活性氧響應(yīng)海藻酸鈉/聚乙烯醇水凝膠敷料的制備及性能

芮金州，彭虎紅，關(guān)怡新，姚善涇

浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310027

傷口敷料可覆蓋傷口部位，并作為臨時屏障防止外部感染，是治療傷口的常用方法。理想的傷口敷料一般具有機(jī)械強(qiáng)度適中、可保持創(chuàng)面濕潤、能夠防止細(xì)菌感染并緩解患者疼痛等特點(diǎn)。目前主要的傷口敷料包括紗布、薄膜、水膠體和水凝膠敷料等[1-2]。水凝膠敷料具有質(zhì)地柔軟、可保持創(chuàng)面濕潤以及生物相容性較好等優(yōu)點(diǎn)[3]，且負(fù)載活性藥物的環(huán)境響應(yīng)性水凝膠敷料可實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放，提高藥物療效，從而防止感染并消除炎癥反應(yīng)，促進(jìn)傷口愈合。

海藻酸鈉（Alg）是一種陰離子線性多糖，其生物相容性和黏附性較好，是制備傷口敷料常用的材料之一[4]。聚乙烯醇（PVA）是一種可生物降解的半結(jié)晶合成聚合物，具有較高的親水性、良好的機(jī)械性能和生物相容性[5]。Kim 等[6]報道了一種負(fù)載呋喃西林的Alg/PVA 水凝膠，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該水凝膠可顯著提高傷口愈合率。Hu 等[7]利用苯硼酸接枝的Alg 制備負(fù)載阿米卡星和萘普生的可注射納米復(fù)合水凝膠，該水凝膠能有效抑制細(xì)菌生長、降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加速傷口恢復(fù)。水凝膠的制備方法和藥物的負(fù)載過程決定了聚合物分子鏈的交聯(lián)形式，從而在一定程度上影響水凝膠的理化性質(zhì)，包括拉伸強(qiáng)度、剛性、氣體透過性和結(jié)構(gòu)自愈性能等[8]。超臨界溶液浸漬（SSI）技術(shù)是利用超臨界CO2將小分子物質(zhì)負(fù)載到載體中的一種技術(shù)。該技術(shù)不會改變聚合物基質(zhì)的形狀且操作條件溫和，在載藥系統(tǒng)的制備中具有良好的應(yīng)用前景[9-10]。

本研究通過3-氨基苯硼酸（PBA）接枝的Alg（Alg-PBA）和PVA 交聯(lián)制備活性氧（ROS）響應(yīng)水凝膠。其中苯硼酸是一類路易斯酸，酸度系數(shù)（pKa）為7.8～8.6，其離子化后可與含順式二醇結(jié)構(gòu)的分子發(fā)生反應(yīng)形成動態(tài)硼酸酯鍵，得到親水性更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)[11-12]。然后利用SSI 技術(shù)將鹽酸多西環(huán)素（Doxy）負(fù)載到水凝膠中，重點(diǎn)考察各組分質(zhì)量比和PVA 分子量對水凝膠形貌結(jié)構(gòu)及流變行為的影響，并對水凝膠進(jìn)行表征，探討水凝膠的形成機(jī)理，為水凝膠傷口敷料的開發(fā)提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

分子量為30～50 kDa 的Alg 購于上海麥克林生化科技有限公司，分子量為22 kDa 和77 kDa 的PVA（純度99%，醇解度88%）分別從上海源葉生物科技有限公司和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司購買。碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）購于杭州曉柚生物科技有限公司，Doxy 和3-氨基苯硼酸一水合物購于阿拉丁試劑有限公司。食品級CO2由杭州今工特種氣體有限公司提供，純度大于99%。截留分子量為8～14 kDa 的透析袋購于南通飛宇生物科技有限公司。其余試劑均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Alg-PBA 的制備及表征

稱取1.0 g的海藻酸鈉和0.39 g的3-氨基苯硼酸一水合物溶于100 mL去離子水中，隨后加入0.96 g的EDC·HCl?；旌先芤涸谑覝叵聰嚢?4 h，反應(yīng)完成后用截留分子量為8～14 kDa 的透析袋透析3 d，冷凍干燥得到Alg-PBA。

利用核磁共振波譜儀（NMR，德國Bruker 公司500 MHz）對樣品（PBA，Alg，Alg-PBA）進(jìn)行表征，得到相應(yīng)氫譜（1HNMR），然后計算接枝率。同時通過傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，美國熱電公司Nicolet 5700）分析修飾前后Alg 樣品的結(jié)構(gòu)變化，采用壓片法（將1 mg 左右樣品與100 mg KBr 混合后充分研磨并壓成薄片），在4 000～400 cm-1波數(shù)內(nèi)掃描256 次。

1.2.2 Alg-PBA/PVA 水凝膠的制備及表征

將Alg-PBA 及PVA 配制成一定濃度的水溶液，然后按比例直接將兩種溶液混合，并向混合溶液中加入一定體積濃度為0.5 mol/L 的NaOH 溶液（NaOH 溶液與混合溶液體積比為1:10）?；旌暇鶆蚝箪o置數(shù)分鐘即形成水凝膠。

通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，日本Hitachi 公司SU-8010）觀察Alg-PBA/PVA 水凝膠的形貌和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)：將冷凍干燥后的水凝膠在液氮中淬斷，然后截面向上固定于樣品臺上，噴金后放入電子掃描顯微鏡在20 kV 加速電壓下觀察水凝膠斷面形貌。

通過旋轉(zhuǎn)流變儀（德國Haake Technik GmbH 公司MARS 60）對Alg-PBA/PVA 水凝膠的流變學(xué)行為進(jìn)行表征：取一定體積的水凝膠制成直徑約為20 mm，厚約為2 mm 的圓片，將圓片置于旋轉(zhuǎn)流變儀樣品臺上，設(shè)置溫度為37 ℃進(jìn)行應(yīng)變掃描和頻率掃描。其中應(yīng)變掃描固定頻率為1 Hz，應(yīng)變量為0.1%～100%；頻率掃描的應(yīng)變量為1%，掃描頻率為0.1～100 rad/s。此外，對水凝膠的回復(fù)性進(jìn)行測定，設(shè)置較小的應(yīng)變?yōu)?%，持續(xù)60 s，較大的應(yīng)變?yōu)?50%，持續(xù)120 s，循環(huán)2 次。

1.2.3 SSI 技術(shù)制備負(fù)載Doxy 的水凝膠（Doxy@Alg-PBA/PVA）

SSI 技術(shù)流程詳見文獻(xiàn)[13]。首先將過量Doxy 用濾紙包裹并置于高壓釜底部，將Alg-PBA/PVA 水凝膠置于釜體中間的平臺上，藥物與水凝膠不發(fā)生直接接觸。開啟低溫槽和加熱器，并設(shè)定操作溫度，達(dá)到預(yù)設(shè)溫度后打開CO2鋼瓶，CO2經(jīng)低溫槽冷卻為液態(tài)，由高壓泵輸送經(jīng)過加熱器，達(dá)到超臨界狀態(tài)，與共溶劑混合后進(jìn)入到高壓釜中。調(diào)節(jié)高壓釜的溫度和壓力，并打開攪拌器（轉(zhuǎn)速為60 r/min），待達(dá)到預(yù)設(shè)條件后開始計時，實(shí)驗(yàn)結(jié)束關(guān)閉高壓泵和CO2鋼瓶，同時開啟高壓閥快速泄壓，取出Doxy@Alg-PBA/PVA 水凝膠樣品。

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的Doxy@Alg-PBA/PVA 水凝膠，加入10 mL 去離子水并充分?jǐn)嚢枋箻悠吠耆芙猓S后將樣品溶液在11 000 r/min 下離心，上清液用紫外可見分光光度計（日本Shimadzu 公司UV-1800）測定其在272 nm 處的吸光度，計算得到Doxy 的量。

1.2.4 Doxy@Alg-PBA/PVA 的體外藥物釋放行為

分別以含H2O2（10 mmol/L）和不含H2O2的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 為7.4）為介質(zhì)進(jìn)行體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)。稱取一定質(zhì)量的水凝膠置于透析袋中，向透析袋內(nèi)加入1 mL 釋放介質(zhì)，并將透析袋放入9 mL 釋放介質(zhì)中。釋放體系置于水浴搖床，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。定時取透析袋外釋放介質(zhì)1 mL 樣品，用紫外可見分光光度計測定樣品的吸光度，得到Doxy 的量，同時向釋放體系中補(bǔ)充1 mL 新鮮釋放介質(zhì)，保持釋放介質(zhì)體積不變。

2 結(jié)果與討論

2.1 Alg-PBA 的合成及結(jié)構(gòu)

Alg-PBA 的合成是以EDC·HCl 作為偶聯(lián)劑，通過酰胺鍵將PBA 接枝到海藻酸鈉主鏈上，合成式如圖1 所示。接枝反應(yīng)前后樣品的1HNMR 圖譜和FT-IR 圖譜見圖2。

圖1 Alg-PBA 的合成式Fig.1 Synthesis formula of Alg-PBA

圖2 樣品的1HNMR 圖譜（a）和FT-IR 圖譜（b）Fig.2 1HNMR spectrum (a) and FT-IR spectrum (b) of samples

從圖2（a）可以看出，樣品Alg-PBA 在化學(xué)位移（δ）為4 ppm 附近出現(xiàn)了海藻酸鈉中氫原子的特征峰，在δ為7.4～7.7 ppm 出現(xiàn)的苯環(huán)上質(zhì)子峰表明PBA 成功地接枝到了Alg 上，經(jīng)計算得Alg-PBA的接枝率為57%。由圖2（b）可知，1 410 cm-1和1 300 cm-1處的峰通常是吡喃糖環(huán)的O—C—O 對稱振動以及C—C—H 和O—C—H 形變。B—O 伸縮振動通常出現(xiàn)在1 350 cm-1和1 300 cm-1附近，導(dǎo)致譜圖中吡喃糖環(huán)的峰略微變寬[14]，另外，在711 cm-1處觀察到了芳香烴C—H 平面彎曲振動的峰。以上結(jié)果表明PBA 成功修飾了Alg 分子，并且對Alg 的分子結(jié)構(gòu)沒有造成影響。

2.2 Alg-PBA/PVA 水凝膠的形成機(jī)理以及形貌和流變行為

苯硼酸在水溶液中可以以兩種形式存在，一種是中性不帶電形式，另一種是與OH-絡(luò)合，以羥基硼酸根離子的形式存在，一般帶電的硼酸更容易與二醇反應(yīng)[15]。圖3 所示為Alg-PBA/PVA 水凝膠的形成過程，當(dāng)溶液的pH 高于PBA 的pKa 時，OH-與硼酸基團(tuán)結(jié)合形成羥基硼酸根離子，進(jìn)而與PVA分子中的1,2 和1,3 二醇結(jié)構(gòu)反應(yīng)形成硼酸酯。

圖3 Alg-PBA/PVA 水凝膠的形成機(jī)理Fig.3 Formation mechanism of Alg-PBA/PVA hydrogels

在水凝膠的形成過程中，活性基團(tuán)會優(yōu)先進(jìn)行反應(yīng)構(gòu)建微凝膠，隨著交聯(lián)過程的進(jìn)行，大量微凝膠“海島”利用自身的交聯(lián)活性基團(tuán)互相連接，從而形成完整的水凝膠[16-17]。微凝膠的交聯(lián)密度比凝膠整體的平均交聯(lián)密度大，并且在凝膠形成過程中會產(chǎn)生一些懸掛鏈、纏結(jié)鏈和環(huán)鏈，因此可能導(dǎo)致水凝膠產(chǎn)生非均勻結(jié)構(gòu)，從而影響水凝膠的形貌結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能。本工作重點(diǎn)研究了Alg-PBA/PVA水凝膠組分對其形貌和流變行為的影響，水凝膠的制備參數(shù)如表1 所示。

表1 不同Alg-PBA/PVA 水凝膠的制備參數(shù)Table 1 Preparation parameters of different Alg-PBA/PVA hydrogels

2.2.1 Alg-PBA 與PVA 質(zhì)量比（R）對Alg-PBA/PVA 水凝膠的影響

圖4 為不同Alg-PBA 含量的Alg-PBA/PVA 水凝膠樣品的流變行為曲線。從圖4（a）所示的應(yīng)變掃描結(jié)果可以看出，隨著Alg-PBA 含量減小，即當(dāng)R從6:1 減小到2:1 時，水凝膠的儲能模量（G'）和損耗模量（G"）均顯著增大；之后當(dāng)R繼續(xù)減小到1:1 后，G'和G"變化不大。此外，水凝膠的損耗模量均大于儲能模量，表明此時樣品未形成凝膠，而以溶膠的狀態(tài)存在。此外，由圖4（b）所示的頻率掃描結(jié)果可以看出，角頻率（ω）較低時（0.1～10 rad/s）G"＞G'，此時樣品表現(xiàn)出類似液體的行為，隨著角頻率增大，G'和G"出現(xiàn)交點(diǎn)，樣品變?yōu)轭惞腆w狀態(tài)[18]。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是Alg-PBA 含量較高時，與PVA 交聯(lián)的Alg-PBA 分子較少，而由于PVA 分子中二醇結(jié)構(gòu)幾乎已完全參與反應(yīng)，導(dǎo)致微凝膠“海島”無法通過自身的活性基團(tuán)進(jìn)一步連接形成完整的水凝膠。Alg-PBA 含量下降，Alg-PBA 分子與更多的PVA 發(fā)生反應(yīng)，交聯(lián)密度增加，模量增大。頻率掃描實(shí)驗(yàn)中，低頻條件下聚合物分子鏈可隨應(yīng)力變化而緩慢運(yùn)動，分子間摩擦導(dǎo)致能量損耗。隨著角頻率增大，聚合物分子鏈運(yùn)動明顯滯后于應(yīng)力變化，分子鏈發(fā)生纏結(jié)，并且由于氫鍵等相互作用使G'與G"逐漸接近而出現(xiàn)交點(diǎn)。

圖4 不同Alg-PBA 與PVA 質(zhì)量比制備的Alg-PBA/PVA 水凝膠的流變行為Fig.4 Rheological behaviors of Alg-PBA/PVA hydrogels prepared with different mass ratios of Alg-PBA to PVA

通過SEM 對Alg-PBA/PVA 水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖5 所示。從圖5 可知，Alg-PBA含量較高時，樣品形成了均勻多孔結(jié)構(gòu)，內(nèi)部孔隙之間相互聯(lián)通，且具有一定的取向性。隨著Alg-PBA含量減少，出現(xiàn)了相對平滑無孔的結(jié)構(gòu)，見圖5（c），這可能是由于Alg-PBA 和PVA 在均一性、親水性等方面性質(zhì)的差異，使得溶液混合時PVA 形成無序結(jié)晶所致。

圖5 不同Alg-PBA 與PVA 質(zhì)量比制備的Alg-PBA/PVA 水凝膠的SEM 照片F(xiàn)ig.5 SEM images of Alg-PBA/PVA hydrogels prepared with different mass ratios of Alg-PBA to PVA

2.2.2 PVA 分子量對Alg-PBA/PVA 水凝膠的影響

PVA 的分子量與其聚合度有關(guān)，聚合度越高分子鏈段越長，則PVA 分子所含的順式二醇結(jié)構(gòu)越豐富。以分子量為77 kDa 的PVA 在Alg-PBA 與PVA 質(zhì)量比為2:1 和1:1 的條件下制備水凝膠，并對其流變行為進(jìn)行表征，結(jié)果見圖6。從圖6（a）可知較高分子量PVA 與Alg-PBA 交聯(lián)形成的水凝膠模量更高，并且在測試范圍內(nèi)G'＞G"，樣品為穩(wěn)定的水凝膠。這是由于高分子量PVA 的分子鏈更長，與Alg-PBA 的交聯(lián)密度更高，聚合物分子鏈的相對滑動和變形受到更多的限制，從而表現(xiàn)出類似固體凝膠的性質(zhì)，同時，這也是導(dǎo)致圖6（b）中G'和G"表現(xiàn)出明顯頻率依賴性的原因[19]。水凝膠在較低頻率下受到應(yīng)力，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中纏結(jié)的分子鏈可充分進(jìn)行運(yùn)動和變形，凝膠G"值較大。而頻率較高時，分子鏈來不及松弛，G'增大。

圖6 不同分子量PVA 制備Alg-PBA/PVA 水凝膠的流變行為Fig.6 Rheological behaviors of Alg-PBA/PVA hydrogels prepared by PVA with different molecular weights

圖7 為高分子量PVA 制備水凝膠的SEM 圖像，水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較致密，這是由于PVA 分子量增加，水凝膠交聯(lián)密度增大所致。高分子量PVA 溶液的黏度較大，可能影響混合溶液的均一性，形成不均勻的交聯(lián)點(diǎn)，導(dǎo)致水凝膠孔隙分布的均勻性稍差。此外，圖7（b）中出現(xiàn)的封閉結(jié)構(gòu)可能是由PVA 與Alg-PBA 混合時部分PVA 分子鏈纏結(jié)造成的。Alg-PBA 與PVA 質(zhì)量比為2:1 時高分子量PVA 制備的水凝膠機(jī)械性能良好，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)完整，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中主要采用此種水凝膠進(jìn)行研究。

圖7 高分子量PVA 制備Alg-PBA/PVA 水凝膠的SEM 照片F(xiàn)ig.7 SEM images of Alg-PBA/PVA hydrogels prepared by PVA with high molecular weight

2.3 Doxy@Alg-PBA/PVA 載藥水凝膠的制備及體外藥物釋放性能

利用 SSI 技術(shù)在 35 ℃和 20 MPa 條件下制備了 Doxy@Alg-PBA/PVA 水凝膠，計算得Doxy@Alg-PBA/PVA 水凝膠的載藥量為10.6 mg/g。SSI 過程中，藥物Doxy 被CO2攜帶進(jìn)入水凝膠，CO2對聚合物的溶脹和塑化作用可促進(jìn)藥物的負(fù)載過程，并使藥物在水凝膠中的分布更加均勻。同時，水凝膠中的動態(tài)硼酸酯鍵使聚合物分子鏈保持了較好的運(yùn)動性，CO2與聚合物的相互作用增強(qiáng)；水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有利于CO2的吸附和擴(kuò)散，從而進(jìn)一步促進(jìn)藥物在水凝膠中的負(fù)載。此外，浸漬后水凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)仍保持完整并且具有良好的自愈性能。

圖8 為Doxy@Alg-PBA/PVA 水凝膠在不同釋放介質(zhì)中的體外藥物釋放情況。根據(jù)圖8 結(jié)果可知，水凝膠具有良好的ROS 響應(yīng)性。釋放介質(zhì)中不含H2O2時，藥物累積釋放量較低，僅為18.2%±1.0%（Doxy@Alg-PBA/PVA-PBS）；加入H2O2后，水凝膠藥物累積釋放量顯著提高，達(dá) 82.0%±6.5%（Doxy@Alg-PBA/PVA-H2O2）。水凝膠具有ROS 響應(yīng)性主要是由于環(huán)境中存在的H2O2與硼原子配位后B—C 鍵被氧化生成苯酚，硼酸酯鍵斷裂，從而破壞水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了藥物擴(kuò)散釋放。

圖8 水凝膠的體外藥物釋放曲線Fig.8 In vitro drug release profiles of hydrogels

3 結(jié) 論

本研究通過將PBA 修飾的Alg 與PVA 交聯(lián)制備水凝膠，并利用SSI 技術(shù)將Doxy 負(fù)載到水凝膠基質(zhì)中。水凝膠形成了致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其交聯(lián)密度隨PVA 含量的提高而增加，使得體系中懸掛鏈和纏結(jié)鏈減少，Alg-PBA/PVA 水凝膠的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度隨之增大，機(jī)械性能得到改善。分子量較高的PVA 分子鏈更長，微凝膠之間有效交聯(lián)點(diǎn)的數(shù)量增加，可與Alg-PBA 交聯(lián)得到性質(zhì)良好的水凝膠。同時，通過SSI 技術(shù)可成功將Doxy 負(fù)載到水凝膠中，并且載藥水凝膠具有良好的ROS 響應(yīng)性，為其在傷口敷料中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。