人參皂苷Rg3抗肝癌作用研究進(jìn)展

唐琳琳 李洪英 劉文山 丁傳華

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，濰坊 261031

2018年GLOBOCAN 數(shù)據(jù)顯示，全球肝癌發(fā)病率位居惡性腫瘤第6 位，病死率位居惡性腫瘤第2 位［1］。中晚期肝癌患者中位生存期短，對(duì)化療藥物耐藥性高，推薦中醫(yī)中藥輔助肝癌的治療［2］。人參皂苷Rg3（Ginsenoside Rg3，GRg3）是從五加科植物人參、西洋參、三七等根莖、莖葉提取的天然產(chǎn)物［3］，具有抗腫瘤、逆轉(zhuǎn)腫瘤靶向藥物耐藥等活性，對(duì)常見(jiàn)惡性腫瘤肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌均有抑制作用［4］。2003年以GRg3單體為主要成分的抗癌新藥參一膠囊上市，應(yīng)用于肺癌、肝癌的輔助治療。本文主要闡述GRg3治療肝癌的臨床前及臨床研究進(jìn)展，以期對(duì)后續(xù)研究提供參考。

GRg3的來(lái)源

1983年日本學(xué)者從朝鮮紅參中第1 次分離得到GRg3，它是一種四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型稀有人參皂苷，在人參、西洋參、三七根和根莖中含量較少，在陳年參、人參莖葉、炮制的紅參及黑參中含量較高。按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類屬于原人參二醇型皂苷，結(jié)構(gòu)式為C42H72O13，相對(duì)分子質(zhì)量為784。天然人參皂苷Rb1、Rb2和Rd經(jīng)過(guò)加熱、酶解可轉(zhuǎn)化為GRg3［5］。由于C20 位空間結(jié)構(gòu)不同，GRg3 存在兩種對(duì)映體，即20（S）和20（R）異構(gòu)體。20（S）-Rg（3）和20（R）-Rg3 三級(jí)結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致20（S）-Rg3 抗腫瘤活性優(yōu)于20（R）-Rg3［6］。與20（R）-Rg3 相比，20（S）-Rg3 可明顯抑制HepG2 細(xì)胞增殖及凋亡［7-8］。20（S）-Rg3苷元部分的烯烴鏈在C20附近產(chǎn)生緊密的疏水堆積，促進(jìn)了其與Ca2+、Na+離子通道和幾種配體門控離子通道間的氫鍵結(jié)合，使其與離子通道受體區(qū)相互作用更強(qiáng)［9］。

GRg3抗肝癌作用研究

1、GRg3抗肝癌作用臨床前研究

1.1、體外實(shí)驗(yàn) 體外實(shí)驗(yàn)顯示，GRg3 可抑制多種肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括Hep3B、SMMC-7721、HepG2、Bel-7402、HCCLM3、SK-Hep1、SMC-7721、MHCC-97 細(xì)胞，抑制作用呈濃度依賴性和劑量依賴性［10-17］。

1.2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 體內(nèi)研究顯示GRg3 能顯著抑制肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)［12-14］。Sun等［12］在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GRg3 可顯著抑制HepG2 和MHCC-97L 在BABL∕c 裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。將肝癌細(xì)胞Hep1-6 植入小鼠肝臟構(gòu)建原位肝癌模型?？诜礼Rg3（10 mg·kg-1·d-1，連續(xù)30 d）顯著降低原位肝癌的生長(zhǎng)，提高荷瘤小鼠的存活率和存活時(shí)間［13］。另一項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，20（R）-Rg3 比20（S）-Rg3 對(duì)H22 移植瘤生長(zhǎng)的抑制率更顯著，抑制率分別為40.9%和23.6%。GRg3 可通過(guò)刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖及升高白細(xì)胞介素-2 和干擾素-γ 水平顯著增強(qiáng)H22 荷瘤小鼠的細(xì)胞免疫功能［14］。

GRg3 增敏化療藥物抗癌效果。肝癌中位生存期較短，對(duì)化療藥物耐藥性高。研究表明，GRg3、奧沙利鉑單藥或兩藥聯(lián)合均能有效抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖，促進(jìn)其凋亡，兩藥聯(lián)合組效果比單藥組更顯著［15］。體外實(shí)驗(yàn)顯示GRg3 通過(guò)抑制自噬通量增敏阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)GRg3 與阿霉素聯(lián)合用藥可顯著抑制Huh-7 細(xì)胞移植裸鼠腫瘤體積［16］。Jiang 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，GRg3 以劑量和時(shí)間依賴性方式抑制肝癌細(xì)胞Hep1-6 和HepG2 的活力。用荷瘤C57BL∕6 小鼠做生存實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組比較，GRg3、環(huán)磷酰胺、GRg3+環(huán)磷酰胺實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)速度延遲，明顯延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間。腫瘤HE染色顯示，對(duì)照組腫瘤呈浸潤(rùn)生長(zhǎng)，血流豐富，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞染色質(zhì)固縮、凝集，失去血供。

1.3、GRg3聯(lián)合肝動(dòng)脈栓塞技術(shù)可顯著改善療效 經(jīng)動(dòng)脈栓塞術(shù)（transcatheter arterial embolization，TAE）是一種用栓塞劑堵塞肝腫瘤供血?jiǎng)用}的微創(chuàng)技術(shù)［18］。肝細(xì)胞癌經(jīng)TAE 治療可阻斷肝癌動(dòng)脈血供，促進(jìn)肝癌組織的壞死、缺氧，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）上調(diào)和血管生成增加［19］。構(gòu)建肝細(xì)胞癌大鼠原位移植模型，分為對(duì)照組、GRg3、TAE 組、GRg3+TAE 組。GRg3+TAE 組治療8周后，腫瘤長(zhǎng)徑明顯短于對(duì)照組。GRg3+TAE 組和GRg3 組肝內(nèi)和腹腔轉(zhuǎn)移率明顯低于對(duì)照組。GRg3+TAE 組總生存率優(yōu)于TAE 組，微血管密度顯著低于TAE 組。GRg3+TAE 組VEGF 和VEGF 受體表達(dá)明顯減少，GRg3+TAE 治療通過(guò)下調(diào)VEGF 的表達(dá)抑制肝癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)大鼠生存期［20］。

一項(xiàng)研究觀察TAE 聯(lián)合肝動(dòng)脈給藥GRg3 治療兔VX2肝腫瘤效果。結(jié)果顯示，肝動(dòng)脈給藥增加GRg3局部濃度，TAE 聯(lián)合GRg3組平均腫瘤體積和生長(zhǎng)速率明顯低于對(duì)照組。GRg3 可抑制腫瘤缺血缺氧引起的血管生成活性，誘導(dǎo)VX2 肝腫瘤細(xì)胞凋亡，是一種安全有效的治療兔VX2 肝腫瘤的方法［21］。

1.4、GRg3特殊制劑抗肝癌作用研究 GRg3在水中溶解度小，生物利用度低，限制了其在臨床的應(yīng)用。為改善GRg3溶解度，增加抗腫瘤活性，針對(duì)GRg3的特殊制劑研究越來(lái)越多，如納米制劑、脂質(zhì)體等［22-24］。制備GRg3-mPEG-PLLA（甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，mPEG-PLLA）共聚物載藥膠束，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，該載藥膠束可顯著抑制肝癌HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)及肝癌異種移植裸鼠腫瘤體積增加，提高了GRg3的溶解度及生物活性［25］。GRg3 與Fe@Fe3O4納米顆粒偶聯(lián)制備納米藥物，與GRg3相比，納米GRg3可顯著延長(zhǎng)原位肝癌小鼠的生存時(shí)間，明顯減少肝臟表面腫瘤數(shù)量和腫瘤長(zhǎng)徑、減少肝癌的肺轉(zhuǎn)移［22］。采用薄膜分散法制備Rg3 脂質(zhì)體，包封率為82.47%。與GRg3 溶液相比，GRg3 脂質(zhì)體組的峰值濃度（Cmax）和曲線下面積（AUC）分別增加1.19 倍和1.52 倍。GRg3 脂質(zhì)體組對(duì)HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞毒性和抑制率明顯高于GRg3組［24］。

2、GRg3（參一膠囊）抗肝癌的臨床研究

一項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)，觀察肝癌合并門靜脈癌栓患者手術(shù)后，分別給予GRg3（一次20 mg，2 次∕d）、索拉非尼（每次400 mg，2 次∕d）口服，對(duì)遠(yuǎn)期生存時(shí)間、術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間的影響。GRg3 組共31 人，索拉菲尼組共33 人，術(shù)后無(wú)瘤中位生存時(shí)間分別為8 個(gè)月和9 個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后中位生存時(shí)間12 個(gè)月和14 個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GRg3 遠(yuǎn)期抗腫瘤作用弱于索拉菲尼，建議肝癌合并門靜脈癌栓手術(shù)后服用索拉菲尼，經(jīng)濟(jì)條件限制的患者建議口服GRg3［26］。

一項(xiàng)比較GRg3 聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）和單獨(dú)TACE 治療晚期肝癌的有效性和安全性臨床試驗(yàn)。228 例晚期肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者被隨機(jī)分配到兩個(gè)治療組。GRg3 聯(lián)合TACE 組的中位總生存期為13.2 個(gè)月，TACE 組為10.1 個(gè)月，中位進(jìn)展時(shí)間分別為4.3 個(gè)月比3.2 個(gè)月（P=0.151），不可治療進(jìn)展的中位時(shí)間分別為8.3 個(gè)月、7.3 個(gè)月（P=0.063）。GRg3 聯(lián)合TACE 組腫瘤控制率為69.7%，TACE 組為51.3%（P=0.012）。GRg3 緩解了一些與TACE 相關(guān)的不良綜合征和血液異常。在肝功能良好的晚期HCC 患者中，GRg3 聯(lián)合TACE 較單獨(dú)TACE 可延長(zhǎng)患者的總生存期［27］。

GRg3抗肝癌的作用機(jī)制

1、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡

體內(nèi)外研究表明，GRg3可誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡［15，28-30］。Park等［10］研究發(fā)現(xiàn)GRg3明顯抑制Hep3B細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。GRg3 通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平，激活Bax蛋白，下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，降低了線粒體膜電位，刺激Hep3B細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素c的釋放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3 的激活，直接激活線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。針對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2細(xì)胞系研究中［31］，GRg3 給藥組的細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著高于對(duì)照組，并且細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率隨著GRg3濃度和治療時(shí)間的增加而增加。機(jī)制方面，GRg3 組與對(duì)照組相比，肝癌細(xì)胞促調(diào)亡基因Bax 和caspase-3 的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平顯著抑制，推測(cè)也是通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，GRg3作用于HepG2細(xì)胞后觀察到細(xì)胞凋亡和線粒體腫脹和裂解，劑量依賴性方式下 調(diào)Bcl-2 和 上 調(diào)Fas［8］。GRg3 通 過(guò) 影 響 凋 亡 相 關(guān) 基 因Bcl-2-caspase9-caspase3 和PI3K∕AKT∕mTOR 信號(hào)通路誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡［32］。Zhang 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，20（S）-Rg3 使膽囊癌細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低，證明20（S）-Rg3 誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡是通過(guò)線粒體途徑來(lái)發(fā)揮作用的。鈉氫交換蛋白-1（Na+∕H+exchanger1，NHE1）調(diào)節(jié)細(xì)胞間pH 值，在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，促進(jìn)肝癌的惡化，抑制NHE1 可促進(jìn)肝癌凋亡［33］?；隗w內(nèi)外研究，觀察到GRg3可以通過(guò)降低NHE1 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞Bel-7402、HCCLM3 增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子可以上調(diào)NHE1 的表達(dá)，而GRg3 正是通過(guò)抑制EGF-EGFR-ERK1∕2-HIF-1α 途徑來(lái)降低NHE1的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［34］。

外源性凋亡途徑又稱為死亡受體途徑，20（S）-Rg3 對(duì)外源性途徑誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞調(diào)亡具有增敏作用。TRAIL 信號(hào)通路因?qū)δ[瘤細(xì)胞的選擇毒性，成為抗癌藥物研究的靶點(diǎn)，但耐藥性限制了TRAIL 的研發(fā)。研究 表明，20（S）-Rg3 通過(guò)上調(diào)DR5 的表達(dá)來(lái)敏化TRAIL 誘導(dǎo) 的 肝 癌 細(xì) 胞 凋 亡，包 括HepG2、SK-Hep1、Huh-7 和Hep3B，但對(duì)正常肝細(xì)胞HL-7702 生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。在小鼠異種移植模型中，20（S）-Rg3 與TRAIL 聯(lián)用可通過(guò)凋亡途徑，顯著抑制Huh-7 細(xì)胞荷瘤裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，聯(lián)合應(yīng)用抑制TRAIL耐藥［35］。

2、GRg3與自噬的關(guān)系

一項(xiàng)研究表明，GRg3 通過(guò)ATG5 依賴性自噬途徑增加SK-Hep1 和HepG2 細(xì)胞LC3 II 蛋白水平。GRg3 抑制自噬晚期階段，導(dǎo)致自噬通量阻滯。阿霉素誘導(dǎo)的自噬具有促肝癌細(xì)胞生存作用，可引起肝癌細(xì)胞耐藥。體外研究發(fā)現(xiàn)，GRg3 與阿霉素聯(lián)用，可抑制自噬，克服化療耐藥性，增敏阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡。用小鼠異種移植模型也證實(shí)了GRg3 與 阿 霉 素 的 協(xié) 同 作 用［16］。Bian 等［36］研 究 發(fā) 現(xiàn)20（S）-Rg3 抑制饑餓狀態(tài)下的細(xì)胞自噬，使細(xì)胞無(wú)法通過(guò)自噬維持穩(wěn)定狀態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡。20（S）-GRg3阻斷自噬晚期的溶酶體融合和自噬溶酶體降解，使自噬和凋亡之間失去平衡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另一項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)20（S）-GRg 3 觸發(fā)HepG2 細(xì)胞自噬，觀察到自噬空泡及自噬溶酶體產(chǎn)生增加［8］。

3、GRg3抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、黏附

大量研究表明，GRg3 能顯著抑制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和黏附。作為Rho 信號(hào)負(fù)調(diào)控因子，Rho GTPase激活蛋白9（ARHGAP9）在肝癌中表達(dá)下調(diào)。研究表明，GRg3 能顯著降低肝癌細(xì)胞HepG2 和MHCC-97L 的侵襲和遷移能力，抑制HepG2和MHCC-97L在BABL∕c裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。經(jīng)GRg3 處理后，這兩種肝癌細(xì)胞中ARHGAP9 蛋白表達(dá)增加。ARHGAP9 基因敲除后，GRg3 的抗肝癌細(xì)胞侵襲、遷移和抗腫瘤生長(zhǎng)作用明顯受損，GRg3 誘導(dǎo)的ARHGAP9 蛋白表達(dá)增加明顯受到抑制。結(jié)果提示ARHGAP9 蛋白可能是GRg3 抗侵襲轉(zhuǎn)移作用的重要調(diào)節(jié) 因 子［12］。Mao 等［37］發(fā)現(xiàn)GRg3 能通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2∕MMP7∕MMP9、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）以及Wnt∕β-catenin 蛋白表達(dá)抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Liu 等［38］研究發(fā)現(xiàn)，20（S）-Rg3 上調(diào)脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白1，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1α 泛素蛋白酶體在正常氧水平下的降解，降低缺氧誘導(dǎo)因子1α 的表達(dá)，從而在體外和體內(nèi)發(fā)揮抑制癌細(xì)胞遷移作用。

4、GRg3抑制血管生成

將小鼠肝癌細(xì)胞Hep1-6植入小鼠肝臟，構(gòu)建肝原位癌模型，小鼠口服GRg3（10 mg∕kg，1 次∕d，連續(xù)30 d），通過(guò)CD105 染色血管計(jì)數(shù)測(cè)定腫瘤血管生成定量（MVD）。GRg3 組腫瘤血管MVD-CD105 陽(yáng)性染色明顯少于對(duì)照組［13］。另一肝癌大鼠模型結(jié)果顯示，GRg3聯(lián)合TAE 降低肝癌大鼠模型中血管生成及VEGF、CD31、VEGFR2 的表達(dá)［20］。在兔VX2 肝癌模型中，GRg3 聯(lián)合TAE 組表達(dá)的CD31 和VEGF 水平顯著降低。體外實(shí)驗(yàn)，GRg3 顯著下調(diào)HepG2 細(xì)胞VEGF 表達(dá)。結(jié)果表明，GRg3 聯(lián)合TAE 可通過(guò)抑制腫瘤血管生成而有效抑制腫瘤生長(zhǎng)［21］。大量研究表明，GRg3 通過(guò)抑制VEGF、VEGFR 表達(dá)劑量依賴性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞管型形成及微血管出芽［39］。

結(jié) 論

GRg3 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究及參一膠囊的臨床應(yīng)用均證明其有良好的抗肝癌活性。GRg3 抗肝癌的作用機(jī)制是多方面的，包括誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、調(diào)控自噬逆轉(zhuǎn)耐藥、抑制細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移、抑制血管生成等。但對(duì)GRg3抗肝癌的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，新的制劑形式也有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)以發(fā)揮抗肝癌作用，延長(zhǎng)晚期肝癌患者的生存期。