番木瓜轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展*

陳 燕，鄭 劍，余江敏，歐景莉，陳仕淼，何 江，黃雪梅，彭靖茹，朱楊帆，周俊岸，陳豪軍，潘祖建

（1 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，南寧530001）（2 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)）

番木瓜（Carica papayaL.）是番木瓜科番木瓜屬多年生草本果樹(shù)，在我國(guó)廣東、廣西、海南、福建、臺(tái)灣、云南等省區(qū)都有種植[1]。番木瓜果實(shí)可鮮食、可做菜，木瓜干絲可做成醬菜，木瓜蛋白酶可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、護(hù)膚品等行業(yè)，由于種植當(dāng)年可見(jiàn)收益，具有廣闊的發(fā)展前景。近年來(lái)，受花葉病、枯萎病等的影響，番木瓜產(chǎn)業(yè)遭遇瓶頸。通過(guò)組培技術(shù)培育健康種苗、了解番木瓜抗病機(jī)制、培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種對(duì)番木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

轉(zhuǎn)錄組廣義上是指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA 的集合，可以反映不同生理狀況、不同生命階段及環(huán)境條件下基因的表達(dá)情況[2]，目前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[3]。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)番木瓜進(jìn)行研究，可為了解抗逆抗病機(jī)制及選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種提供分子依據(jù)。本文對(duì)番木瓜在不同方面的轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)行總結(jié)和概況，以期對(duì)番木瓜的進(jìn)一步研究和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的應(yīng)用提供參考。

1 番木瓜組培的轉(zhuǎn)錄組研究

番木瓜的傳統(tǒng)育種方式為雜交育種，用實(shí)生苗進(jìn)行繁殖，有優(yōu)勢(shì)也有不利因素，優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)單易操作，易獲得變異植株，選育新品種，但是由于番木瓜植株根據(jù)性別可分為雌株、雄株、兩性株[4]，實(shí)生苗不能保證獲得性別一致的植株，只有兩性株具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如遇到數(shù)量較多的雄株，則會(huì)影響當(dāng)年收益[5]，且實(shí)生苗沒(méi)有進(jìn)行脫毒，容易被花葉病危害，造成減產(chǎn)減收[6]。組培苗相對(duì)于實(shí)生苗，單株價(jià)格較高，但也有其優(yōu)勢(shì)，可獲得株性一致、株型相同的植株，且繁殖速度快，不受季節(jié)影響，用莖尖培養(yǎng)可獲得無(wú)病毒植株，植株長(zhǎng)勢(shì)及果實(shí)品質(zhì)好，商業(yè)價(jià)值高。從1974 年首次報(bào)道用番木瓜葉柄作為外植體誘導(dǎo)，獲得愈傷組織，并培養(yǎng)出體細(xì)胞胚至今，國(guó)內(nèi)外番木瓜組培技術(shù)已日趨成熟[7-12]。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組研究分析探討組培過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制也隨之跟進(jìn)。Zhao 等[13]發(fā)現(xiàn)，CpLBD19和CpESR12 個(gè)基因在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上發(fā)生了突變，可作為番木瓜愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽形成的指標(biāo)。番木瓜胚性愈傷組織中表達(dá)的基因也被發(fā)現(xiàn)，如體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因有SERK和LEA、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑相關(guān)基因、應(yīng)激相關(guān)基因和次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑相關(guān)基因，在胚性愈傷組織中表達(dá)了NAC、WRKY、MYB、WUSCHEL、Agamous-like MADS-box蛋白和bHLH等重要的轉(zhuǎn)錄因子[14]。

一些不利于愈傷組織形成的條件和因素也得到了研究，如Jamaluddin 等[15]研究了DET1基因抑制對(duì)番木瓜胚性愈傷組織的影響，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與苯丙素類生物合成和應(yīng)激反應(yīng)、發(fā)育過(guò)程、脂質(zhì)代謝和對(duì)各種刺激的反應(yīng)。Zhou 等[16]發(fā)現(xiàn)，根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加瓊脂和吲哚-3-丁酸（IBA）莖接種外植體不定根的形成受到限制，差異基因參與了厭氧呼吸和活性氧（ROS）代謝途徑，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）活性和過(guò)氧化氫（H2O2）濃度升高。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究為揭示胚性愈傷組織誘導(dǎo)的早期生物學(xué)過(guò)程及建立高效的番木瓜離體繁殖生根體系提供了依據(jù)。

2 番木瓜性別分化的轉(zhuǎn)錄組研究

番木瓜株性、花性復(fù)雜，隨著溫度的變化，花性會(huì)有所改變，性別分化可能是由植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（尤其是脫落酸和生長(zhǎng)素）、脂類代謝途徑及光合作用等轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳生物過(guò)程共同調(diào)控[17-18]，miR394 可能是調(diào)控番木瓜性別的重要因子[19]，CpSVPL、CpSERK和CpCAF1AL為性別相關(guān)基因，且編碼區(qū)存在性別相關(guān)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）[20]，CpMS1基因在雄性和兩性花發(fā)育過(guò)程中高度上調(diào)[21]。Urasaki 等[22]發(fā)現(xiàn)性染色體上的大部分標(biāo)記位于X 染色體上，通常只有30 個(gè)標(biāo)記同時(shí)定位在X 和Yh 染色體上，在候選的Yh 染色體特異性雌性決定基因中篩選出1 個(gè)MADS-box基因。不同發(fā)育時(shí)期，雌性和兩性體細(xì)胞的差異表達(dá)基因不一致，同一性別胚胎發(fā)育過(guò)程中，基因表達(dá)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在心形胚階段和魚(yú)雷階段，胚胎發(fā)育候選基因?yàn)镃p49[23]。Zhou等[24]研究發(fā)現(xiàn)，雄性番木瓜在春季開(kāi)花較早，這一現(xiàn)象可能與CpSVP和CpAP1的轉(zhuǎn)錄變化及其基因特異性低甲基化有關(guān)。低溫誘導(dǎo)后，雄花出現(xiàn)性別逆轉(zhuǎn)，可能是由表觀沉默雌蕊抑制因子的表達(dá)造成，并通過(guò)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子及Small RNA 和組蛋白甲基化調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的[25-26]。

3 番木瓜逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄組研究

由于番木瓜商業(yè)品種表現(xiàn)出對(duì)干旱脅迫的敏感性，因此對(duì)番木瓜的逆境脅迫研究主要集中在干旱脅迫。Estrella-Maldonado 等[27]用轉(zhuǎn)錄組（RNA-Seq）方法分析易受水分虧缺和耐水分虧缺的番木瓜樣本，共有29 070 條序列被鑒定為代表番木瓜轉(zhuǎn)錄組的基因，為進(jìn)一步了解番木瓜克服水分虧缺脅迫的分子機(jī)制提供了有價(jià)值的信息來(lái)源。和干旱脅迫相關(guān)的一些基因也已找到，如CpHSF、CpMYB、CpN AC、CpNFY-A、CpERF、CpWRKY和CpDHN[28-29]。植株的不同部位在感受到不同的干旱程度時(shí)，表現(xiàn)出的反應(yīng)也不一致，在中度干旱脅迫下，葉片和汁液中與細(xì)胞周期和DNA 修復(fù)相關(guān)的過(guò)程均上調(diào)；而根系對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑信號(hào)傳導(dǎo)、蔗糖代謝和蘇木素合成均上調(diào)。在嚴(yán)重干旱脅迫下，所有組織中與非生物脅迫、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑信號(hào)和氧化還原相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程都被上調(diào)[30]。對(duì)干旱脅迫的研究，響應(yīng)干旱脅迫基因的發(fā)現(xiàn)有助于改良這一作物適應(yīng)干旱的能力。

4 番木瓜病害的轉(zhuǎn)錄組研究

番木瓜環(huán)斑花葉病（PRSV）、番木瓜畸形花葉病（PLDMV）是影響番木瓜生產(chǎn)的主要病害，轉(zhuǎn)基因方法及藥劑防治等是預(yù)防病害的有效途徑。通過(guò)對(duì)抗PRSV 轉(zhuǎn)基因番木瓜及感PRSV 番木瓜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，許多與轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)體和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑生物合成相關(guān)的差異表達(dá)基因（DEGs）在轉(zhuǎn)基因番木瓜中上調(diào)，逆境誘導(dǎo)和抗病基因如MYB、WRKY、ERF、NAC、硝酸鹽和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以及參與脫落酸、水楊酸和乙烯信號(hào)通路的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量高于非轉(zhuǎn)基因植株，研究結(jié)果為揭示轉(zhuǎn)基因番木瓜抗PRSV 的機(jī)制提供了基礎(chǔ)[31]。研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖N（CTS-N）誘導(dǎo)后，與抗病相關(guān)的WAKY基因及CML、CAML鈣調(diào)蛋白相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，IAA 生長(zhǎng)素基因誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，抗氧化酶等活性提高，增強(qiáng)了植株的抗性，可有效防控番木瓜環(huán)斑花葉病及番木瓜畸形花葉病[32-33]。鄢興祥[34]研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖10 g/L+寧南霉素0.05 g/L復(fù)配劑處理PRSV 侵染的番木瓜，病程相關(guān)蛋白（PR1）、乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子（ERF1）都上調(diào)表達(dá)，相關(guān)防御酶基因上調(diào)，次生代謝物得到激活，苯丙烷類、角質(zhì)、蠟等物質(zhì)合成，從而提高了植株的抗病能力。

一種由病毒侵染引起的只發(fā)生在開(kāi)花后的番木瓜遲發(fā)性黏?。≒SD），研究發(fā)現(xiàn)SA 信號(hào)參與了遲發(fā)性黏病的發(fā)生，開(kāi)花前，與逆境和運(yùn)輸相關(guān)的基因上調(diào)，與代謝相關(guān)的基因下調(diào)，其中一些水楊酸（SA）激活的基因得到了誘導(dǎo)，如PR1、PR2、PR5、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、ROS和胼胝質(zhì)基因，可抑制PSD 的發(fā)生，但是開(kāi)花后，SA 信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子：NPR1-抑制劑（NPR1-I/NIM1-I）候選基因、編碼UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）的基因以及幾個(gè)與乙烯途徑有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄本的誘導(dǎo)卻阻礙了植株的耐受性，從而引起PSD 的發(fā)生[35]。

由歐文氏菌引起的番木瓜枯萎病致病機(jī)制也有報(bào)道[36]。3 條關(guān)鍵通路次生代謝產(chǎn)物的生物合成、微生物在不同環(huán)境中的代謝以及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了歐文氏菌的致病過(guò)程。歐文氏菌侵染早期的生物過(guò)程為對(duì)刺激的響應(yīng)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、裂解酶活性和結(jié)構(gòu)分子活性。Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）蛋白家族成員在歐文氏菌致病機(jī)制的啟動(dòng)中具有重要作用。

對(duì)病害的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究可以更好地了解致病機(jī)制，從而為病害的防治以及選育抗病品種提供依據(jù)。

5 番木瓜成熟機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組研究

番木瓜果實(shí)的成熟是一個(gè)類胡蘿卜素積累、肉色和風(fēng)味改變、果實(shí)軟化的復(fù)雜過(guò)程，與氨基酸、碳水化合物、脂類以及核苷酸等的代謝相關(guān)[37]，CpACO4、CpPDS、CpXTH30和CpXTH31等4 個(gè)番木瓜果實(shí)成熟差異表達(dá)候選基因可能在番木瓜果實(shí)成熟過(guò)程中起重要作用[38]。MADS-box、NAC和AP2/ERF基因家族的轉(zhuǎn)錄因子（TFs）參與了番木瓜成熟的調(diào)控[39]，果實(shí)發(fā)育和成熟顯著誘導(dǎo)CpARF2表達(dá)[40]。其中XTH30、GLUB41、PL、PMIS、CPSP、CHLM、MYB類轉(zhuǎn)錄因子可能參與了果實(shí)成熟衰老進(jìn)程[41-42]。

TF 家族成員通過(guò)參與光信號(hào)調(diào)控，進(jìn)而參與調(diào)控類胡蘿卜素基因的表達(dá)，CpbHLH1和CpbHLH2單獨(dú)調(diào)控番茄紅素β-環(huán)化酶基因（CpCYC-B和CpLCY-B）的轉(zhuǎn)錄[43-44]。CpNAC2和CpEIN3a相互作用，激活類胡蘿卜素合成相關(guān)基因CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b的表達(dá)，進(jìn)而參與后熟過(guò)程中類胡蘿卜素合成[45]。馮力[42]發(fā)現(xiàn)3 個(gè)葉綠素和類胡蘿卜素代謝途徑基因CHY-B、CHLM、FER1。外源乙烯加速了番木瓜由綠色向黃色的著色，Chy-b可能在番木瓜果實(shí)的著色中起重要作用[46-47]。ABIL46-like和NCED3基因表達(dá)和果實(shí)轉(zhuǎn)色有關(guān)[48]。miR4993-x、miR815-y 和miR7810-x 等miRNA 和果實(shí)顏色調(diào)控相關(guān)[49]。

番木瓜果實(shí)軟化過(guò)程復(fù)雜，有明顯的細(xì)胞壁水解酶，如果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等參與該過(guò)程[46]，乙烯觸發(fā)是引起番木瓜果肉快速軟化的主要事件，乙烯處理后ACO、ACS和SAM-Mtase基因均上調(diào)[47]。其中PYL4-like、PYL9、ABIL2-like、GT、CpEXPA2、XTH30、GLU-B、PL、EGase、EXPA、PMIS等基因表達(dá)參與果實(shí)成熟軟化[42,48,50-51]。miR167-y、miR4993-x、miR3946-x 和miR5059-x等miRNA 和果實(shí)軟化調(diào)控相關(guān)[49]。

1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）可以有效抑制乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而達(dá)到保鮮，延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期。但是過(guò)高的處理濃度會(huì)導(dǎo)致番木瓜果實(shí)“橡皮化”，喪失商品價(jià)值。郭子娟[52]和李文文[53]研究發(fā)現(xiàn)，高于0.3 μL/L 或者1.0 μL/L 的1-MCP 處理番木瓜果實(shí)35 d后，番木瓜果實(shí)出現(xiàn)“橡皮化”，可能與內(nèi)切葡聚糖酶活性、內(nèi)切木聚糖酶、β-半乳糖苷酶的活性較低、基因的轉(zhuǎn)錄水平也較低，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性得到維持、細(xì)胞壁得不到降解，endo-1,4-Xyl、endo-1,3-Glu和β-Gal等基因的表達(dá)水平受到抑制有關(guān)。長(zhǎng)期1-MCP 處理嚴(yán)重改變了果實(shí)成熟過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，降低了三羧酸循環(huán)的各種能量代謝物，其中以乙二醇酸循環(huán)影響最為顯著，苯丙烷途徑也受到影響，加速了果實(shí)成熟過(guò)程中木質(zhì)素積累，延緩了纖維素降解，可推斷細(xì)胞壁代謝和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑信號(hào)通路與番木瓜果實(shí)成熟障礙密切相關(guān)。Cai 等[54]繪制了果實(shí)成熟過(guò)程中miRNA 和靶基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，發(fā)現(xiàn)果實(shí)成熟過(guò)程中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑信號(hào)通路起重要作用，cpa-miR390a和cpa-miR396分別靶向CpARF19-like和CpERF RAP2-12-like，影響乙烯和生長(zhǎng)素信號(hào)通路，進(jìn)而影響番木瓜成熟[55-56]。

6 展望

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)深入了解番木瓜組培、性別分化、抗逆、抗病、成熟機(jī)制有至關(guān)重要的作用，掌握這些理論知識(shí)，有助于我們培育抗逆、抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的番木瓜品種，采后更好地貯藏、保鮮，延長(zhǎng)貨架期。通過(guò)分析當(dāng)前轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在番木瓜上的應(yīng)用研究現(xiàn)狀，結(jié)合國(guó)內(nèi)外植物領(lǐng)域轉(zhuǎn)錄組的研究熱點(diǎn)，提出3 點(diǎn)建議，以期為番木瓜轉(zhuǎn)錄組的研究和應(yīng)用提供新的思路。

一是加強(qiáng)番木瓜轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等多組學(xué)技術(shù)結(jié)合的研究。目前多組學(xué)技術(shù)結(jié)合對(duì)植物的研究已經(jīng)有了很多的應(yīng)用。曾建斌[57]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組學(xué)技術(shù)揭示了野生大麥耐低鉀的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在低鉀環(huán)境下，耐低鉀大麥通過(guò)提高脯氨酸和抗壞血酸等活性氧自由基清除劑的含量來(lái)提高抗氧化脅迫能力，苯丙氨酸解氨酶（PAL）介導(dǎo)的苯丙烷類次生代謝途徑和乙烯響應(yīng)代謝通路可用來(lái)解釋低鉀耐性基因型差異的分子機(jī)制。周會(huì)娜等[58]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)研究了選自3 個(gè)不同香煙區(qū)的中部煙葉葉片，了解煙草代謝網(wǎng)絡(luò)，影響煙葉香型的代謝產(chǎn)物以及與目標(biāo)代謝物相關(guān)的基因。在番木瓜研究上，應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究的報(bào)道相對(duì)較少。Zheng 等[55]通過(guò)代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)合分析1-MCP 處理不當(dāng)導(dǎo)致的成熟障礙機(jī)制，發(fā)現(xiàn)1-MCP 長(zhǎng)期處理后，三羧酸循環(huán)的各種能量代謝產(chǎn)物減少，尤其是乙醇酸循環(huán)和苯基丙烷途徑受影響最大。Agopian 等[59]運(yùn)用蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)分析了乙烯對(duì)番木瓜采后品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)極性代謝物在刺激成熟過(guò)程中表現(xiàn)出不同的模式，膜破裂和氧化過(guò)程的變化可能是揮發(fā)性化合物產(chǎn)生的原因，改變了番木瓜的一些感官品質(zhì)，可將γ-氨基丁酸水平作為番木瓜發(fā)育和成熟階段一個(gè)強(qiáng)有力的生物學(xué)標(biāo)記。多組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，能夠進(jìn)行更準(zhǔn)確、更快速的基因功能研究和挖掘，加快高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)番木瓜品種的選育進(jìn)程，促進(jìn)番木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

二是加強(qiáng)對(duì)番木瓜蛋白酶表達(dá)起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因的挖掘。番木瓜不但營(yíng)養(yǎng)豐富，番木瓜蛋白酶在食品工業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，目前我國(guó)的番木瓜蛋白酶需求量極大，選育高漿番木瓜品種，提高番木瓜漿產(chǎn)量，具有廣闊的應(yīng)用前景。分析番木瓜蛋白酶形成的分子機(jī)制，可為選育高漿品種提供參考和理論依據(jù)。

三是探索第三代測(cè)序技術(shù)在番木瓜上的應(yīng)用。第三代測(cè)序技術(shù)有讀長(zhǎng)更長(zhǎng)、不需要拼接、能有效避免拼接錯(cuò)誤等特點(diǎn)[60]，已成功應(yīng)用于人類造血組細(xì)胞中的巨核細(xì)胞，及一些蘑菇狀真菌種類的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[61-62]，尚未見(jiàn)相關(guān)技術(shù)在番木瓜上的應(yīng)用。因此，在今后的研究中，應(yīng)結(jié)合更先進(jìn)的技術(shù)和手段，定位高漿、抗病等功能基因并進(jìn)行新品種的選育，加快育種進(jìn)程，更好地促進(jìn)番木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。