乙型腦炎病毒疫苗研究進(jìn)展

張福良，馬圣明，邢月騰，曹金澤，劉 芳

（安陽工學(xué)院，河南 安陽 455000）

作為一種疫苗可預(yù)防的疾病，世衛(wèi)組織建議在乙型腦炎構(gòu)成公共衛(wèi)生問題的所有國家（地區(qū)）進(jìn)行常規(guī)免疫接種，并竭力實(shí)現(xiàn)最高的疫苗接種覆蓋率。Amicizia等，Sunwoo等和Yang等的研究表明在成功開展了針對兒童的乙型腦炎疫苗接種的國家中，發(fā)病率顯著下降[1-3]。實(shí)際上，Campbell等調(diào)查顯示在建立了高質(zhì)量疫苗接種程序的國家（例如日本和韓國）中，該疾病的發(fā)病率估計(jì)為每10萬人0.003，而在疫苗接種覆蓋率不足的地區(qū)（例如柬埔寨、印度尼西亞和馬來西亞）發(fā)病率為每10萬人中3.7[4]。目前全球范圍內(nèi)使用的乙腦疫苗主要有三種：鼠腦滅活疫苗、細(xì)胞滅活疫苗和乙腦減毒活疫苗。鼠腦滅活疫苗曾是生產(chǎn)最廣泛、國際上應(yīng)用最廣的疫苗，但是由于擔(dān)心疫苗的不良影響（包括急性擴(kuò)散性腦脊髓炎）而不再使用。

1 鼠源性乙腦滅活疫苗

20世紀(jì)50年代日本成功研制了全球第一種乙型腦炎病毒鼠腦疫苗，系由JEV中山株（Nakayama strain）感染小鼠大腦而產(chǎn)生的滅活疫苗(JE-VAX; Biken Institute)，也是目前惟一獲得WHO批準(zhǔn)并且商品化的人用乙型腦炎滅活疫苗。Heffelfinger等和Ishikawa等指出在幾個(gè)亞洲國家的全國疫苗接種計(jì)劃中實(shí)施以后可以產(chǎn)生大約90%防控效果，使得日本腦炎感染率明顯減少[5-6]。1989年以來，又生產(chǎn)了另一種基于Beijing-1株的小鼠乙型腦炎病毒滅活疫苗，該疫苗可以引發(fā)更強(qiáng)和更廣的保護(hù)性免疫應(yīng)答。但這些疫苗也產(chǎn)生一些常見的不良反應(yīng)，如紅斑、腫脹、壓痛、發(fā)熱、頭痛和頭暈等，且被懷疑與嚴(yán)重急性彌漫性腦脊髓炎和超敏反應(yīng)有關(guān)；此外由于生產(chǎn)成本高、缺乏長期免疫效果，在急需疫苗的貧困農(nóng)村地區(qū)不實(shí)用，因而促使了更安全的疫苗的開發(fā)，例如滅活的Vero細(xì)胞培養(yǎng)衍生疫苗和減毒活疫苗。出于安全考慮，2005年日本政府暫時(shí)取消了使用滅活的小鼠腦滅活疫苗進(jìn)行常規(guī)免疫的建議，同時(shí)建議新一代疫苗逐漸取代滅活的小鼠腦源性疫苗。

2 細(xì)胞源性乙腦滅活疫苗

通過更加嚴(yán)格的生產(chǎn)過程生產(chǎn)的細(xì)胞源性乙腦滅活疫苗已經(jīng)取代組織滅活疫苗。迄今為止，已經(jīng)生產(chǎn)了不同的細(xì)胞培養(yǎng)來源的滅活疫苗。其中，基于減毒乙型腦炎疫苗株SA 14-14-2適應(yīng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)的以氫氧化鋁為佐劑、甲醛滅活的IC51疫苗（Valneva Scotland Limited生產(chǎn)，美國和歐洲命名為IXIARO?，澳大利亞和新西蘭命名為JESPECT?）于2009年首次獲得許可，并通過技術(shù)協(xié)議轉(zhuǎn)讓給Biological E Limited于2012年在印度以JEEV?的身份獲得許可，此后在其他亞洲國家也獲得許可。IXIARO?疫苗是唯一在美國和歐洲獲得許可并可以購買的日本腦炎疫苗，已被批準(zhǔn)用于2個(gè)月以上的兒童。初次接種疫苗采取間隔28天肌注兩次，對于有疾病風(fēng)險(xiǎn)的成年人，建議在初次免疫后第二年內(nèi)增加劑量，2個(gè)月至36個(gè)月的兒童劑量減半。

其他基于Vero細(xì)胞生產(chǎn)的滅活疫苗包括Beijing-1疫苗株滅活疫苗（Biken公司生產(chǎn)的JEBIK?V 和 Kaketsuken生產(chǎn)的 ENCEVAC?在日本獲得許可）、Beijing P3株滅活疫苗（JEVAC?，遼寧成大生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，在中國獲得許可）以及印度乙型腦炎病毒基因III型Kolar-821564XY株（JENVAC?，Bharat Biotech制造并在印度獲得許可）。這些疫苗目前在國際上的使用分布有限，IC51疫苗（IXIARO?）已經(jīng)獲得有關(guān)安全性和免疫原性的大量數(shù)據(jù)。Roberts等對疫苗3期試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)指出，IC51具有非常好的安全性，類似于安慰劑[7]。Erra在成人和兒童中的臨床試驗(yàn)中還表明，接種兩倍劑量IC51疫苗可誘導(dǎo)針對JEV基因型I-IV的高中和抗體滴度和高血清轉(zhuǎn)化率[8]。Pato等研究表明在成年人中，初次免疫后觀察到疫苗保護(hù)作用會逐漸下降，基礎(chǔ)免疫1～2年后給予加強(qiáng)免疫可導(dǎo)致中和抗體滴度明顯提升，并且加強(qiáng)免疫后6年以內(nèi)＞ 95%的病例存在持續(xù)保護(hù)性免疫[9]。Okada等對JEBIK?V和ENCEVAC?疫苗的研究表明成人單劑注射后血清轉(zhuǎn)化率為86.8%，三劑接種后兒童血清轉(zhuǎn)化率為100%[10]。據(jù)Yun等報(bào)道，約有14%的病例發(fā)生了嚴(yán)重的不良事件，但與疫苗本身無關(guān)，只是發(fā)生了一次高熱驚厥[11]。Liu 等指出在中國，1967年開始生產(chǎn)和使用基于倉鼠原代腎細(xì)胞（Primary hamster cell，PHK）培養(yǎng)生產(chǎn)的滅活疫苗，使用的是乙型腦炎病毒北京P3毒株，副作用相對較小且容易制造，療效在76%到90%之間[12]。

3 SA 14-14-2減毒活疫苗

減毒活疫苗似乎真正給乙型腦炎病毒疫苗開發(fā)帶來了廣闊前景，因?yàn)榛畈《绢w粒建立疫苗免疫應(yīng)答所需的病毒劑量更少，也使得疫苗價(jià)格更便宜，這使得乙型腦炎防控更容易。20世紀(jì)80年代，一種基于SA 14-14-2毒株的減毒活疫苗開始在中國以及隨后在亞洲其他國家被開發(fā)并批準(zhǔn)用于人類，其商品名為CD.JEVAX?（成都生物制品研究所，中國）。Yu等證明 SA 14-14-2減毒株被具有遺傳穩(wěn)定性、高度免疫原性，在小鼠中無神經(jīng)毒力并且在蚊子中不能復(fù)制[13]。Gromowski等研究指出SA14-14-2毒株致弱的分子基礎(chǔ)可能是E蛋白中的6個(gè)氨基酸和NS基因中的3個(gè)氨基酸突變造成[14]。

自從獲得許可以來，已經(jīng)有數(shù)百萬人接種了減毒活SA 14-14-2疫苗，該疫苗已在中國廣泛使用，根據(jù)國家疫苗接種計(jì)劃的建議，該疫苗適用于8月齡的兒童，2歲時(shí)加強(qiáng)劑量接種。韓國（自1999年起）、尼泊爾（自2001年起）、印度（自2006年起）和泰國（自2007年起）也已推薦使用該疫苗。由于減毒SA 14-14-2活疫苗具有很高的免疫原性，因此一些國家在國家疫苗接種計(jì)劃中加入了單一劑量的疫苗。

Torresi等指出在中國、尼泊爾和韓國的兒童中進(jìn)行的臨床試驗(yàn)表明，即使在單劑量接種后，這種減毒活疫苗也具有很高的免疫原性和功效，在中國成人和兒童中，血清轉(zhuǎn)化率在94%至100%之間，功效為85～98%[15]。此外，Ohrr等證明對以前接受過兩劑和三劑滅活的鼠腦滅活疫苗的兒童接種的SA 14-14-2減毒疫苗是安全的，可顯著提高抗體水平[16]。

4 嵌合減毒活疫苗

一 種 名 為 IMOJEV?或JE-CV（Chimer VAX?-JE, Sanofi Pasteur, France）的基因工程減毒活疫苗，已于2010年首次注冊并在多個(gè)國家獲得了用于兒童和成人預(yù)防日本腦炎的許可證。該疫苗毒株是用SA 14-14-2疫苗株的prM-E基因替換了黃熱病病毒（Yellow fever virus, YFV）疫苗株YFV-17D的相應(yīng)基因。Guirakhoo和Monath等研究證實(shí)這種嵌合疫苗在遺傳上穩(wěn)定，在小鼠和非人類靈長類動物接種后可以誘導(dǎo)免疫保護(hù)[17-18]。Chokephaibulkit等進(jìn)一步研究證明毒株致弱的分子基礎(chǔ)是JEV SA 14-14-2毒株的E蛋白包含至少四個(gè)氨基酸殘基的突變，這是病毒神經(jīng)毒力表型所必需的[19]。

Feroldi等在對成人和兒童進(jìn)行的幾項(xiàng)II期和III期研究中證明了嵌合毒株的免疫原性和安全性，特別是疫苗免疫原性的隨機(jī)對照III期研究表明，在接種后28天，成人和兒童單劑量接種這種嵌合疫苗誘導(dǎo)的血清轉(zhuǎn)化率分別大于99%和95%。此外，當(dāng)將嵌合疫苗作為一種強(qiáng)化疫苗接種之前已經(jīng)接種過一次滅活疫苗或減毒疫苗的兒童時(shí)，乙腦嵌合疫苗是有效的。加強(qiáng)疫苗接種誘導(dǎo)的中和和交叉中和抗體對不同野生型的JEV基因型I-IV株具有保護(hù)作用，95.7%和97.9%的病例免疫后持續(xù)5年以上[20]。

5 其他疫苗

目前，幾種候選疫苗仍處于研發(fā)的各個(gè)階段，主要包括：重組蛋白疫苗、重組/嵌合病毒疫苗和DNA疫苗等?；旧?，所有這些疫苗都含有JEV E糖蛋白，該蛋白具有大多數(shù)病毒中和表位，是較好的免疫原。

5.1 基于重組蛋白的乙型腦炎病毒疫苗

已知乙型腦炎病毒的E蛋白對于諸如受體結(jié)合和融合的各種功能很重要，并且能夠誘導(dǎo)免疫保護(hù)。該蛋白質(zhì)在不同的表達(dá)系統(tǒng)中以多種形式表達(dá)，在以小鼠為動物模型試驗(yàn)中中測試了E蛋白的免疫原性，其中，大腸桿菌和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是常用于此目的的兩種表達(dá)載體。

5.2 基于重組病毒的乙型腦炎病毒疫苗

重組病毒在疫苗開發(fā)中很重要，已經(jīng)使用了許多重組病毒，每個(gè)重組病毒都有自己獨(dú)特的功能。能夠同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答是所有重組/嵌合疫苗的共同特征。在重組病毒策略中，外源性抗原以類似于自然感染的方式被宿主免疫系統(tǒng)呈遞并加工，許多病毒已用于生產(chǎn)乙型腦炎病毒疫苗，包括痘病毒、麻疹病毒、腺病毒、黃熱病毒。

5.3 DNA疫苗

近年來，質(zhì)粒DNA疫苗由于能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的免疫應(yīng)答而受到了廣泛關(guān)注，包括誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生、產(chǎn)生CD4+輔佐細(xì)胞和CD8+CTL以及對一系列病毒感染提供保護(hù)。此外，質(zhì)粒DNA疫苗也是有效的、安全的、且易于生產(chǎn)，并且不會干擾其他黃病毒或疫苗載體已經(jīng)存在的抗體。在質(zhì)粒DNA疫苗免疫中，將編碼有效抗原或其部分的DNA置于細(xì)菌質(zhì)粒之中，該質(zhì)粒在強(qiáng)真核啟動子的控制下通過不同的途徑（如肌肉或皮下）給藥，然后將質(zhì)粒內(nèi)吞，由MHC-I類分子進(jìn)行內(nèi)源性抗原呈遞產(chǎn)生CD8+ CTL反應(yīng)；除此之外，APC對可溶性抗原的攝取還導(dǎo)致通過MHC-II類分子呈遞產(chǎn)生CD4+Th反應(yīng)。在過去的幾年中，已經(jīng)開發(fā)出使用結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)基因的針對乙型腦炎病毒的DNA疫苗，并已在具有不同功效的動物模型中對其進(jìn)行了評估。

1998年首個(gè)乙型腦炎病毒質(zhì)粒DNA疫苗產(chǎn)生，命名為pcDNA3JEME，其中整合了病毒的E基因和PrM基因，Konishi等證明免疫小鼠后產(chǎn)生了中和抗體，其中70%的小鼠在致死性挑戰(zhàn)后存活下來，CTL和B細(xì)胞反應(yīng)均被激活，并在免疫小鼠的脾細(xì)胞中持續(xù)長達(dá)6周[21]。后來，Chai等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)單次肌肉注射可提供保護(hù)作用，從而保護(hù)小鼠免受致命性攻擊[22]。Ashok等評估缺少信號肽的編碼E蛋白的DNA疫苗的免疫原性實(shí)驗(yàn)表明，在不產(chǎn)生抗病毒抗體的情況下，可以保護(hù)免疫復(fù)合物免受攻擊[23]。Kaur等進(jìn)一步試驗(yàn)表明顆粒形式的質(zhì)粒DNA可以增強(qiáng)的小鼠免疫原性[24]。

盡管各種針對乙型腦炎病毒的疫苗開發(fā)方法已經(jīng)進(jìn)行了嘗試，這些針對乙型腦炎病毒的新型疫苗雖然在實(shí)驗(yàn)室中顯示出了良好前景，但遺憾的是，它們在臨床中均尚未成功，因此，還需要對此進(jìn)行進(jìn)一步深入、詳盡的評價(jià)。

目前，乙型腦炎病毒疫苗接種策略和深入的研究是未來開發(fā)成功的乙型腦炎病毒疫苗所需要的，Kumar等提出了乙型腦炎病毒疫苗開發(fā)戰(zhàn)略流程（圖1）[25]。此外，還需要廣泛的關(guān)注和探索一些新的候選疫苗，迫切需要開發(fā)新一代疫苗，以有效地防控乙型腦炎。

圖1 JEV疫苗開發(fā)戰(zhàn)略流程[25]