血入腦成分的研究相對較少,基于此,本實驗運用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)對給予二至丸的D-半乳糖(D-gal)模型大鼠的體內(nèi)成分進行分析,以期闡明二至丸治療AD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 儀器與試藥

    Dionex UltiMate 3000 戴安高效液相色譜儀,Q-Exactive Focus 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司);Bionoon-VAC1型真空濃縮儀(上海般諾生物科技有限公司);Mikro 200R 型離心機(德國 Hettich 公司)。女貞子(酒)、墨旱蓮[北京同仁堂,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)陳效忠副教授鑒定符合2020年版《中國藥典》要求]。HPLC 級甲醇(美國Dikma 公司);HPLC 級乙腈(美國Fisher 公司);HPLC 級甲酸(美國Tedia 公司)。D-gal(上海吉至生化科技有限公司,批號:D96420,純度99%)。紅景天苷(批號:B20504)、特女貞苷(批號:B21240)、木犀草素(批號:A0108)、蟛蜞菊內(nèi)酯(批號:B20934)、芹菜素(批號:B20981)、齊墩果酸(批號:BP1026)(上海源葉生物科技有限公司,純度均大于98%)。

    1.2 動物

    SD 大鼠,雌性,SPF 級,12 只,210~250 g [黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,合格證號SCXK(黑)2018-004]。

    2 方法

    2.1 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 檢測條件

    色譜條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),柱溫35℃,流速0.3 mL·min-1,進樣量5 μL,流動相為0.1%的甲酸-水(A 相)和0.1%的甲酸-乙腈(B 相),梯度洗脫(0~3.5 min,5%~15%B;3.5~6.5 min,15%~30%B;6.5~12.5 min,30%~70%B;12.5~18 min,70%~100%B)。

    質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),采用正、負(fù)離子檢測模式;掃描范圍m/z50~1500 Da;噴霧電壓(+)3.5 kV,(-)3.2 kV;離子傳輸管溫度320℃,AUG 氣體加熱溫度350℃;碰撞能量20、40、60 eV;鞘氣40 psi,輔助氣20 psi,吹掃氣10 psi;RF 鏡頭振幅(s-lens)60;分辨率一級高分辨質(zhì)譜70 000 FWHM,二級高分辨質(zhì)譜17 500 FWHM;動態(tài)排除時間5 s。

    2.2 二至丸樣品及體外對照品溶液的制備

    女貞子(酒)、墨旱蓮1∶1 比例混合,加入10 倍量的水,煎煮2 h,收集濾液,殘渣加等量水繼續(xù)煎煮1 h,過濾后合并濾液,濃縮成1 g·mL-1(以生藥量計)的藥液。取上述藥液適量加70%的甲醇溶液稀釋10 倍,經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾,即得二至丸樣品溶液。

    精密稱定紅景天苷、特女貞苷、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素、齊墩果酸對照品各1 mg于量瓶中,以70%甲醇稀釋10 倍,配成0.1 mg·mL-1的對照品溶液,過0.22 μm 微孔濾膜,即得體外對照品溶液。

    2.3 血液、腦脊液樣品的采集和前處理

    SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,按體質(zhì)量隨機分為模型組、空白組,每組6 只,連續(xù)4 周模型組腹腔注射D-gal 250 mg/(kg·d),空白組腹腔注射等量的生理鹽水。實驗前禁食12 h,正常飲水,模型組灌胃給予二至丸藥液4.86 g·kg-1,給藥后60 min,微量乙醚麻醉,眼底靜脈叢取血,置于肝素化離心管中,3000 r·min-1離心10 min,取上清置-80 ℃冰箱保存。取血后,固定大鼠頭部,75%乙醇對頸后部皮膚消毒,微量輸液針從枕骨大孔刺入小腦延髓池,抽取腦脊液于預(yù)冷的離心管中,3000 r·min-1離心10 min,取上層腦脊液,-80℃冰箱保存。

    取空白血漿和含藥血漿各500 μL 于離心管中,加入2 mL 甲醇,30 μL 乙酸溶液渦旋混合1 min,超聲1 min,13 000 r·min-1離心10 min,取上清液,真空濃縮離心儀1500 r·min-1、40 ℃濃縮至干燥,用150 μL 70%甲醇溶液復(fù)溶,過0.22 μm 微孔濾膜,即得血漿待測樣品溶液。取空白腦脊液和含藥腦脊液各200 μL 于離心管中,加入800 μL 甲醇,渦旋混合1 min,超聲1 min,13 000 r·min-1離心5 min,取上清液,真空濃縮離心儀1500 r·min-1、40 ℃濃縮至干燥,用60 μL 70%甲醇溶液復(fù)溶,過0.22 μm 微孔濾膜,即得腦脊液待測樣品溶液。

    2.4 二至丸成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立及數(shù)據(jù)處理

    在TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)、TCMSP(http://www.tcmsp-e.com/)等中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中檢索二至丸及其單味藥成分結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)補充,對二至丸的化學(xué)成分信息進行整合匯總建立成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)處理采用Xcalibur 軟件,通過分析保留時間、精確分子質(zhì)量、元素組成、同位素豐度和一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖,結(jié)合二至丸成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、Pubchem 數(shù)據(jù)庫、對照品和相關(guān)文獻(xiàn),對化學(xué)成分進行辨識分析。

    3 結(jié)果

    3.1 二至丸入血入腦原形化合物的鑒定

    應(yīng)用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù),在正、負(fù)離子模式下,對二至丸樣品溶液、大鼠血漿和腦脊液中的成分進行檢測,結(jié)果二至丸樣品溶液、血漿和腦脊液總離子流圖見圖1。共發(fā)現(xiàn)原形入血成分25 種,原形入腦成分3 種,見表1。

    表1 二至丸原形入血、入腦原形化合物信息表Tab 1 Information of prototype blood and brain compounds of Erzhi pills

    圖1 正、負(fù)離子模式下二至丸TIC 圖Fig 1 TIC for Erzhi pills in both positive and negative ion modes

    3.2 二至丸入血入腦原形成分解析

    3.2.1 黃酮類化合物 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與雌激素相似,A、B 環(huán)上常被甲基、甲氧基等基團取代。在質(zhì)譜的高強度碰撞過程中,RDA 裂解。CO、CO2等中性分子的丟失是黃酮類化合物的主要裂解特征[20]。實驗中從二至丸給藥血漿中鑒別出黃酮類成分8 個,包括化合物3(20)、4(23)、5(26)、6(28)、7(29)、15、18、24;從給藥腦脊液中鑒別出黃酮類成分1 個,為化合物5(26)。以化合物26(5)和化合物28(6)為例來說明黃酮類化合物的鑒定過程?;衔?6(5)保留時間8.52 min,準(zhǔn)分子離子峰m/z285.0401 [M-H]-,軟件推測分子式為C15H10O6,主要碎片離子包括m/z151.00 和m/z133.03,是準(zhǔn)分子離子峰m/z285.04通過黃酮類化合物的特征性裂解方式RDA 裂解得到的。與文獻(xiàn)報道[9]基本一致,故將其鑒定為木犀草素,二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖2。化合物28(6)保留時間為9.26 min,準(zhǔn)分子離子峰m/z269.0452 [M-H]-,軟件推測分子式為C15H10O5,主要碎片離子包括m/z225.06、201.06、181.06、159.04、117.03 等,其中m/z225.06 是準(zhǔn)分子離子峰失去一個中性的CO2分子所得,進而再失去一個CO2得到m/z181.06 碎片離子。m/z201.06 離子是準(zhǔn)分子離子峰丟失C3O2后經(jīng)氫重排所得,但其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定易丟失C2H2O 形成穩(wěn)定的具有共軛結(jié)構(gòu)的離子m/z159.04,m/z159.04 又可丟失C2H2O 生成碎片離子m/z117.03,碎片信息與文獻(xiàn)報道[9]基本一致,故將其鑒定為芹菜素,二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖3。

    圖2 木犀草素二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 2 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of luteolin

    圖3 芹菜素二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 3 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of apigenin

    3.2.2 香豆素類化合物 香豆素類化合物結(jié)構(gòu)與雌二醇相似,結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯和呋喃骨架容易發(fā)生CO2和CO 的中性丟失[17]。從二至丸給藥血漿中鑒別出香豆素類成分2 個,即化合物22 和27;從給藥腦脊液中鑒別出香豆素類成分1 個,為化合物27。以化合物27 為例,說明香豆素類化合物的鑒定過程?;衔?7 保留時間為8.78 min,軟件得到準(zhǔn)分子離子峰為m/z313.0351[M-H]-,推測分子式為C16H10O7,質(zhì)譜掃描獲得碎片離子m/z298.01、270.02、254.02 等,分別是準(zhǔn)分子離子峰依次丟失CH3、CO、CO2所得,與文獻(xiàn)報道[17]基本一致,故將其鑒定為蟛蜞菊內(nèi)酯,二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖4。

    圖4 蟛蜞菊內(nèi)酯二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 4 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of wedelolactone

    3.2.3 苯乙醇苷類化合物 苯乙醇苷是一類以取代苯乙醇為苷元的苷,其成苷的中心葡萄糖基常連有芳香?;鵞10]。實驗從二至丸給藥血漿中鑒別出苯乙醇苷類化合物2 個,即化合物10 和11;從給藥腦脊液中亦鑒別到化合物11?;衔?1 保留時間為3.39 min,準(zhǔn)分子離子峰為m/z299.1153 [M-H]-,軟件推測分子式為C14H20O7,質(zhì)譜掃描得到碎片離子m/z179.05 和m/z119.05,分別為葡萄糖基碎片和酪醇-OH 的碎片離子,與文獻(xiàn)報道[10]基本一致,故鑒定其為紅景天苷,二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖5。

    圖5 紅景天苷二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 5 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of salidroside

    3.2.4 萜類化合物解析 萜類以異戊二烯單位(C5單位)為基本骨架[8],根據(jù)分子中C5單位的數(shù)量分為單萜、二萜、三萜等,在二至丸給藥血漿中共鑒別出萜類化合物3 種,即化合物1、8(30)、31。以化合物30 為例,說明萜類化合物的鑒定過程?;衔?0 保留時間為16.45 min,準(zhǔn)分子離子峰m/z455.3531 [M-H]-,軟件推測分子式為C30H48O3,m/z391.23 是準(zhǔn)分子離子峰失去一分子H2O 和HCOOH 得到的離子碎片,與文獻(xiàn)報道[8]基本一致,故將其鑒定為齊墩果酸,二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖6。

    圖6 齊墩果酸二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 6 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of oleanolic acid

    3.2.5 裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物 環(huán)戊并吡喃是裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物的特征結(jié)構(gòu),在質(zhì)譜碰撞過程中該結(jié)構(gòu)的鍵會發(fā)生斷裂。裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物側(cè)鏈上的官能團也常以CH3OH、H2O、CO2和糖分子的形式丟失[9]。在二至丸給藥血漿中共鑒別出裂環(huán)環(huán)烯醚萜類化合物3 種,即化合物16、19、21?;衔?1 保留時間為7.03 min,準(zhǔn)分子離子峰為m/z685.5621 [M-H]-,推測其分子式為C31H42O17,質(zhì)譜掃描獲得主要離子碎片包括m/z523.18、453.14、421.15 等。準(zhǔn)分子離子峰失去一分子C4H6O 產(chǎn)生m/z453.14 碎片,再失去一分子CH3OH 得到m/z421.15 碎片,m/z453.14、m/z421.15 及分子離子峰失去一分子葡萄糖得到的m/z523.18 碎片都是裂環(huán)環(huán)烯醚萜類裂解的典型片段。與文獻(xiàn)報道[9]基本一致,故將其鑒定為特女貞苷,二級碎片離子和可能的裂解途徑見圖7。

    圖7 特女貞苷二級碎片離子和可能的裂解途徑Fig 7 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of nuezhenide

    4 討論

    多成分、多靶點是二至丸復(fù)方體系的重要特點,也給二至丸治療AD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究帶來了挑戰(zhàn)。經(jīng)典復(fù)方體系研究往往以體外成分為研究對象[13],血漿等內(nèi)環(huán)境對中藥復(fù)方成分的影響就很容易被忽視。因此,實驗采用具有較強分離、檢測能力的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)對二至丸的入血入腦成分進行檢測。二至丸成分復(fù)雜多樣,在血漿和腦脊液的復(fù)雜體系影響下更容易發(fā)生改變,為了最大程度獲取樣品中化合物的質(zhì)譜信息,實驗采用了正、負(fù)兩種離子化采集模式。結(jié)果在給藥血漿中鑒定出黃酮類、香豆素類、苯乙醇苷類、三萜類等多種類型的成分,研究發(fā)現(xiàn)黃酮類成分木犀草素和芹菜素都具有促進神經(jīng)元修復(fù)和再生的神經(jīng)保護作用[21-22]。香豆素類成分蟛蜞菊內(nèi)酯具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙從而保護神經(jīng)退行性病變的作用[23]。苯乙醇苷類成分紅景天苷對大腦神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)作用也不容忽視,神經(jīng)元突觸的活性依賴降低能夠被其抑制[24]。Guo 等[25]研究發(fā)現(xiàn)三萜類成分齊墩果酸能夠調(diào)節(jié)亞錫鈣蛋白-1 和解偶聯(lián)蛋白-2信號而緩解AD 中的氧化應(yīng)激和Aβ沉積。Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)裂環(huán)環(huán)烯醚萜類成分梔子苷能夠下調(diào)mTOR 信號,使Aβ纖維的自噬和溶酶體清除增強。酚酸類成分原兒茶酸和咖啡酸也被證實具有改善神經(jīng)炎癥[27],減少Aβ聚集[28],進而改善AD 學(xué)習(xí)記憶障礙的藥理作用。此外,在給藥腦脊液中還鑒定出木犀草素、紅景天苷、蟛蜞菊內(nèi)酯3 種成分,提示它們對改善D-gal 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的過程中的貢獻(xiàn)可能更大。

    目前,關(guān)于二至丸發(fā)揮改善D-gal 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的具體作用機制和代謝途徑研究還不明確,在后續(xù)研究中,作者將進一步考察這些入血尤其是入腦成分的生物活性和代謝途徑,并進行血液和腦脊液的藥動學(xué)監(jiān)測,明確具體的量效關(guān)系,為更好地闡明體二至丸治療AD 的體內(nèi)藥效物質(zhì)和作用機制提供實驗依據(jù)。

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